CN112578029A - 清肺汤制剂hplc质量控制构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法及其应用，该方法包括以绿原酸、苦杏仁苷、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲中至少一种为有效成分，并用所述有效成分进行HPLC含量测定和HPLC指纹图谱构建中的至少一个过程。本发明利用HPLC质量控制构建方法对国内外已上市的清肺汤产品进行检测并评价，用以控制清肺汤市售制剂的质量，区分清肺汤市售制剂的来源，确保清肺汤市售制剂的临床疗效；该HPLC质量控制构建方法可实现对清肺汤制剂的质量监控，为保证清肺汤用药安全、稳定和质量可控提供参考依据，促进中医药的继承和发展。

Description

清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及清肺汤有效成分检测技术领域，具体涉及清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法及其在市售清肺汤制剂质量控制方向的应用。

背景技术

中医药事业是我国医药卫生事业的重要组成部分，来源于古代经典名方的中药复方制剂开发是中医药事业发展的重要组成部分。

2007年10月1日实施的《药品注册管理办法》与2008年1月7日实施的《中药注册管理补充规定》中明确了“来源于古代经典名方的中药复方制剂是指目前仍广泛应用、疗效确切、具有明显特色与优势的清代及清代以前医籍所记载的方剂”。这为古代经典名方的中药复方制剂开发奠定了基础。

2017年7月1日实施的《中华人民共和国中医药法》在第三十条中指出“生产符合国家规定条件的来源于古代经典名方的中药复方制剂，在申请药品批准文号时，可以仅提供非临床安全性研究资料。”这为继承和弘扬中医药文化，保障和促进中医药事业发展，保护人民健康提供了法律支持与保障。

2019年3月27日发布的《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求(征求意见稿)》中要求“在经典名方物质基准及经典名方制剂的质量要求方面，原则上应在含量测定或指纹图谱等项目中体现处方各药味的信息”。这为古代经典名方的中药复方制剂的开发研究提供了可以参考的指导原则与质量标准。

清肺汤是传统中医临床经典名方，对气管、肺部、空气、烟等引起的咳嗽痰多、咯痰有很好的疗效，具有清肺功效。清肺汤目前仍广泛应用、疗效确切、具有明显的中医药特色与优势。清肺汤来源于明朝著名医家龚廷贤所著的《万病回春·(咳嗽门)》，由黄芩、桔梗、茯苓、陈皮、贝母、桑白皮、当归、天门冬、山栀、苦杏仁、麦门冬、五味子、甘草、生姜、大枣共15味中药组成。清肺汤具有清肺化痰止咳的功效，辨证要点为咳嗽剧烈、痰多、痰多难尽、痰尽咳止。临床用于治疗咳嗽多痰、慢性支气管炎、支气管扩张症、肺炎、支气管炎、肺结核、慢性咽头炎、支气管喘息、心脏性喘息。

清肺汤汤剂具有制备简单、疗效确切、起效迅速、生物利用度高等优点，临床应用较多，但对其进行质量控制研究的文献及资料等几乎没有。清肺汤处方含有15味药材，主要用于清肺化痰止咳。对各药材的主要活性成分进行分析，黄芩中黄芩苷具有抗过敏、解热(肺热咳嗽)、抗炎、清除自由基及抗氧化、抗溃疡、调节免疫、抗抑郁等药理活性。桔梗中桔梗皂苷D具有祛痰作用。桑白皮黄酮类，如绿原酸，具有止咳、平喘、祛痰、利尿、解痉、镇痛、耐缺氧等作用。当归、陈皮中的阿魏酸具有抗氧化和自由基清除作用、抗降血脂和改善动脉粥样硬化作用、抗菌、抗病毒作用、调节免疫、抗炎、镇痛等作用。甘草中的甘草酸、甘草次酸及甘草的黄酮类化合物具有镇咳，祛痰，平喘的作用。五味子中五味子醇甲具有抑制中枢神经系统，有镇静、催眠、宁神安定以及抗氧化作用。因此在清肺汤复方制剂的开发过程中应遵循《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求(征求意见稿)》的指导原则，尽可能地全面表征清肺汤中全部药味信息以控制其质量。

清肺汤是《万病回春》所记载的主治咳嗽的处方，原文描述：主治一切咳嗽，上焦痰甚。至今在国内外临床应用：除医院医师开出的处方汤剂以外，目前已经有清肺汤中成药的上市。上市的药品主要有中国台湾仙丰清肺汤浓缩散，顺天堂清肺汤浓缩颗粒，港香兰清肺汤浓缩颗粒，港香兰清肺汤浓缩锭，日本小林制药清肺汤颗粒以及津村汉方制剂清肺汤颗粒等。然而，与这些制剂相关的质量控制研究(含量测定或指纹图谱)相对匮乏，至今没有相关报道或文献资料供参考。而且原文《万病回春》以及清肺汤相关资料均无对清肺汤处方汤剂制法的记录，对于原文：“上剉”一词的解析，清肺汤煮散的粒度没有明确的记载；再加之清肺汤处方药味多，成分复杂，且极性相似的成分很难分离，故而很难对其化学成分进行分离。综上，制定出一份能够对这些制剂进行有效的质量检测与指导的方案很有必要。从医师处方到OTC的产生，清肺汤的应用越来越广泛，因此如何实现对清肺汤制剂的质量监控，保证清肺汤制剂的安全性、稳定性和有效性必然是越来越重要的环节。

发明内容

本发明的目的是提供清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法及其在市售清肺汤制剂质量控制方向的应用，用以控制清肺汤市售制剂的质量，区分市售清肺汤制剂，确保清肺汤市售制剂的临床疗效。

清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法，包括以绿原酸、苦杏仁苷、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲中至少一种为有效成分，并用所述有效成分进行HPLC含量测定和HPLC指纹图谱构建中的至少一个过程。

进一步，HPLC的色谱条件为：使用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，梯度洗脱，流动相A为乙腈，B为0.05％-0.2％磷酸水，检测波长为200-360nm，流速 0.3-0.9mL/min；柱温25-40℃；进样体积5-20μL。

优选地，HPLC的色谱条件为：色谱柱为Agilent Technologies COLUMN TYPE:ZORBAX SB-C18(3.5μm×4.6mm×250mm)；流动相A为乙腈，B为0.1％磷酸水，流速 0.6mL/min；柱温30℃；进样体积10μL。

进一步，绿原酸在32-33min出峰、苦杏仁苷在36-37min出峰、栀子苷在42-43min出峰、橙皮苷在86-87min出峰、黄芩苷在103-104min出峰、汉黄芩苷在129-130min出峰、甘草酸铵在156-157min出峰、五味子醇甲在166-167min出峰。

优选地，绿原酸在32.55min出峰、苦杏仁苷在36.63min出峰、栀子苷在42.53min出峰、橙皮苷在86.53min出峰、黄芩苷在103.25min出峰、汉黄芩苷在129.3min出峰、甘草酸铵在156.77min出峰、五味子醇甲在166.18min出峰。

进一步，绿原酸的检测波长为320-340nm，苦杏仁苷的检测波长为205-215nm、栀子苷的检测波长为230-240nm、橙皮苷的检测波长为270-290nm、黄芩苷的检测波长为 250-290nm、汉黄芩苷的检测波长为270-290nm、甘草酸铵的检测波长为230-240nm、五味子醇甲的检测波长为205-255nm。

优选地，绿原酸的检测波长为330nm，苦杏仁苷的检测波长为210nm、栀子苷的检测波长为238nm、橙皮苷的检测波长为280nm、黄芩苷的检测波长为250nm、汉黄芩苷的检测波长为280nm、甘草酸铵的检测波长为238nm、五味子醇甲的检测波长为210 nm。

本发明还在于公开上述清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法在市售清肺汤制剂质量控制方向的应用。

本发明的有益效果：

本发明利用HPLC质量控制构建方法对国内外已上市的清肺汤产品进行检测并评价，用以控制清肺汤市售制剂的质量，区分清肺汤市售制剂的来源，确保清肺汤市售制剂的临床疗效；该HPLC质量控制构建方法可实现对清肺汤制剂的质量监控，为保证清肺汤用药安全、稳定和质量可控提供参考依据，促进中医药的继承和发展。

附图说明

图1为实施例中应用的现有的煎药装置；

图2A为清肺汤指纹图谱；图2B为8种指标成分混合对照品溶液；图2C为清肺汤与对应单味药材阴性汤剂对照图(圆框内为清肺汤处方与对应单味药材阴性汤剂对比图谱；圆框外为清肺汤处方全方图谱)；其中，1号峰代表绿原酸；2号峰代表苦杏仁苷；3号峰代表栀子苷；9(S)号峰代表橙皮苷；11号峰代表黄芩苷；16号峰代表汉黄芩苷； 19号峰代表甘草酸铵；21号峰代表五味子醇甲；

图3为实施例中清肺汤市售制剂指纹图谱(n＝2)；其中，1号峰代表绿原酸；2号峰代表苦杏仁苷；3号峰代表栀子苷；9(S)号峰代表橙皮苷；11号峰代表黄芩苷；16 号峰代表汉黄芩苷；19号峰代表甘草酸铵；21号峰代表五味子醇甲；

图4为实施例中清肺汤市售制剂中8种成分的每日服用量以同一种成分为单位做不同样品间的z-score归一化处理热图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。本发明用到的原料均为市购产品，具体如下：

1.药材信息：

黄芩(产地：山西，批号：T100601-1)，桔梗(产地：河北，批号：T180601-1)，茯苓(产地：安徽，批号：T180601-1)，陈皮(产地：四川，批号：181001-1)，贝母 (产地：杭州，批号：181001-1)，桑白皮(产地：河北，批号：180814-1)，当归(产地：甘肃定西，批号：T180601-1)，天门冬(产地：云南，批号：180812-1)，山栀(产地：江西，批号：180810-1)，苦杏仁(产地：河北，批号：180106-1)，麦冬(产地：四川，批号：T181001-1)，五味子(产地：大连，批号：180816-1)，甘草(产地：内蒙，批号：T180601-1)，大枣(产地：山东，批号：181110-1)，生姜(产地：河北，批号：180101-1)均由天津同仁堂集团股份有限公司提供，并进行质量检查。

2.对照品信息：

绿原酸(批号：110753-201817，纯度96.8％)，苦杏仁苷(批号：110820-201808，纯度93.4％)，栀子苷(批号：110749-201718，纯度97.6％)，橙皮苷(批号：110721-201818，纯度96.2％)，黄芩苷(批号：110715-201821，纯度95.4％)，甘草酸铵(批号：110731-201720，纯度97.7％)，汉黄芩苷(批号：112002-201702，纯度98.5％)均购自中国食品药品检定研究院。五味子醇甲(批号：Y13D8H50595，HPLC8H50)购自上海源叶生物科技有限公司。

3.试剂信息：

乙腈(美国Fisher公司，色谱纯)；磷酸(美国Fisher公司，HPLC Grade,，85％，LOT：185349)；甲醇购自赛默飞科技有限公司(色谱级)；去离子水由Milli-Q水净化系统生产。

实施例1清肺汤质量控制构建方法

本实施例中清肺汤质量控制构建方法采用如下步骤：

1.清肺汤相关制剂的提取与处理；

2.绿原酸、苦杏仁苷、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲等8种成分的混合对照品溶液的配制；

3.步骤2中8种成分的高效液相色谱法含量测定方法学考察，指纹图谱方法学考察。

即，本实施例中质量控制构建方法涵盖对有效成分含量的测定及指纹图谱的构建两个方面，该含量的测定过程和指纹图谱的构建过程基本相同，以下进行统一描述，不再分开赘述。

上述步骤1按以下操作进行：

(1)清肺汤汤剂及浸膏粉的制备

黄芩(去朽心)一钱半；桔梗(去芦)；茯苓(去皮)；陈皮(去白)；贝母(去心)；桑白皮各一钱；当归；天门冬(去心)；山栀；杏仁(去皮、尖)；麦门冬(去心)各七分；五味子七粒；甘草三分。使用剂量转换根据重大新药创制专项“经典名方标准颗粒的研究”经典名方古今剂量折算原则专家共识并且与现代方剂中剂量较为一致，建议清肺汤现代处方剂量为：黄芩4.5g；桔梗3g；茯苓3g；陈皮3g；贝母3g；桑白皮3g；当归2.1g；天门冬2.1g；山栀2.1g；杏仁2.1g；麦门冬2.1g；五味子0.9g；甘草0.9g；生姜2.5g；大枣 3g。将处方药材黄芩、桔梗、茯苓、陈皮、贝母、桑白皮、当归、天门冬、山栀、苦杏仁、麦门冬、五味子、甘草共13味药材用中药粉碎机粉碎后，过一号药典筛。取清肺汤单处方量药材，放入煎药装置中，煎药装置见图1，加入蒸馏水或去离子水300～400mL，浸泡药材30～60min。以200～220V电压加热至水沸腾，调整电压至125～175V保持沸腾约20～30min，倾倒出汤剂；再加入蒸馏水或去离子水300～400mL，以200～220V电压加热至水沸腾，调整电压至125～175V保持沸腾约15～20min，倾倒出汤剂与第一次倒出的汤剂混合，汤剂体积为300～400mL。将汤剂用旋转蒸发仪50～60℃浓缩至稠浸膏状， -80～-90℃冷冻干燥30h。即得清肺汤干浸膏粉，干燥器内密封保存。

具体地，在该实施例中加入蒸馏水或去离子水350mL，浸泡药材50min。以210V电压加热至水沸腾，调整电压至150V保持沸腾约25min，倾倒出汤剂；再加入蒸馏水或去离子水350mL，以210V电压加热至水沸腾，调整电压至150V保持沸腾约18min，倾倒出汤剂与第一次倒出的汤剂混合，汤剂体积为350mL。将汤剂用旋转蒸发仪55℃浓缩至稠浸膏状，-85℃冷冻干燥30h。即得清肺汤干浸膏粉，干燥器内密封保存。

(2)清肺汤浸膏粉处理

实验室自制清肺汤干浸膏研磨成粉，精密称取粉末0.50g，于50mL三角瓶中，先加50％甲醇25mL，称定重量，超声(240W；40kHz)提取20-30min，50％甲醇补足失重，摇匀，静置30-60min后，取上清液过0.22μm孔径微孔滤膜，即得待测样品a，用以测定甘草酸铵、五味子醇甲、苦杏仁苷的含量和样品的指纹图谱。精密移取待测样品a 2mL 于25mL量瓶中，加50％甲醇定容，摇匀，静置30-60min，取上清液过0.22μm孔径微孔滤膜，即得待测样品稀释品b，用以测定绿原酸、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷的含量。

上述步骤2按以下操作进行：

取绿原酸、苦杏仁苷、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲标准品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL含1225.49、2805.74、1342.98、 1207.31、489.61、585.37、1485.38、2081.01μg/mL的单一对照品贮备液，采用该浓度的原因：①预先计算待测样品中各指标成分的浓度后，向上增大适当倍数取线性最高点，向下缩小适当倍数取线性最低点，使得线性范围可以尽可能囊括不同批次间指标成分差异；②对照品称量在10mg以上相比于称量几毫克更为精准；具体情况如下表1。其他不同浓度的混合对照品溶液由50％甲醇稀释储备液得到。

表1清肺汤对照品线性检测系列浓度

步骤3按以下操作进行：

(1)色谱条件

十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，B相为0.05％～0.2％磷酸水，按表2进行梯度洗脱，流速0.6mL/min；柱温25～40℃；进样体积5～10μL。

表2梯度洗脱程序表

(2)检测波长：

表3检测波长程序表

注：对清肺汤处方进行全波长扫描，以指标成分的药典要求波长结合全波长扫描结果中指标成分的最大吸收，对各指标成分的波长进行确定。黄芩苷最大吸收波长274nm，药典要求波长280nm，但是由于黄芩苷单个指标成分在清肺汤处方中的含量最高(黄芩苷占全方冻干粉比约30mg/g)，导致与其他成分的出峰响应差别较大，不利于处方整体的含量测定和指纹图谱分析。故选择波谷吸收250nm作为黄芩苷检测波长。汉黄芩苷最大吸收在274nm，橙皮苷最大吸收在286nm，综合两个成分选择280nm作为检测波长。苦杏仁苷药典要求波长207nm，但是在近紫外吸收波段下，溶剂峰以及指标峰都存在较为明显的吸收，为保证苦杏仁苷的分离度选择波长210nm。绿原酸的最大吸收326nm，药典要求330nm，故选择330nm作为检测波长。甘草酸铵检测波长238nm。五味子醇甲药典要求检测波长250nm，但由于五味子醇甲在处方中的含量较低，峰响应值也低，且发现其在210nm下的峰面积明显大于250nm检测的峰面积，故五味子醇甲的检测波长调整为210nm。阿魏酸药典要求检测波长316nm，但是在专属性考察中发现阿魏酸在当归、陈皮中均有，不能作为含量测定指标成分，故仅将其纳入指纹图谱分析中。各别批次当归中可检测出藁本內酯(最大吸收326nm)，但是由于藁本內酯不稳定，未纳入质量控制指标中。

清肺汤处方中各成分色谱行为差异较大，无法在保证各指标成分都有较大出峰的情况下统一确定检测波长，为综合各指标成分的检测情况，本实验以程序波长作为检测方式，保证小峰与大峰均有合适的检测效果。

(3)专属性试验：

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照样品溶液，在步骤3的色谱条件及检测波长条件下分析，结果见图2A、图2B和图2C。

优选出21个共有峰用以评价清肺汤指纹图谱相似度，如图2A所示，9号峰(橙皮苷)为参照峰，用以评价相对保留时间与相对峰面积。

如图2C所示，清肺汤与对应单味药材阴性汤剂对照图表明，清肺汤中绿原酸为桑白皮专属成分；苦杏仁苷为苦杏仁专属成分；栀子苷为栀子专属成分；橙皮苷为陈皮专属成分；黄芩苷、汉黄芩苷为黄芩专属成分；甘草酸铵为甘草专属成分；五味子醇甲为五味子专属成分。8种化合物在相应测定波长与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，对应单味药材阴性汤剂对照图在相应位置上基本无干扰，表明方法专属性良好。

绿原酸、苦杏仁苷、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲8 种化合物在相应测定波长与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，阴性对照在相应位置上未见色谱峰或色谱峰干扰小于5.0％，说明其他组分不干扰8种成分的测定。

(4)线性关系试验：

分别精密吸取混合对照品溶液适宜体积，至适宜体积的量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀制备成系列浓度的8种成分的混合对照品溶液。分别精密吸取10μL，注入高效液相色谱仪中，以对照品浓度(X，mg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制回归方程，结果见表5。

(5)精密度试验：

含量测定精密度：精密吸取适宜浓度混合对照品溶液10μL，在一天内按上述色谱条件测定6次并记录8种成分的峰面积；以相对偏差(RSD)表示，结果见表4。

表4精密度结果

指纹图谱精密度：精密吸取同1份清肺汤待测样品a溶液10μL，按上述色谱测定条件连续进样6次，分别记录21个共有峰的保留时间和峰面积，计算保留时间和峰面积的RSD，相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果表明建立的方法用于指纹图谱测定精密度良好。结果见表6。

(6)重复性试验：

含量测定重复性：步骤1待测样品a与待测样品b各平行制备6份，精密吸取上述供试品各10μL，按上述色谱条件测定并记录8种成分的峰面积；以相对偏差(RSD)表示，结果见表5。

指纹图谱重复性：精密吸取6份清肺汤待测样品a溶液10μL，按上述色谱测定条件进样，分别记录21个共有峰的保留时间和峰面积，计算保留时间和峰面积的RSD，相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果表明建立的方法用于指纹图谱测定重复性良好。结果见表6。

(7)稳定性试验：

含量测定稳定性：精密吸取清肺汤步骤1同一份待测样品a与待测样品b各10μL，于25℃下0、4、8、12、24、48h进样，测定8种成分再对应样品以及对应时间的峰面积。稳定性结果以RSD表示，结果见表5。

指纹图谱稳定性：精密吸取清肺汤步骤1同一份待测样品a10μL，于25℃下0、4、 8、12、24、48、72、168、192h进样，192h内指纹图谱中21个共有峰峰面积RSD均小于2.0％，结果见表6。表明样品在192h内稳定。

(8)加样回收试验：

精密称取步骤3(6)项下已知指标成分含量的清肺汤干浸膏粉6份，约0.25g，精密加入近似等量的8种对照品，按“步骤1”方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果见表5.

表5含量测定方法学考察结果

表6清肺汤指纹图谱方法学考察结果

注：(S)代表基准峰；--为未知成分。

实施例2 HPLC质量控制构建方法在市售清肺汤制剂质量控制方向的应用

1.清肺汤市售制剂信息：

清肺汤浓缩锭(厂家：港香兰药厂股份有限公司，批号：G26419)，下文简称制剂 A；清肺汤浓缩颗粒(厂家：港香兰药厂股份有限公司，批号：K09916)，下文简称制剂B；清肺汤萃取物颗粒(厂家：日本津村药业有限公司，批号：N34151)，下文简称制剂C；清肺汤浓缩颗粒(厂家：中国台湾顺天堂药厂股份有限公司，批号：18102431)，下文简称制剂D；清肺汤浓缩散(厂家：中国台湾仙丰股份有限公司，批号：E073RR1)，下文简称制剂E，清肺汤市售制剂厂家、剂型、每日服用量、每日服用量中浓缩干粉量、每日服用量中辅料量信息见表7。

表7清肺汤市售制剂厂家、批号、每日服用量、每日服用量中浓缩浸膏粉量、每日服用量中辅料量

2.市售制剂的处理

分别称取适量清肺汤市售制剂，研磨成粉，参照各自服用说明书中所述清肺汤汤剂浓缩干粉与辅料的比例，精密称取含有清肺汤汤剂浓缩干粉(不计辅料)0.5g的清肺汤市售制剂粉末于50mL三角瓶中，加入25mL50％甲醇，超声处理20min(功率240W，频率40kHz)，静置30min，制备成溶媒为50％甲醇的清肺汤市售制剂待测样品a(用以对苦杏仁苷、甘草酸铵、五味子醇甲进行质量分析)；精密移取待测样品a上清液2mL 于25mL容量瓶，精密加入50％甲醇定容，制备成溶媒为50％甲醇的清肺汤市售制剂待测样品b(用以对绿原酸、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷进行质量分析)。

3.市售制剂的检测及指纹图谱见图的构建：

精密吸取各市售各清肺汤制剂的待测样品a与待测样品b各10μL，按上述色谱条件测定，记录8种成分的峰面积，并计算出的各清肺汤市售制剂中8种成分的每日服用量。见表9。并采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件对市售各清肺汤市售制剂的液相色谱进行数据匹配，即得标准指纹图谱，见图3；

表8各清肺汤市售制剂中8种成分的每日服用量(mg)

4.归一化处理

计算出的各市售各清肺汤制剂中8种成分的每日服用量以同一种成分为单位做不同样品间该成分的归一化处理，归一化结果以样品为单位做不同样品间的聚类分析；将测定的各市售各清肺汤制剂指纹图谱采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行数据匹配，并计算相似度，相似度结果见表9。本发明有效的控制了清肺汤的质量，保证了药物的疗效，使经典名方得到了更为正规的质量控制。

表9清肺汤市售制剂指纹图谱相似度(n＝2)

指纹图谱相似度结果表明，不同来源的清肺汤市售制剂相似度较高，相似度均大于等于0.945。

5.热图表征

不同清肺汤市售制剂中8种成分的每日服用量聚类分析与热图表征：

本发明以含量测定结果为基础，结合清肺汤相关制剂的用法与用量，计算清肺汤中8 种指标成分的每日服用量，并以此为评价标准，对清肺汤浓缩锭(厂家：港香兰药厂股份有限公司)；清肺汤浓缩颗粒(厂家：港香兰药厂股份有限公司)；清肺汤萃取物颗粒(厂家：日本津村药业有限公司)；清肺汤浓缩颗粒(厂家：中国台湾顺天堂药厂股份有限公司)；清肺汤浓缩散(厂家：中国台湾仙丰股份有限公司)等清肺汤市售制剂中8种成分的每日服用量进行计算。以同一种成分为单位做不同样品间该成分的z-score归一化处理，归一化结果以制剂来源为单位做不同制剂间的聚类分析，快速区分出不同来源的清肺汤市售制剂A-E，结果见图4。

从热图聚类分析图X轴可以看出港香兰清肺汤浓缩颗粒和港香兰清肺汤浓缩锭被聚类为一组，这表明本发明建立的清肺汤的质量评价方法能够对市售产品进行有效的区分。同时Y轴中将黄芩苷和汉黄芩苷聚类在一起，这两种化学成分同属于中药材黄芩，由此可以推断，该方法能对中药复方制剂中活性成分的归属进行指导，为临床药品的使用提供参考，为清肺汤药品的后续研发提供思路和依据。，

综上，通过上述实施例结果可以看出，本发明充分利用了高效液相优势，在187min内测定了清肺汤市售制剂中的8种成分，奠定了清肺汤制剂质量分析的基础，且所测定的8种成分在图谱中均有显示。建立的含量测定方法能够快速地反映清肺汤中药味信息，同时计算出不同来源清肺汤市售制剂中8种成分的每日服用量，对不同来源清肺汤市售制剂中8种成分的每日服用量的结果进行归一化处理、热图表征与聚类分析，通过聚类分析可以快速区分不同来源的清肺汤市售制剂，通过热图特征区域来表征不同厂家清肺汤市售制剂的质量特征，为评价和控制清肺汤市售制剂的质量提供了科学有效的评价方法，并且本发明实施例的检测方法快速、简便、稳定，具有较好的可操作性与重复性。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (8)

1.清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法，其特征在于，包括以绿原酸、苦杏仁苷、栀子苷、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲中至少一种为有效成分，并用所述有效成分进行HPLC含量测定和HPLC指纹图谱构建中的至少一个过程。

2.根据权利要求1所述的清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法，其特征在于，HPLC的色谱条件为：使用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，梯度洗脱，流动相A为乙腈，B为0.05％-0.2％磷酸水，检测波长为200-360nm，流速0.3-0.9mL/min；柱温25-40℃；进样体积5-20μL。

3.根据权利要求1-2任一所述的清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法，其特征在于，HPLC的色谱条件为：色谱柱为Agilent Technologies COLUMN TYPE:ZORBAX SB-C18(3.5μm×4.6mm×250mm)；流动相A为乙腈，B为0.1％磷酸水，流速0.6mL/min；柱温30℃；进样体积10μL。

4.根据权利要求1所述的清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法，其特征在于，绿原酸在32-33min出峰、苦杏仁苷在36-37min出峰、栀子苷在42-43min出峰、橙皮苷在86-87min出峰、黄芩苷在103-104min出峰、汉黄芩苷在129-130min出峰、甘草酸铵在156-157min出峰、五味子醇甲在166-167min出峰。

5.根据权利要求1、2、4任一所述的清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法，其特征在于，绿原酸在32.55min出峰、苦杏仁苷在36.63min出峰、栀子苷在42.53min出峰、橙皮苷在86.53min出峰、黄芩苷在103.25min出峰、汉黄芩苷在129.3min出峰、甘草酸铵在156.77min出峰、五味子醇甲在166.18min出峰。

6.根据权利要求1所述的清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法，其特征在于，绿原酸的检测波长为320-340nm，苦杏仁苷的检测波长为205-215nm、栀子苷的检测波长为230-240nm、橙皮苷的检测波长为270-290nm、黄芩苷的检测波长为250-290nm、汉黄芩苷的检测波长为270-290nm、甘草酸铵的检测波长为230-240nm、五味子醇甲的检测波长为205-255nm。

7.根据权利要求1、2、6任一所述的清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法，其特征在于，绿原酸的检测波长为330nm，苦杏仁苷的检测波长为210nm、栀子苷的检测波长为238nm、橙皮苷的检测波长为280nm、黄芩苷的检测波长为250nm、汉黄芩苷的检测波长为280nm、甘草酸铵的检测波长为238nm、五味子醇甲的检测波长为210nm。

8.根据权利要求1-7任一所述的清肺汤制剂HPLC质量控制构建方法在市售清肺汤制剂质量控制方向的应用。

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