CN103399094A - 一种消癥丸制剂的指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，该方法包括供试液的制备，标准指纹图谱的建立和供试液指纹图谱的测定。经实验验证表明，本发明提供的指纹图谱检测方法，灵敏度和精密度高，稳定性和重复性好，相似度高，可以客观、全面、准确的评价该消癥丸制剂的质量，对保证临床药效具有重要意义。

Description

一种消癥丸制剂的指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药制剂的质量检测方法，具体涉及一种消癥丸制剂的指纹图谱检测方法。

背景技术

消癥丸的新药证书号为国药证字Z20080012，药品批准文号为国药准字Z20100057，执行的药品标准为YBZ00932010。其功能主治为舒肝行气、活血化痰、软坚散结。主治气滞血瘀痰凝所致的乳腺增生病。症见乳房肿块，乳房胀痛或刺痛，可伴胸胁疼痛，善郁易怒，胸闷，脘痞纳呆，月经量少色暗，经行腹痛。舌暗红或有瘀点、瘀斑，苔薄白或白腻。脉弦或涩。该品种是遵循祖国医学理论，由河南中医学院老中医赵俊学老师在明代张介宾《景岳全书》中柴胡疏肝散的基础上，根据乳腺增生病的发病机理加减而成，在临床中应用几十年，对乳腺增生症的疗效确切。消癥丸以疏肝行气、活血化痰、软坚散结立法组方，故以柴胡、香附为君药，柴胡性轻清，主升散行滞，主入肝胆经，功专疏肝解郁，调畅气机，以使肝主疏泄，恢复条达之性，为疏解肝经瘀滞的要药；香附味辛、微苦、甘平，主入肝经。味辛能散，微苦能降，微甘能和，香而能窜，药性平和，亦为疏肝解郁，调经止痛之良药，既入气分，又行血分，总以治疗气血失和，妇科诸症为功。柴胡与香附合用，相须为伍，相得益彰，次对肝经气血瘀滞乳癖的主要病机，故同为君药。大黄、青皮、川芎共为臣药。大黄酒制，专入血分，为活血通经化瘀消癥的良药，辅助君药增强破积滞，行瘀血，散结块之效；青皮苦、辛、温，主入肝胃经，功专疏肝破气，消积化滞，可辅助君药增强散痰瘀、破气滞、消癖块之功；川芎辛、温，入肝胆经，功擅行气开郁，活血止痛，辅助君药增强行气活血、散结开郁、消散乳癖之功效。大黄偏攻瘀血，青皮偏破气滞，川芎既活血，又行气，合而用之，共辅君药调畅气血之能，臣药之用意十分突显。当归、白芍、莪术、土鳖虫、浙贝母共为佐药。当归甘、辛、温，入肝脾心经，为补血活血，化瘀止痛之良药，佐助君药，调畅气血，散瘀止痛。白芍苦、酸、微寒，入肝脾经，平肝阳、养肝血、柔筋止痛，佐助君药缓解乳癖、乳胀、乳痛。莪术苦、辛、温，入肝脾经，行气破结，消积止痛亦为血中气药，有佐君药行气破瘕，散结消癖之功。土鳖虫咸寒，功能破血逐瘀，佐助君药破血逐瘀，软坚散结，消散乳癖结块。浙贝母辛、苦、性寒，清热化痰开郁散结，善开痰火郁结，佐助君药以消痰瘀互结，乳癖结块。五药合用行气破血，通瘀消癥，化痰散结共成佐助之用，且当归、白芍补血养阴以防柴胡、香附、青皮辛香温、燥疏散太过；又防大黄、莪术、土鳖虫破血逐瘀伤营太过，以使攻邪而不伤正，又成佐制之用。王不留行为佐使药，该药苦平，入肝胃经，活血化瘀，走而不守，善通乳络，又可引诸药通达乳络，直达病所，成佐使之用。全方诸药共用，合奏疏肝行气，活血化痰，软坚散结之效。使气顺，血活，痰消，络通，痛止，诸症缓解，乳癖得愈，不失为消癥除癖之良方。

近年来，中药指纹图谱技术已日渐成熟，能够很好的控制药品的质量，保证药品的有效性和质量可控性，已经成为一种业内公认的、可靠的、高效的技术手段，是中药质量控制的发展趋势。

因此为了更全面、有效的控制该消癥丸制剂的质量，提高其质量控制水平，让临床用药安全及疗效更加有所保证，很有必要在现有技术的基础之上研究设计出一种能客观、准确，全面检测消癥丸制剂质量的指纹图谱测定方法。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种精密度高，重复性和稳定性好，能客观、全面、准确的评价消癥丸制剂质量的指纹图谱检测方法，能更有效的保证成品的质量，对控制消癥丸制剂的质量具有重要作用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案为：

一种消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取消癥丸制剂内容物细粉，精密称取1.0g至50ml锥形瓶中，精密加入浓度为90%乙醇溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，静置放冷，用浓度90%乙醇补足失重，减压回收乙醇，浓缩，上AB-8大孔吸附树脂柱，分别用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇，按每小时3-4倍柱体积的流速洗脱，合并40%、60%、80%、95%乙醇洗脱液，减压浓缩，定容至10ml，吸取溶液，过0.45μm滤膜，即得；

(2)高效液相色谱法测定标准指纹图谱：取10至20批消癥丸制剂按步骤(1)的方法制备得到供试品溶液，按下列色谱条件获得10至20批消癥丸制剂的高效液相色谱图，以这10至20批消癥丸制剂指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为标准指纹图谱；

色谱条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相：乙腈和浓度为0.3％磷酸水，洗脱方式：梯度洗脱，检测波长：245nm～254nm；柱温40℃～50℃；流速0.8ml/min～1ml/min；进样量50μl；

(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)制备得到的供试品溶液，按下列色谱条件获得供试品溶液指纹图谱；

色谱条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：A为乙腈和B为浓度为0.3％磷酸水；洗脱方式：梯度洗脱；检测波长：245nm～254nm；柱温40℃～50℃；流速0.8ml/min～1ml/min；进样量50μl；

取步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的标准指纹图谱用相似度软件评价。

作为优选的方案，以上所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，步骤(2)和步骤(3)所述的梯度洗脱方式如下表：

时间/分钟	流动相A体积百分比	流动相B体积百分比
			0-5	10～12	90～88
5-10	12～12	88～88
			10-30	12～16	88～84

30-33	16～19	84～81
			33-45	19	81～81
45-51	19～24.2	81～75.8
			51-58	24.2～24.2	75.8～75.8
58-65	24.2～30	75.8～70
			65-85	30～38.5	70～61.5
85-90	38.5	61.5
			90-96	38.5～65	61.5～35
96-101	65～68	35～32
			101-105	68～95	32～5
105-110	100	0

作为更优选的方案，以上所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，步骤(2)和步骤(3)所述的色谱条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：A为乙腈和B为浓度为0.3％磷酸水；洗脱方式：梯度洗脱；检测波长：254nm；柱温40℃；流速0.8ml/min；进样量50μl。

消癥丸制剂由11种药味制成，化学成分复杂，活性成分多，本发明通过大量实验筛选流动相的组成和梯度洗脱方式，分别以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行了等度和梯度洗脱试验。结果表明，用乙腈-0.3％磷酸水进行梯度洗脱为佳，色谱峰检测比较全面，锋形尖锐且分离度较好，峰面积较大，调整流动相不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，且基线平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，可有效避免色谱图的拖尾现象，有利于指纹图谱的全面准确分析。

作为优选的方案，以上所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，步骤(2)和步骤(3)所述的色谱柱为WatersXbridgeC-18色谱柱。由于消癥丸制剂活性成分多，为了达到更好的分离效果，本发明筛选了不同的色谱柱：

Waters XbridgeC-18：(4.6×250mm；5μm)；

Thermo ODSHypersilC18：(4.6×250mm；5μm)；

Hedera ODS-2C-18：(4.6×250mm；5μm)；

试验考察结果表明Waters XbridgeC-18色谱柱对消癥丸制剂中各成分分离度高，峰形对称，分离效果好，因此本发明优选Waters XbridgeC-18色谱柱作为消癥丸制剂指纹图谱测定色谱柱。

作为优选的方案，以上所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，所述的供试品溶液指纹图谱和标准指纹图谱的相似度大于0.9。本发明采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对消癥丸制剂指纹图谱进行评价，结论客观、准确、全面。

作为更优选的方案，以上所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，步骤(2)和步骤(3)检测时间为110分钟。

本发明所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，检测波长优选254nm。消癥丸制剂中活性成分复杂，为了能更全面的反映消癥丸制剂中的成分，本发明对200～400nm扫描的各波长下的色谱图进行比较分析，结果表明在254nm处检测的色谱图不仅基线平稳，指纹峰较多，信息量多，且各色谱峰的分离效果很好，峰面积大，重复性好。因此，选254nm作为检测波长。同时按照试行标准的要求考察了其它波长下的色谱图，其结果显示消癥丸制剂在不同波长下的色谱指纹图谱具有很好的相似度。

供试品溶液提取溶剂及其提取方法筛选：消癥丸制剂是由11味中药组成的复方制成，活性成分复杂，为了能高效地将消癥丸制剂活性成分提取出来，全面反映其质量，本发明考察了水、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醇、甲醇的回流提取和超声提取等不同提取方法和不同提取时间的提取效果，实验结果表明，以90％乙醇为提取溶剂，超声提取30min，提取较为完全，操作方法简便，且方法稳定、重现性好。但是提取物中含有大量极性较大的成分对整个图谱分析有较严重的影响，因此本发明有通过大量实验优选，采用大孔树脂除去极性较大的非活性部位，所得图谱信息量较大，既含脂溶性成分也包括水溶性成分，符合指纹图谱整体性的要求，其尽可能反映了药材所含的全部信息，可以作为综合质量评价的方法。

流动相流速的筛选：本发明筛选了0.5mL/min、0.6mL/min、0.8mL/min和1mL/min等流速对指纹图谱测定结果的影响，比较了峰形、分离度、理论塔板数等，优选的流动相流速为0.8mL/min。

同时本发明对色谱柱的柱温进行了筛选，考察了色谱柱在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃和45℃条件下消癥丸制剂中各成分的分离效果，比较了分离效果、重复性、稳定性等，优选的色谱柱柱温为40℃。

本发明提供的消癥丸制剂的处方组成为：柴胡125g、香附125g、大黄（酒炙）83.4g、炒青皮83.4g、川芎83.4g、莪术83.4g、土鳖虫83.4g、浙贝母83.4g、当归125g、白芍125g、炒王不留行83.4g。消癥浓缩丸

如消癥浓缩丸制法：取以上十一味，取处方量二分之一量的酒大黄粉碎成细粉，备用。浙贝母、王不留行加70％乙醇5倍量，回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，静置16小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成清膏，备用。香附、青皮、川芎、莪术和当归水蒸气蒸馏6小时，提取挥发油，蒸馏后的水溶液滤过，备用，挥发油用β-环糊精包结，包结物低温干燥。剩余的酒大黄等其余四味，分别加水10倍量，煎煮3次，每次1小时，滤过，合并滤液和上述蒸馏后的水溶液，浓缩至相对密度为1.05～1.10（50℃），静置16小时，离心（2500转／分），取上清液浓缩成清膏，和上述醇提清膏混合后继续浓缩至相对密度为1.15～1.20（50℃）的清膏，取90%左右的清膏喷雾干燥，其余清膏继续浓缩至1.35～1.38（50℃）的稠膏，将喷雾干燥粉和适量酒大黄细粉、β-环糊精包结物混合后，加入适量糊精混匀，用9%～12%混合粉量的55%～75%浓度的乙醇合坨、塑制成丸粒，再取剩余酒大黄细粉、适量稠膏将丸滚圆，干燥，用剩余稠膏、适量滑石粉和活性炭包衣，虫白蜡打光，制成1000丸，即得。

有益效果：本发明提供的消癥丸制剂的指纹图谱的检测方法和现有技术相比具有以下优点：

本发明所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，首先通过大量实验筛选出最佳的流动相组成及其梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱等分析条件，制定标准指纹图谱，经多次实验验证表明，本发明提供的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，灵敏度、精密度高，重复性、稳定性好，能够准确测定消癥丸制剂的指纹图谱，可以客观、全面、准确的评价消癥丸制剂质量，可克服现有技术检测指标单一，不能反映内在质量的诸多缺点。

附图说明

图1为消癥丸制剂的标准指纹图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1消癥丸制剂的测定及标准指纹图谱的获得

一种消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取消癥丸制剂内容物细粉，精密称取1.0g至50ml锥形瓶中，精密加入浓度为90%乙醇溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，静置放冷，用浓度90%乙醇补足失重，减压回收乙醇，浓缩，上AB-8大孔吸附树脂柱，分别用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇，按每小时3-4倍柱体积的流速洗脱，合并40%、60%、80%、95%乙醇洗脱液，减压浓缩，定容至10ml，吸取溶液，过0.45μm滤膜，即得；

(2)高效液相色谱法测定标准指纹图谱：取11批（MB38003、MB38004、MB38005、MB38006、MB38007、MB38008、MB38009、MB38010、MB38011、MB38012A、MB38013）消癥丸制剂按步骤(1)的方法制备得到供试品溶液，按下列色谱条件获得11批消癥丸制剂的高效液相色谱图，以这11批消癥丸制剂指纹图谱为基础，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》进行评价，在254nm检测波长下的相似度大于0.9的图谱为标准指纹图谱；如图1所示；

色谱条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相：乙腈和浓度为0.3％磷酸水，洗脱方式：梯度洗脱，检测波长：245nm～254nm；柱温40℃～50℃；流速0.8ml/min～1ml/min；进样量50μl；

(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)制备得到的供试品溶液，按下列色谱条件获得供试品溶液指纹图谱；

色谱条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：A为乙腈和B为浓度为0.3％磷酸水；洗脱方式：梯度洗脱；检测波长：245nm～254nm；柱温40℃～50℃；流速0.8ml/min～1ml/min；进样量50μl；

(4)对照品溶液的制备：精密称取芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚适量，加甲醇溶解，分别制成芍药苷为36μg/ml，阿魏酸为56.3μg/ml，橙皮苷为42μg/ml，大黄酸为24.6μg/ml，大黄素为29.8μg/ml，芦荟大黄素为51.6μg/ml，大黄素甲醚为38.6μg/ml，大黄酚为26μg/ml的对照品溶液。按下列色谱条件获得对照品溶液指纹图谱；

色谱条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：A为乙腈和B为浓度为0.3％磷酸水；洗脱方式：梯度洗脱；检测波长：245nm～254nm；柱温40℃～50℃；流速0.8ml/min～1ml/min；进样量50μl；仪器为美国waterse2695高效液相色谱系统，包括在线脱气机，自动进样器ProminenceSIL-20A，二极管阵列检测器waters2998和柱温箱CTO-20A,Empower色谱工作站；

其中步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)所述的梯度洗脱方式如下表：

时间/分钟	流动相A体积百分比	流动相B体积百分比
			0-5	10～12	90～88
5-10	12～12	88～88
			10-30	12～16	88～84
30-33	16～19	84～81
			33-45	19	81～81
45-51	19～24.2	81～75.8
			51-58	24.2～24.2	75.8～75.8
58-65	24.2～30	75.8～70
			65-85	30～38.5	70～61.5
85-90	38.5	61.5
			90-96	38.5～65	61.5～35
96-101	65～68	35～32
			101-105	68～95	32～5
105-110	100	0

取步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的标准指纹图谱用相似度软件评价，其中11批成品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，其结果均大于0.90；如表1所示

表1十一批消癥丸指纹图谱相似度考察结果

批号	相似度
		MB38003	0.991
MB38004	0.988
		MB38005	0.988
MB38006	0.990
		MB38007	0.986
MB38008	0.986
		MB38009	0.988
MB38010	0.982
		MB38011	0.982
MB38012AA	0.988
		MB38013	0.984

步骤(4)得到的对照品溶液指纹图谱和标准指纹图谱比对，其中所述消癥丸制剂HPLC指纹图谱在254nm检测波长下的指纹图谱有34个主要的特征峰，其中归属柴胡的有15个特征峰；归属香附的有12个特征峰；归属大黄的有13个特征峰；归属川芎的有12个特征峰；归属莪术的有11个特征峰；归属当归的有10个特征峰；归属白芍的有11个特征峰；归属浙贝母的有14个特征峰；归属王不留行的有11个特征峰；归属青皮的有14个特征峰。

其中5号峰（保留时间19.804）为芍药苷，6号峰（保留时间24.747）为阿魏酸，11号峰（保留时间42.557）为橙皮苷，24号峰（保留时间81.697）为大黄酸，29号峰（保留时间88.095）为大黄素，32号峰（保留时间99.854）为芦荟大黄素，33号峰（保留时间104.608）为大黄素甲醚，34号峰（保留时间106.957）为大黄酚。

实施例2消癥丸制剂胶囊指纹图谱检测方法的方法学考察

1、精密度实验

取批号为MB38003的消癥丸制剂，按实施例1步骤(1)供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，连续进样5次测定，测定结果见表2和表3。

表2消癥丸制剂液相指纹图谱精密度考察结果（相对保留时间）

表3消癥丸制剂液相指纹图谱精密度考察结果（相对峰面积）

结果表明，检测方法的精密度良好。供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(峰面积2％以上)的峰面积基本一致(RSD小于3％)，又以第一次进样所得指纹图谱作为参照，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均符合指纹图谱的技术要求。

2、稳定性实验

取批号为MB38003的消癥丸，按实施例1步骤(1)供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，分别于0h/2h/4h/8h/12h/24时考察稳定性，共测得7次，测定结果见表4和5。结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(峰面积大于2％以上)的峰面积基本一致(RSD＜3％)，又以第一次进样所得指纹图谱作为参照，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算后6次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度符指纹图谱的技术要求。

表4消癥丸制剂液相指纹图谱稳定性考察结果（相对保留时间）

表5消癥丸制剂液相指纹图谱稳定性考察结果（相对峰面积）

以上结果表明，本发明提供的指纹图谱检测方法稳定性好。

3、方法重复性实验

取批号为MB38003的消癥丸，按实施例1步骤(1)供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，依法测定，测定结果见表6和7。

表6消癥丸制剂液相指纹图谱重现性考察结果（相对保留时间）

表7消癥丸制剂液相指纹图谱重现性考察结果（相对峰面积）

由以上结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(在中峰面积2％以上)的峰面积基本一致(RSD＜3％)，又以第一份供试品溶液所得指纹图谱作为参照，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算后4份供试品溶液所得指纹图谱的相似度结果相似度均符合指纹图谱的技术要求。

以上方法学考察结果表明，本发明提供的消癥丸的指纹图谱检测方法，精密度、稳定性和重复性好，可以客观、全面、准确的评价消癥丸制剂质量，能更有效的保证成品的质量，对控制消癥丸制剂的质量和保证临床疗效具有重要意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取消癥丸制剂内容物细粉，精密称取1.0g至50ml锥形瓶中，精密加入浓度为90%乙醇溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，静置放冷，用浓度90%乙醇补足失重，减压回收乙醇，浓缩，上AB-8大孔吸附树脂柱，分别用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇，按每小时3-4倍柱体积的流速洗脱，合并40%、60%、80%、95%乙醇洗脱液，减压浓缩，定容至10ml，吸取溶液，过0.45μm 滤膜， 即得；

(2)高效液相色谱法测定标准指纹图谱：取10至20批消癥丸制剂按步骤(1)的方法制备得到供试品溶液，按下列色谱条件获得10至20批消癥丸制剂的高效液相色谱图，以这10至20批消癥丸制剂指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为标准指纹图谱；

色谱条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相：乙腈和浓度为0.3％磷酸水，洗脱方式：梯度洗脱，检测波长：245 nm~254nm；柱温40℃~50℃；流速 0.8ml/min ~1ml/min；进样量50μl；

(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)制备得到的供试品溶液，按下列色谱条件获得供试品溶液指纹图谱；

色谱条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：A为乙腈和B为浓度为0.3％磷酸水；洗脱方式：梯度洗脱；检测波长：245 nm ~254nm；柱温40℃~50℃；流速 0.8ml/min ~1ml/min；进样量50μl；

取步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的标准指纹图谱用相似度软件评价。

2.根据权利要求1所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述的梯度洗脱方式如下表：

时间/分钟 流动相A体积百分比 流动相B体积百分比 0-5 10~12 90~88 5-10 12~12 88~88 10-30 12~16 88~84 30-33 16~19 84~81 33-45 19 81~81 45-51 19~24.2 81~75.8 51-58 24.2~24.2 75.8~75.8 58-65 24.2~30 75.8~70 65-85 30~38.5 70~61.5 85-90 38.5 61.5 90-96 38.5~65 61.5~35 96-101 65~68 35~32 101-105 68~95 32~5 105-110 100 0

 。

3.根据权利要求1所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述的色谱条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：A为乙腈和B为浓度为0.3％磷酸水；洗脱方式：梯度洗脱；检测波长：254nm；柱温40℃；流速 0.8ml/min；进样量50μl。

4.根据权利要求1所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述的色谱柱为Waters Xbridge C-18色谱柱。

5.根据权利要求1所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述的供试品溶液指纹图谱和标准指纹图谱的相似度大于0.9。

6.根据权利要求1所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)检测时间为110分钟。

7.根据权利要求1所述的消癥丸制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述的相似度软件为中国药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版。

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