CN104965033B - 一种苍柏袪痛制剂hplc指纹图谱的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种苍柏袪痛制剂HPLC指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：（1）所述苍柏袪痛制剂用乙腈‑磷酸提取，得到供试品溶液；（2）供试品溶液上高效液相色谱仪检测得到HPLC指纹图谱，色谱条件为：色谱柱：C18柱，检测波长：284nm，以乙腈‑0.1wt%磷酸为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱时流动相中乙腈的体积比随时间变化为：0‑15min，10‑18%；15‑30min，18‑50%；30‑35min，50%。该方法对各批次药品的共有峰具有良好的精密度、稳定性、重复性，其相对保留时间和相对峰面积的RSD值以及非共有峰总面积占总峰面积比值均符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》要求。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂质量检测领域，具体涉及一种苍柏袪痛制剂HPLC（高效液相色谱）指纹图谱的测定方法。
背景技术
苍柏袪痛散组方源于甘肃省名老中医贾奇峰的经典验方，主要由苍术（麸炒）、黄柏、赤芍、防己等多味药组成，具有清热利湿，祛瘀降浊，通络止痛之效。该药临床上常与别嘌醇联合使用，以缓解痛风急性发作期的红、肿、热、痛症状，还可进一步稳定痛风患者血尿酸水平从而控制痛风复发。然而，联合使用的别嘌醇毒副作用大，容易产生皮疹，腹泻、恶心、呕吐、胃痛，手脚麻木、刺痛，过敏性血管炎等不良反应，此外苍柏袪痛散存在容易吸湿结块、药物稳定性差、具有不良气味、患者服用剂量大，导致患者依从性差等缺点，所以新的制剂开发势在必行。
兰州市肺科医院制剂室对该苍柏袪痛散组方进行改进，研制出一种苍柏袪痛制剂，其由以下中药材的有效成分组成：苍术7.5-30重量份、黄柏7.5-30重量份、川牛膝5-20重量份、防己6-24重量份、赤芍6-24重量份、牡丹皮6-24重量份、细辛2.5-10重量份、苦参7.5-30重量份、秦艽6-24重量份、松节7.5-30重量份、萆薢7.5-30重量份、紫草5-20重量份、黄花菜7.5-30重量份、甘草1-4重量份。如何使成批生产的苍柏袪痛制剂达到质量稳定、安全可控，是实现其产业化生产急需解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的提供一种苍柏袪痛制剂HPLC指纹图谱的测定方法。
本发明实现上述目的所采用的技术方案如下：
一种苍柏袪痛制剂HPLC指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：
（1）所述苍柏袪痛制剂用乙腈-磷酸提取，得到供试品溶液；
（2）供试品溶液上高效液相色谱仪检测得到HPLC指纹图谱，色谱条件为：色谱柱：C18柱，检测波长：284nm，以乙腈-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱时流动相中乙腈的体积比随时间变化为：0-15min，10-18%；15-30min，18-50%；30-35min，50%。
进一步，步骤（1）中乙腈与磷酸的体积比为(36～500:(50～64)。
优选地，所述乙腈与磷酸的体积比为36:64。
优选地，步骤（1）所述磷酸的浓度为0.1～0.2%。
进一步，步骤（1）所述提取的方式为加热回流提取或超声波提取。
进一步，所述苍柏袪痛制剂由以下中药材的有效成分组成：
苍 术 7.5-30重量份 黄 柏 7.5-30重量份
川牛膝 5-20重量份 防 己 6-24重量份
赤 芍 6-24重量份 牡丹皮 6-24重量份
细 辛 2.5-10重量份 苦 参 7.5-30重量份
秦 艽 6-24重量份 松 节 7.5-30重量份
萆 薢 7.5-30重量份 紫 草 5-20重量份
黄花菜 7.5-30重量份 甘 草 1-4重量份。
进一步，所述HPLC指纹图谱特征峰归属的鉴定：
取盐酸黄柏碱、龙胆苦苷、芍药苷、粉防己碱、盐酸小檗碱对照品，用乙腈-磷酸溶解，制成混合对照品溶液；
按苍柏袪痛制剂的中药材组成，分别制备不含黄柏、苦参、秦艽、防己、赤芍的阴性样品，再用乙腈-磷酸提取，得到阴性样品溶液；
将阴性样品溶液以及混合对照品溶液上高效液相色谱仪检测，分别得到阴性样品和对照品的图谱；
根据供试品、阴性样品和对照品的图谱确定HPLC指纹图谱特征峰的归属。
附图说明
图1为对照品、样品、阴性样品的HPLC指纹图谱；
图2样品的HPLC指纹图谱；
图3为10批次样品的HPLC指纹图谱。
具体实施方式
下述实施例只是用于说明本发明而不是限制本发明。实施例中所用的试剂和仪器如未进行特别说明，均为可从一般商业渠道获得的常规试剂和仪器。
实验例：苍柏袪痛制剂HPLC指纹图谱的测定
1 材料和方法
1.1仪器与试药
高效液相色谱仪（Waters 2695，美国），PDA检测器（Waters 2998），Empower3色谱工作站，色谱柱Waters XSELECT CSH-C18(4.6 mm×150 mm，5μm)。
盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212 ），盐酸黄柏碱对照品（批号111895-201202），龙胆苦苷（批号110770-201314），芍药苷（批号110736-201438），粉防己碱（批号110711-200708）均购自中国食品药品检定研究院，苍柏袪痛制剂(胶囊)（兰州市肺科医院制剂室生产，批号分别为20130828、20130925、20131017、20131126、20131218、20140121、20140226、20140312、20140415、20140513）。乙腈为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。
1.2方法
1.2.1色谱条件
1.2.1.1 色谱条件的建立
以盐酸黄柏碱为考察指标，比较不同洗脱方式、流动相组成和比例下，盐酸黄柏碱的含量和各个目标峰的分离度，从而建立指纹图谱分析方法的色谱条件。即取本品样品，混匀，研细，取约2g，精密称定，用甲醇-水（36:64）超声处理（功率250 W，频率50kHz）45分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇-水（36:64）补足减失的重量，混匀，滤纸滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
1.2.1.2 提取方法的建立
在1.2.1.1建立的色谱条件下测定盐酸黄柏碱含量，考察不同提取方法和不同提取溶剂的差异。
1.2.1.3检测波长的确定
对样品全波长扫描，其中盐酸黄柏碱λmax=284nm、龙胆苦苷λmax=254nm、芍药苷λmax=274.8nm和230nm、粉防己碱λmax=280nm、盐酸小檗碱λmax=265nm。提取不同吸收波长的色谱图，选择最佳检测波长。
1.2.2 方法学考察
1.2.2.1供试品溶液的制备
取装量差异项下的本品样品，混匀，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈-0.1%磷酸（36:64，V/V）25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用乙腈-0.1%磷酸（36:64）补足减失的重量，混匀，用定量滤纸过滤，弃去初滤液，收集续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
1.2.2.2 阴性样品溶液的制备
按苍柏袪痛制剂的处方分别制备不含黄柏、苦参、秦艽、防己、赤芍提取物的阴性样品，按“1.2.2.1”项下供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
1.2.2.3 对照品溶液的制备
精密称取对照品盐酸黄柏碱、龙胆苦苷、芍药苷、粉防己碱、盐酸小檗碱适量，分别用乙腈-0.1%磷酸（36:64）溶解，配成浓度分别为1.880、1.920、27.400、1.100、1.056mg·mL-1的单一对照品溶液。分别吸取各对照品溶液0.4mL、3.0mL、0.2mL、1.0mL、1.4mL置10 mL量瓶中，以乙腈-0.1%磷酸（36:64）定容，摇匀，得质量浓度分别为0.0752mg·mL-1盐酸黄柏碱、0.5760 mg·mL-1的龙胆苦苷、0.548mg·mL-1的芍药苷、0.110mg·mL-1粉防己碱和0.1478mg·mL-1盐酸小檗碱混合对照品溶液。
1.2.2.4 精密度试验
取同一批号苍柏袪痛制剂的供试品溶液，连续进样6次，以龙胆苦苷作为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性。
1.2.2.5 重复性试验
取同一批号苍柏袪痛制剂供试品5份，每份2.0g，按“1.2.2.1”项下所述方法制备供试品溶液，进样测定。
1.2.2.6 稳定性试验
取同一批号苍柏袪痛制剂的供试品溶液，分别在0，2，4， 8，12，16，24 h进样测定。
1.2.3指纹图谱建立
1.2.3.1 HPLC指纹图谱的测定
取10批（S1：20130828、S2：20130925、S3：20131017、S4：20131126、S5：20131218、S6：20140121、S7：20140226、S8：20140312、S9：20140415、S10：20140513）苍柏袪痛制剂样品，按“1.2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在已确定的色谱条件下进样分析，即得样品HPLC指纹图谱。
分别将不含黄柏、苦参、秦艽、防己、赤芍提取物的阴性样品以及对照品按上述色谱条件测定。
1.2.3.2 共有峰的确定
根据10批苍柏袪痛制剂样品的图谱找出共有峰，选择保留时间适中，峰面积适宜，重现性好的共有峰做为参照峰，将其保留时间和色谱峰面积记为1，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
根据阴性样品以及对照品的图谱对上述找出的共有峰进行归属确认。
1.2.3.3 样品相似度评价
将实验数据导入国家药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版”计算软件，采用夹角余弦法计算10批苍柏袪痛制剂样品之间指纹图谱的相似度(以全图谱的峰计算)。一般情况下，相似度大于0.9即认为相似度良好。
2.结果
2.1色谱条件
2.1.1色谱条件的建立
表1 通过不同流动相测定的盐酸黄柏碱含量（μg/g）（n=3）
注：
1、梯度洗脱方式1：0-15 min，10-18%A；15-30min，18-50%A；30-35min，50% A。
2、梯度洗脱方式2：0-15 min，10-30%A；15-30min，30-50%A；30-35min，50% A。
3、梯度洗脱方式3：0-15 min，10-50%A；15-30min，50-80%A；30-35min，80% A。
4、“0-15 min，10-50%A”表示从第0至第15分钟，流动相中A的体积比由10%线性变化至50%，其它的依此类推。
5、柱温30℃，流速为1.0 mL·min-1，检测波长284 nm，进样量10μL。
流动相采用甲醇-水或乙腈-水时，除盐酸黄柏碱以外的其他目标峰分离度均差，且当流动相为甲醇-水（50:50，V/V）时，盐酸黄柏碱峰形差无法计算其含量。而当水相改为磷酸后，盐酸黄柏碱峰形明显改善，且梯度洗脱明显优于等度洗脱。在梯度洗脱中，乙腈(A)体积比例变化过快时，盐酸黄柏碱的分离度R<1.5，无法计算其含量。其中采用乙腈-0.2wt%磷酸时，目标峰分离均好，但粉防己碱的特征峰出现拖尾，且磷酸浓度过高易出现色谱柱堵塞情况。故选择乙腈-0.1wt%磷酸作为流动相进行梯度洗脱（0-15 min，10-18%A；15-30min，18-50%A；30-35min，50% A），见表1。
2.1.2提取条件的建立
表2 通过不同提取方法测定的盐酸黄柏碱含量（μg/g）（n=3）
用不同提取方法发现，加热回流方法和超声法所提取的盐酸黄柏碱含量相当。加热回流30分钟提取的盐酸黄柏碱含量均低于60和90分钟，而回流60分钟以后，盐酸黄柏碱含量波动小。考虑到超声提取30分钟耗能低、简便易行，优选采用超声提取法。
当提取溶剂为甲醇-水（50:50，V/V）时，所提取的盐酸黄柏碱含量最低；而当水相变为不同浓度的磷酸水溶液后，提取的盐酸黄柏碱含量随酸度增高而增高。为了保持提取溶剂与流动相的一致性，优选乙腈-0.1wt%磷酸（36:64，V/V）作为提取溶剂，见表2。
2.1.3检测波长的确定
通过对样品全波长扫描，发现在λ=284nm时五个目标成分都能有较好的响应并达到较好地分离。
综合上述2.1.1-2.1.3的结果，本实验的色谱条件：流动相为乙腈(A)-0.1wt%磷酸(B)，梯度洗脱0-15 min，10-18%A；15-30min，18-50%A；30-35min，50% A。样品用乙腈-0.1wt%磷酸（36:64，V/V）超声波提取30分钟。
2.2方法学考察结果
精密度实验结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD为0.098%～0.102%，相对峰面积的RSD为1.65%～2. 04%，表明精密度良好。
重复性结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD为0.037%～0.483%，各共有峰相对峰面积的RSD为1.354% ～1.135%，表明重复性良好。
稳定性结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.183%～1.478%和1.263% ～2.227%，表明供试品在24h内稳定。
2.3共有峰的确定
结果表明，10批样品指纹图谱的色谱峰均在35 min内全部出完，如图3所示。对所得图谱进行分析，选择稳定性好，吸收强（理论塔板数均不低于3000，分离度大于1.5），特征明显的色谱峰为共有峰，共标定了20个峰，见图2，其中2号峰、5号峰、8号峰、13号峰和15号峰为主要特征峰。根据阴性样品以及对照品的色图谱，确认：2、3、4、10、12、15号峰为黄柏提取物中成分，其中2号峰为盐酸黄柏碱，15号峰为盐酸小檗碱； 6、13号峰为防己提取物中成分，其中13号峰为粉防己碱， 5号峰为秦艽中的龙胆苦苷；1、17、18、19、20号峰为苦参提取物中成分；8、9号峰为赤芍提取物中成分，其中8号峰为芍药苷。7、11、14、16号峰未得到归属，应该为处方中其他药材的特征峰。
表3 10批苍柏袪痛制剂相对保留时间
表4 10批苍柏袪痛制剂相对峰面积
其中：表4中的“A%” 表示非共有峰总面积占总峰面积的比例（%）。
由表3和表4可以看出，10批苍柏袪痛制剂的各共有峰保留时间匹配较好，相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明此指纹图谱的色谱条件具有较好的适用性。按照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》的要求，各批药品共有指纹峰面积的比值均符合要求；非共有峰总面积占总峰面积<5%，也符合相关规定。
2.4样品相似度评价结果
表5 10批苍柏袪痛制剂样品相似度评价结果
样品相似度结果显示，相似度大于0.9即认为相似度良好。
3. 讨论
由于中药复方具有成分复杂、有效成分不确定等因素，目前中药制剂的含量测定指标如何选择一直难以统一。在质量标准的建立过程中，往往寻找易测定、含量高但可能与制剂疗效无关的化学成分作为检测指标。王翰华等人提出在选择含测指标时应组合考虑各药味所含的有效成分、特征成分、毒性成分等，建立多指标含量测定体系。
本项目组前期通过拆方药效学研究发现，依照兰州市肺科医院制剂室生产的苍柏袪痛制剂提取工艺制备缺黄柏、防己、秦艽和赤芍四味药的制剂几乎不具有原制剂的镇痛活性。通过文献调研也发现，黄柏中盐酸黄柏碱和小檗碱为其主要有效成分，具有抗菌消炎、抗痛风活性；秦艽具祛风湿、止痹痛的功效，而龙胆苦苷是其要活性成分。研究证明龙胆苦苷能明显抑制角叉菜胶所致的大鼠足趾肿胀反应，能加快炎症的消退；赤芍中所含芍药苷具有扩张血管、镇痛镇静、抗炎抗溃疡、解热解痉的药理作用；防己也具有抗炎镇痛、降血压、抗肿瘤、抗凝血等作用。故确定上述四味药物为制剂中的镇痛活性组分，而盐酸黄柏碱、龙胆苦苷、芍药苷、粉防己碱、盐酸小檗碱则可能为其主要特征成分。本实验就是结合主要药效和特征成分，建立该苍柏袪痛制剂HPLC指纹指纹图谱。
各批药品共有峰的精密度、稳定性、重复性，其RSD值和非共有峰总面积占总峰面积比值均符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》要求。
下列实施例均能实现上述实验例的效果
实施例1
苍柏袪痛胶囊（由黄柏1500g、苍术（麸炒）1500g、川牛膝1000g、防己1200g、赤芍1200g、牡丹皮1200g、细辛500g、苦参1500g、秦艽（麻花艽）1200g、松节1500g、萆薢1000g、黄花菜（生）1500g、甘草200g和紫草1000g粉碎，过筛，混匀，按药剂学常规胶囊制备方法制得）。
1、供试品溶液的制备
取10批上述胶囊样品，取装量差异项下的本品样品，混匀，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈-0.1wt%磷酸（36:64，V/V）25mL，密塞，称定重量，超声波处理（功率250 W，频率50kHz）30 分钟，取出，放冷，再称定重量，用乙腈-0.1%磷酸（36:64,V/V）补足减失的重量，混匀，用定量滤纸过滤，弃去初滤液，收集续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
2、对照品溶液的制备
精密称取盐酸黄柏碱、龙胆苦苷、芍药苷、粉防己碱、盐酸小檗碱对照品适量，分别用乙腈-0.1wt%磷酸（36:64，V/V）溶解，配成浓度分别为1.880、1.920、27.400、1.100、1.056mg·mL-1的单一对照品溶液。分别吸取各对照品溶液0.4mL、3.0mL、0.2mL、1.0mL、1.4mL置10 mL量瓶中，以乙腈-0.1%磷酸（36:64）定容，摇匀，得质量浓度分别为0.0752mg·mL-1盐酸黄柏碱、0.5760 mg·mL-1的龙胆苦苷、0.548mg·mL-1的芍药苷、0.110mg·mL-1粉防己碱和0.1478mg·mL-1盐酸小檗碱混合对照品溶液。
3、阴性样品溶液的制备
按治疗痛风中药胶囊的处方，分别制备不含黄柏、苦参、秦艽、防己、赤芍的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
4、HPLC指纹图谱的测定
HPLC指纹图谱的测定：取供试品溶液上HPLC仪，色谱条件：色谱柱Waters XSELECTCSH-C18(4.6 mm×150 mm，5μm)，柱温：30℃，流速为1.0 mL·min-1，检测波长284 nm，进样量10μL，流动相为乙腈(A)-0.1wt%磷酸(B)，梯度洗脱：0-15 min，10-18%A；15-30min，18-50%A；30-35min，50% A。
分别将不含黄柏、苦参、秦艽、防己、赤芍提取物的阴性样品以及对照品按上述色谱条件测定色谱图，如图1所示。
5. 共有峰的确定
10批胶囊样品指纹图谱的色谱峰均在35 min内全部出完。对所得图谱进行分析，选择稳定性好，吸收强（理论塔板数均不低于3000，分离度大于1.5），特征明显的色谱峰为共有峰，共标定了20个峰，其中2号峰、5号峰、8号峰、13号峰和15号峰为主要特征峰。根据阴性样品以及对照品的色图谱，确认：2、3、4、10、12、15号峰为黄柏提取物中成分，其中2号峰为盐酸黄柏碱，15号峰为盐酸小檗碱； 6、13号峰为防己提取物中成分，其中13号峰为粉防己碱， 5号峰为秦艽中的龙胆苦苷；1、17、18、19、20号峰为苦参提取物中成分；8、9号峰为赤芍提取物中成分，其中8号峰为芍药苷。
6. 样品相似度评价
将实验数据导入国家药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版”计算软件，采用夹角余弦法计算10批胶囊样品的指纹图谱的相似度，10批的相似度均大于0.9，相似度良好。
Claims (5)
1.一种苍柏袪痛制剂HPLC指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：
（1）所述苍柏袪痛制剂用乙腈-磷酸提取，得到供试品溶液；
（2）供试品溶液上高效液相色谱仪检测得到HPLC指纹图谱，色谱条件为：色谱柱：C18柱，检测波长：284nm，以乙腈-0.1wt%磷酸为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱时流动相中乙腈的体积比随时间变化为：0-15min，10-18%；15-30min，18-50%；30-35min，50%；
所述苍柏袪痛制剂由以下中药材的有效成分组成：
苍 术 7.5-30重量份 黄 柏 7.5-30重量份
川牛膝 5-20重量份 防 己 6-24重量份
赤 芍 6-24重量份 牡丹皮 6-24重量份
细 辛 2.5-10重量份 苦 参 7.5-30重量份
秦 艽 6-24重量份 松 节 7.5-30重量份
萆 薢 7.5-30重量份 紫 草 5-20重量份
黄花菜 7.5-30重量份 甘 草 1-4重量份。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（1）中乙腈与磷酸的体积比为(36～50):(50～64)。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述乙腈与磷酸的体积比为36:64。
4.根据权利要求2或3所述的测定方法，其特征在于，所述磷酸的浓度为0.1～0.2wt%。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（1）所述提取的方式为加热回流提取或超声波提取。
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