CN103983704B - 一种消症丸制剂的指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种消症丸制剂的HPLC指纹图谱检测方法，该方法包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、各原料药与成品之间的相关性的测定；用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，计算供试品相对保留时间和相对峰面积，即得消症丸制剂HPLC指纹图谱。由此方法得到的消症丸制剂HPLC指纹图谱在254nm下归属于柴胡、香附、大黄、川芎、莪术、当归、白芍、浙贝母、王不留行和青皮的特征峰分别有4个、4个、17个、7个、5个、7个、11个、4个、6个、11个。经实验验证表明，本发明提供的指纹图谱检测方法，灵敏度和精密度高，稳定性和重复性好，相似度高，可以客观、全面、准确的评价该消症丸制剂的质量，对保证临床药效具有重要意义。

Description

一种消症丸制剂的指纹图谱检测方法

优先权

对于本申请，申请人要求在中国申请的专利，申请日为2013年7月30日，申请号为201310325229.8的优先权。

技术领域

本发明涉及一种中药制剂的质量检测方法，具体涉及一种消症丸制剂的指纹图谱检测方法。

背景技术

消症丸是由河南中医学院老中医赵俊学老师在明代张介宾《景岳全书》中柴胡疏肝散的基础上，根据乳腺增生病的发病机理加减而成，在临床中应用几十年，对乳腺增生症的疗效确切。该方由柴胡、香附、大黄、青皮、川芎、当归、白芍、莪术、土鳖虫、浙贝母、王不留行十一味药材组成，具有舒肝行气、活血化痰、软坚散结的功效。主治气滞血瘀痰凝所致的乳腺增生病。症见乳房肿块，乳房胀痛或刺痛，可伴胸胁疼痛，善郁易怒，胸闷，脘痞纳呆，月经量少色暗，经行腹痛。舌暗红或有瘀点、瘀斑，苔薄白或白腻。脉弦或涩。

现有检测方法(专利ZL201110058699.3)对该产品中柴胡、香附、大黄、青皮、浙贝母、白芍6味药材进行薄层鉴别以及对大黄药材中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚进行HPLC含量测定。该方法步骤繁琐，且消症丸制剂由十一味药材组成，仅仅测定其中的一味药材含量不足以全面对该复方的制剂的质量进行控制。现有方法没有对其中主要多味药材中的化学成分进行全面、系统的检测，因此不能全面监控中间体、成品的质量。

近年来，中药指纹图谱技术已日渐成熟，能够很好的控制药品的质量，保证药品的有效性和质量可控性，已经成为一种业内公认的、可靠的、高效的技术手段，是中药质量控制的发展趋势。

因此，为了更全面、有效的控制该消症丸制剂的质量，提高其质量控制水平，让临床用药安全及疗效更加有所保证，很有必要在现有技术的基础之上研究设计出 一种能客观、准确，全面检测消症丸制剂质量的指纹图谱测定方法。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种通过HPLC指纹图谱对消症丸制剂进行检测的方法，本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种精密度高，重复性和稳定性好，能客观、全面、准确的评价消症丸制剂质量的指纹图谱检测方法，能更有效的保证成品的质量，对控制消症丸制剂的质量具有重要作用。该方法采用HPLC梯度洗脱在一个流动相系统首次同时检出复方中十味药材成分，从色谱峰的特征和相似度结果判断消症丸制剂的样品合格与否，从整体上全面反映消症丸所用药材内在质量，不仅能全面反映消症丸制剂成品的质量，还可根据成品、半成品的指纹图谱变化追根溯源寻找工艺操作中的问题。本发明还提供了消症丸制剂的标准指纹图谱。

技术的方案：为了实现以上目的，本发明的通过HPLC指纹图谱对消症丸制剂进行检测的方法包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取消症丸制剂内容物细粉1.0g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入浓度为90％乙醇溶液50ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，静置放冷，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩，上AB-8大孔吸附树脂柱，分别用400ml水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、95％乙醇，按每小时3～4倍柱体积的流速洗脱，合并40％、60％、80％、95％乙醇洗脱液，减压浓缩，加甲醇定容至10ml，吸取溶液，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：精密称取芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚适量，加甲醇溶解，分别制成芍药苷浓度为36μg/ml、阿魏酸浓度为56.3μg/ml、橙皮苷浓度为42μg/ml、大黄酸浓度为24.6μg/ml、大黄素浓度为29.8μg/ml、芦荟大黄素浓度为51.6μg/ml、大黄素甲醚浓度为38.6μg/ml、大黄酚浓度为26μg/ml的对照品溶液；

(3)消症丸制剂HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各50μl，进样，用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，计算供试品相对保留时间和相对峰面积，即得消症丸制剂HPLC指纹图谱；

色谱条件为：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为乙腈，B相为0.3％磷酸水，梯度洗脱；检测波长：245nm～254nm；柱温35℃～45℃； 流速0.8ml/min～1ml/min。

色谱条件的筛选：本发明分别对色谱柱、洗脱系统、洗脱程序、柱温、检测波长进行了筛选。

色谱柱的筛选：分别筛选色谱柱1：Xbridge C₁₈(4.6×250mm,5μm,Waters)；色谱柱2：ODS Hypersil C₁₈(4.6×250mm,5μm,Thermo)；色谱柱3：ODS-2C₁₈(4.6×250mm,5μm,Hedera)。根据色谱峰的分离情况和总峰数，优选色谱柱1：Xbridge C₁₈(4.6×250mm,5μm,Waters)色谱柱。

洗脱系统的筛选：本发明分别筛选洗脱系统：1：甲醇-水；2：乙腈-水；3：乙腈-0.1％磷酸；4：乙腈-0.2％磷酸；5：乙腈-0.3％磷酸。根据色谱峰分离效果和峰型等，优选5：乙腈-0.3％磷酸为最终洗脱系统。

洗脱程序的筛选：本发明以乙腈-0.3％磷酸做流动相，筛选了程序1-6的洗脱程序，以乙腈百分比表示，括号内表示时间(min):

程序1：10％(0)～18.4％(9)～18.4％(23)～20.5％(26)～20.5％(33)～24.2％(39)～24.2％(46)～39.4％(55)～43％(68)～43％(77)～90％(87)

程序2：10％(0)～18.4％(23)～20.5％(26)～20.5％(33)～24.2％(39)～24.2％(43)～39.4％(52)～43％(70)～90％(80)

程序3：10％(0)～18.4％(23)～20.5％(26)～20.5％(33)～24.2％(39)～24.2％(43)～39.4％(52)～43％(90)～90％(95)

程序4：10％(0)～18.4％(23)～20.5％(26)～20.5％(33)～24.2％(39)～24.2％(43)～30％(49)～39.4％(63)～43％(73)～90％(90)

程序5：10％(0)～14.4％(10)～14.4％(15)～18.4％(25)～20.5％(27)～20.5％(45)～24.2％(50)～30％(56)～39.4％(76)～43％(90)～90％(110)

程序6：10％(0)～12％(5)～12％(10)～16％(30)～19％(33)～19％(45)～24.2％(51)～24.2％(58)～30％(65)～38.5％(85)～38.5％(90)～65％(96)～68％(101)～95％(105)～100％(110)

根据色谱图的分离效果，优选程序6：10％(0)～12％(5)～12％(10)～16％(30)～19％(33)～19％(45)～24.2％(51)～24.2％(58)～30％(65)～38.5％(85)～38.5％(90)～65％(96)～68％(101)～95％(105)～100％(110)为最终洗脱程序。

柱温的筛选：本发明筛选了35℃和40℃柱温，根据色谱峰分离效果及分离时间， 优选40℃为最终柱温。

检测波长的筛选：本发明筛选了230nm、254nm、280nm、316nm和360nm的波长，根据色谱峰分离效果和峰数优选254nm为最终检测波长。

消症丸制剂HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各50μl，进样，用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，计算供试品相对保留时间和相对峰面积，即得消症丸制剂HPLC指纹图谱；

作为优选的方案，以上所述的消症丸制剂的指纹图谱检测方法，步骤(4)所述的色谱柱为Xbridge C₁₈(4.6×250mm,5μm,Waters)色谱柱；

作为优选的方案，以上所述的消症丸制剂的指纹图谱检测方法，步骤(4)所述的洗脱系统为乙腈-0.3％磷酸；

作为优选的方案，以上所述的消症丸制剂的指纹图谱检测方法，步骤(4)所述的梯度洗脱程序如下表：

作为优选的方案，以上所述的消症丸制剂的指纹图谱检测方法，检测波长优选254nm；色谱柱柱温为40℃；流动相流速为0.8mL/min；检测时间为110分钟；

作为优选的方案，以上所述的消症丸制剂的指纹图谱检测方法，参照峰为芦荟大黄素；

作为更优选的方案，供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A版》进行评价，各检测波长下的相似度均大于0.90；

本发明消症丸制剂HPLC指纹图谱的构建方法得到的HPLC指纹图谱，其特殊之处在于，其成分之一的柴胡、香附、大黄、青皮、川芎、莪术、浙贝母、当归、白芍、王不留行十味药材的HPLC指纹图谱的构建方法，与消症丸制剂具有相同的检测条件并分别得到各自药材的指纹图谱。

本发明所述的消症丸制剂的原料药材的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：

别取消症丸制剂的原料药材柴胡、香附、大黄、青皮、川芎、莪术、浙贝母、当归、白芍和王不留行，粉碎至细粉，过60目筛，分别取1.0g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入90％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30min，静置放冷，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩，浓缩液上AB-8大孔吸附树脂柱，分别用400ml水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、95％乙醇，按每小时3-4倍柱体积的流速洗脱，合并40％、60％、80％、95％乙醇洗脱液，减压浓缩，加甲醇定容至10ml，吸取溶液，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得各原料药材的供试品溶液；

(2)各原药材HPLC指纹图谱测定：分别精密吸取步骤(1)各原料药材的供试品溶液50μl，进样，用高效液相色谱仪测定各原料药材的指纹图谱；

色谱条件为：色谱柱：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：A相为乙腈，B相为0.3％磷酸水，梯度洗脱，检测波长：254nm；柱温40℃；流速0.8ml/min；所述的梯度洗脱条件为：

本发明消症丸制剂HPLC指纹图谱的构建方法得到的HPLC指纹图谱，所述消症丸制剂HPLC指纹图谱在254nm下归属于柴胡的指纹图谱具有4个特征峰；归属于香附的指纹图谱具有4个特征峰；归属于大黄的指纹图谱具有17个特征峰；归属于川芎的指纹图谱具有7个特征峰；归属于莪术的指纹图谱具有5个特征峰；归属于当归的指纹图谱具有7个特征峰；归属于白芍的指纹图谱具有11个特征峰；归属于浙贝母的指纹图谱具有4个特征峰；归属于王不留行的指纹图谱具有6个特征峰；归属于青皮的指纹图谱具有11个特征峰。所述图谱的图形如说明书附图中图1、图2和/或图6中所示的图谱。

本发明的目的还可以通过以下措施来达到：这种利用消症丸制剂HPLC指纹图谱的检测方法得到的HPLC指纹图谱，其特殊之处在于：

所述消症丸制剂HPLC指纹图谱254nm的共有峰为(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(25)、(26)、(27)、(28)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)33个峰；其中，归属于柴胡的共有峰为(1)、(2)、(13)、(14)4个峰；归属于香附的共有峰(1)、(15)、(16)、(25)4个峰；归属于大黄的共有峰为(1)、(2)、(3)、(7)、(8)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(23)、(25)、(27)、(30)、(31)、(32)、(33)17个峰；归属于青皮的共有峰为(1)、(2)、(3)、(6)、(8)、(10)、(22)、(24)、(25)、(28)、(30)11个峰；归属于川芎的共有峰为(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、(12)、(29)7个峰；归属于莪术的共有峰为(2)、(12)、(13)、(22)、(29)5个峰；归属于浙贝母的共有峰为(2)、(6)、(9)、(20)4个峰；归属于当归的共有峰为(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、(12)、(18)共7个峰；归属于白芍的共有峰为(1)、(2)、(3)、(4)、(7)、(8)、(9)、(11)、(12)、(15)、(21)共11个峰；归属于王不留行的共有峰为(2)、(3)、(6)、(9)、(12)、(14)6个峰；所述图谱的图形如说明书附图中图1、图2和/或图6所示的图谱。

利用各对照品对HPLC指纹图谱主要峰进行比较确定：4号峰为芍药苷、5号峰为阿魏酸、10号峰为橙皮苷、23号峰为芦荟大黄素、27号峰为大黄酸、31号峰为大黄素、32号峰为大黄酚、33号峰为大黄素甲醚。

本发明提供的消症丸制剂的HPLC指纹图谱的检测方法相比现有技术具有以下优点：

1、本发明选用HPLC作为消症丸制剂的检测方法，以超声法为提取方法，以大孔树脂富集为纯化方法，条件简便，具有良好的可操作性，易于推广。

2、本发明采用的HPLC梯度洗脱条件在一个流动相系统首次同时检出消症丸制剂10味药材，不仅包括了现有技术中消症丸制剂质量控制的所有指标，而且有所提高，能更准确、全面地表达该产品的特征。

3、本发明的消症丸制剂的检测方法，其测定的精密度试验、重复性试验、稳定性试验的相似度评价都表明，该方法检测结果准确、稳定性高。

4、本发明的消症丸制剂的检测方法对有效成分既能定性又能定量，可适用于监控消症丸的原料药材、中间体半成品的质量以及生产工艺的质量控制，适用范围广。

附图说明

图1为消症丸制剂254nm的HPLC参照指纹图谱。

图2为混标254nm的HPLC指纹图谱。

图3为254nm下消症丸制剂精密度试验相似度评价结果示意图。

图4为254nm下消症丸制剂重复性试验相似度评价结果示意图。

图5为254nm下消症丸制剂稳定性试验相似度评价结果示意图。

图6为消症丸制剂指纹图谱各成分峰归属图谱。

该图中字母分别代表：a柴胡；b香附；c大黄；d青皮；e川芎；f莪术；g浙贝母；h当归；i白芍；j王不留行

图7为254nm下消症丸制剂批间相似度评价结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例消症丸HPLC指纹图谱的构建方法及消症丸HPLC指纹图谱

1、仪器与试药 

1.1仪器

美国Waters e2695高效液相色谱系统(包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器waters2998和柱温箱CTO-20A,Empower色谱工作站)； 电子分析天平(FA1204B，上海精密科学有限公司)；万分之一电子天平(FA1204B，上海精密科学仪器有限公司)；超声波清洗机(AS20500A，Auto Science)；Xbridge C₁₈分析柱(4.6×250mm,5μm,Waters,USA)。

1.2试药

对照品：芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚

对照药材：柴胡、香附、大黄(酒炙)、炒青皮、川芎、莪术、浙贝母、当归、白芍、炒王不留行十味药材，由雷允上药业有限公司提供。

消症丸制剂：雷允上药业有限公司产品，国药准字Z20100057，为丸剂，每丸重0.3g，相当于原药材0.1g。

2、方法与结果 

2.1色谱条件

色谱柱：Waters Xbridge C₁₈分析柱(4.6×250mm；5μm，Waters公司)

流动相：乙腈(A)-浓度为0.3％磷酸(B)，梯度洗脱，洗脱程序见表1

检测波长：254nm；柱温：40℃；流速：0.8ml/min；

表1梯度洗脱程序

2.2指纹图谱制备 

2.2.1供试品溶液的制备：取消症丸1.0g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入浓度为90％乙醇溶液50ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，静置放冷，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩，上AB-8大孔吸附树脂柱，分别用400ml水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、95％乙醇，按每小时3～4倍柱体积的流速洗脱，合并40％、60％、80％、95％乙醇洗脱液，减压浓缩，加甲醇定容至10ml，吸取溶液，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；

2.2.2对照品溶液的制备：精密称取芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚适量，加甲醇溶解，分别制成芍药苷浓度为36μg/ml、阿魏酸浓度为56.3μg/ml、橙皮苷浓度为42μg/ml、大黄酸浓度为24.6μg/ml、大黄素浓度为29.8μg/ml、芦荟大黄素浓度为51.6μg/ml、大黄素甲醚浓度为38.6μg/ml、大黄酚浓度为26μg/ml的对照品溶液；

2.2.3消症丸HPLC指纹图谱测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各50μl，进样，用高效液相色谱仪测定，即得消症丸HPLC指纹图谱见附图1，混标的指纹图谱见附图2。

2.2.4主要峰的定性：通过与对照品比较确定，其中4号峰为芍药苷，5号峰为阿魏酸，10号峰为橙皮苷，23号峰为芦荟大黄素，27号峰为大黄酸，31号峰为大黄素，32号峰为大黄酚，33号峰为大黄素甲醚。

2.3指纹图谱精密度试验

2.3.1取同一消症丸溶液，连续进样5次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹 图谱相似度评价系统2004A版》软件进行数据处理：以5批供试品指纹图谱作为样本集，经软件系统生成对照图谱(Standard Chromatographie Project，采用中位数法，时间宽度：0.01)，以此为基准，计算样本图谱与对照图谱的相似度，结果显示仪器精密度良好，相似度均大于0.9，见表2，附图3。

表2指纹图谱精密度试验的相似度结果

2.4指纹图谱重现性试验

2.4.1取同一批消症丸5份，按供试品溶液制备项下方法制备，分别进样，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行数据处理：以5批供试品溶液指纹图谱作为样本集，经软件系统生成对照图谱(Standard Chromatographie Project，采用中位数法，时间宽度：0.01)，以此为基准，计算样本图谱和对照图谱的相似度，结果显示样品重复性良好，相似度均大于0.90，见表3，附图4。

表3指纹图谱重复性试验的相似度结果

2.5指纹图谱稳定性试验：

2.5.1取一个编号的消症丸样品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24小时进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行数据处理：以7批供试品溶液指纹图谱作为样本集，经软件系统生成对照图谱(Standard Chromatographie Project，采用中位数法，时间宽度：0.01)，以此为基准，计算样本图谱和对照图谱的相似度，结果显示样品稳定性良好，相似度均大于0.90，见表4，附图5。

表4指纹图谱稳定性试验的相似度结果

2.6成品与各原料药材的相关性及特征峰归属

2.6.1供试品溶液的制备：取各药材粉碎至细粉过60目筛，取约1.0g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入90％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，静置放冷，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩，上AB-8大孔吸附树脂柱，分别用400ml水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、95％乙醇，按每小时3-4倍柱体积的流速洗脱，合并40％、60％、80％、95％乙醇洗脱液，减压浓缩，加甲醇定容至10ml，吸取溶液，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；

2.6.2各原药材HPLC指纹图谱测定：分别精密吸取各原药材溶液50μl，进样，用高效液相色谱仪测定，见表5，附图6。

表5各特征峰的归属 

所述消症丸制剂HPLC指纹图谱254nm的共有峰为(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(25)、(26)、(27)、(28)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)33个峰；其中，归属于柴胡的共有峰为(1)、(2)、(12)、(13)4个峰；归属于香附的共有峰(1)、(15)、(16)、(25)4个峰；归属于大黄的共有峰为(1)、(2)、(3)、(7)、(8)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(23)、(25)、(27)、(30)、(31)、(32)、(33)17个峰；归属于青皮的共有峰为(1)、(2)、(3)、(6)、(8)、(10)、(22)、(24)、(25)、(28)、(30)11个峰；归属于川芎的共有峰为(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、(12)、(29)7个峰；归属于莪术的共有峰为(2)、(12)、(13)、(22)、(29)5个峰；归属于浙贝母的共有峰为(2)、(6)、(9)、(20)4个峰；归属于当归的共有峰为(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、(12)、(18)共7个峰；归属于白芍的共有峰为(1)、(2)、(3)、(4)、(7)、(8)、(9)、(11)、(12)、(15)、(21)共11个峰；归属于王不留行的共有峰为(2)、(3)、(6)、(9)、(12)、(14)6个峰。

2.7批间相似度评价

2.7.1供试品溶液的制备：取11批不同批号的消症丸，各精密称取1.0g，按药材样品溶液制备项下方法制备，分别进样，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系 统2004A》软件进行数据处理：以11批供试品溶液指纹图谱作为样品集，经软件系统生成对照图谱，以此为基准，计算样本图谱与对照图谱的相似度，评价批次间稳定性，结果显示11批样品的相似度良好，均在0.9以上，见表7，附图7。

2.7.2指纹图谱条件：

色谱柱：Waters Xbridge C₁₈分析柱(4.6×250mm；5μm，Waters公司)

流动相：乙腈(A)-浓度为0.3％磷酸(B)，梯度洗脱，洗脱程序见表1

检测波长：254nm；柱温：40℃；流速：0.8ml/min；

表7十一批消症丸指纹图谱相似度考察结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种消症丸制剂的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取消症丸制剂内容物细粉1.0g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入浓度为90％乙醇溶液50ml，在功率250W，频率40kHz下超声处理30分钟，静置放冷，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩，上AB-8大孔吸附树脂柱，分别用400ml水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、95％乙醇，按每小时3～4倍柱体积的流速洗脱，合并40％、60％、80％、95％乙醇洗脱液，减压浓缩，加甲醇定容至10ml，吸取溶液，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：精密称取芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚适量，加甲醇使溶解，分别制成芍药苷浓度为36μg/ml、阿魏酸浓度为56.3μg/ml、橙皮苷浓度为42μg/ml、大黄酸浓度为24.6μg/ml、大黄素浓度为29.8μg/ml、芦荟大黄素浓度为51.6μg/ml、大黄素甲醚浓度为38.6μg/ml、大黄酚浓度为26μg/ml的对照品溶液；

(3)消症丸制剂HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各50μl，进样，用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，计算供试品相对保留时间和相对峰面积，即得消症丸制剂HPLC指纹图谱；

色谱条件为：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为乙腈，B相为0.3％磷酸水，梯度洗脱；检测波长：245nm～254nm；柱温35℃～45℃；流速0.8ml/min～1ml/min；

所述的梯度洗脱条件为：

2.根据权利要求1所述的消症丸制剂的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的色谱条件为：色谱柱：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：A相为乙腈，B相为0.3％磷酸水，梯度洗脱，检测波长：254nm；柱温40℃；流速0.8ml/min。

3.根据权利要求1所述的消症丸制剂的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(3)参照峰为芦荟大黄素峰；所述的供试品指纹图谱采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版进行评价，各检测波长下的相似度均大于0.9；在254nm下利用各对照品对主要峰进行比较确定：4号峰为芍药苷、5号峰为阿魏酸、10号峰为橙皮苷、23号峰为芦荟大黄素、27号峰为大黄酸、31号峰为大黄素、32号峰为大黄酚、33号峰为大黄素甲醚。

4.根据权利要求1所述的消症丸制剂的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，所述的色谱柱的规格为4.6×250mm，5μm的Waters Xbridge C₁₈反相色谱柱。

5.消症丸制剂的原料药材的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别取消症丸制剂的原料药材柴胡、香附、大黄、青皮、川芎、莪术、浙贝母、当归、白芍和王不留行，粉碎至细粉，过60目筛，分别取1.0g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入90％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30min，静置放冷，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩，浓缩液上AB-8大孔吸附树脂柱，分别用400ml水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、95％乙醇，按每小时3-4倍柱体积的流速洗脱，合并40％、60％、80％、95％乙醇洗脱液，减压浓缩，加甲醇定容至10ml，吸取溶液，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得各原料药材的供试品溶液；

(2)各原药材HPLC指纹图谱测定：分别精密吸取步骤(1)各原料药材的 供试品溶液50μl，进样，用高效液相色谱仪测定各原料药材的指纹图谱；

色谱条件为：色谱柱：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：A相为乙腈，B相为0.3％磷酸水，梯度洗脱，检测波长：254nm；柱温40℃；流速0.8ml/min；所述的梯度洗脱条件为：