CN106324161B - 治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，所述治疗糖尿病肾病的中药组合物的有效成分主要由重量份比为0.5～1.5:1.5～2.5:0.5～1.5的黄芪、葛根和桑白皮制备而成，所述质量检测方法包括鉴别，所述鉴别包括采用薄层色谱法对所述桑白皮进行鉴别。本发明质量检测方法通过建立专属性强的鉴别以及进一步地建立重现性、稳定性及精密度良好的含量测定方法，能够有效控制本发明治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量，使本发明治疗糖尿病肾病的中药组合物质量达到稳定、可控、高效及安全。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种治疗糖病肾病的中药组合物的质量检测方法。
背景技术
糖尿病肾病(DKD)是糖尿病(DM)最主要的微血管并发症之一，为终末期肾病(ESRD)的首要病因。据统计，目前全球DM患者人数已达4.15亿，预计2040年将增至6.42亿，其中，20％～45％的DM患者将发生DKD。我国DM患者已经达1.1亿，且发病率逐年上升。2012年我国ESRD患者中19％是DKD导致，在日本、韩国、美国、澳大利亚等发达国家，这一比例高达38％～45.2％。DKD已成为威胁人类健康的重大社会问题，给社会和个人造成了巨大经济负担。
DKD的治疗，西医以控制血糖、控制血压、减少尿蛋白为主，还包括生活方式干预、纠正脂质代谢紊乱、治疗肾功能不全的并发症、透析治疗等。在一定程度上解决了DKD患者血压高及蛋白尿等临床问题，但均不能有效阻止疾病进展，甚至导致药源性肾病，部分药物的应用尚存在争议。且容易出现高钾血症、高肌酐血症等副作用，使用期间需严格监测血钾、血清肌酐水平，限制其临床使用。因此，开发能有效控制糖尿病肾病病程，毒副作用低的防治药物迫在眉捷。
中医药治疗糖尿病肾病历史悠久，有丰富的中药资源，完整的治疗理论体系和丰富的临床经验，其治疗通常在明确分期基础上分型辨证。其中，肾功能代偿期患者中本虚以气虚、阴虚或气阴两虚为主，标实可见血瘀、痰湿、湿浊；失代偿期患者中本虚多见阳虚、阴阳俱虚，标实以痰湿、血瘀为主，部分患者可见血虚。针对不同时期DKD患者证候类型、主证和兼证的不同，给予相应益气、滋阴、温阳、活血化瘀、化湿、泄浊、解毒等治疗，更能反映DKD不同阶段不同体质患者的异常复杂的证候特点，有利于突出中医药治疗DKD的个体化优势。
古方黄耆散，北宋《圣济总录》(第五十九卷·消渴门·渴利)和明代《普济方》(消渴门·渴利附论)均有收录。全方由黄芪、葛根、桑白皮三味药组成。方中黄芪补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，为君药；葛根生津止渴，通经活络，为臣药；桑白皮泻肺平喘，利水消肿，为佐药。三药相伍，共奏益气养阴，通络利水之效。以扶正治本为主，治疗糖尿病肾脏疾病(DKD)气虚、气阴两虚之证。
目前对该方的研究较少，并未有对上述古方相应制剂进行全面质量控制的质量检测方法。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种治疗糖病肾病的中药组合物的质量检测方法，上述治疗糖病肾病的中药组合物处方来源于古方黄耆散，申请人采用超滤技术及现代制剂技术将古方黄耆散开发成中药制剂，在最大程度保留有效成分基础上，提高生物利用度，便于携带和服用，本发明质量检测方法使上述中药组合物在生产和使用中有效的保证产品质量，进而保证药品疗效。
具体技术方案如下：
一种治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，所述治疗糖尿病肾病的中药组合物的有效成分主要由重量份比为0.5～1.5:1.5～2.5:0.5～1.5的黄芪、葛根和桑白皮制备而成，所述质量检测方法包括鉴别，所述鉴别包括采用薄层色谱法对所述桑白皮进行鉴别，鉴别步骤为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，研碎，加入体积浓度为69～71％的乙醇水溶液回流提取，过滤，滤液蒸干，残渣加入体积浓度为0.4～0.6％的硫酸水溶液回流，过滤，滤液用氯仿萃取2～6次，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；
另取桑白皮对照药材适量，与所述供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取东莨菪内酯和7-羟基香豆素对照品适量，加入甲醇制成东莨菪内酯和7-羟基香豆素的混合溶液，作为对照品溶液；
吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6～7:3～4:0.04～0.06的沸点为60℃～90℃的石油醚、乙酸乙酯和乙酸为展开剂，展开，取出晾干，置于紫外光下观察。
在其中一些实施例中，所述鉴别还包括采用薄层色谱法对所述黄芪进行鉴别，鉴别步骤为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，研碎，加甲醇超声提取，过滤，滤液蒸干，残渣加水饱和正丁醇溶解得正丁醇液，正丁醇液用质量百分比为0.1～3％的氢氧化钠溶液洗涤2～7次，弃去所述氢氧化钠溶液，正丁醇液再用正丁醇饱和的水洗至中性，弃去水层，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；
另取黄芪对照药材适量，与所述供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成溶液，作为对照品溶液；
分别吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为12～14：6～8:2～4的三氯甲烷、甲醇和水的下层溶液为展开剂，展开，取出晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，分别置可见光下以及紫外光灯下检视。
在其中一些实施例中，所述鉴别还包括采用薄层色谱法对所述葛根进行鉴别，鉴别步骤为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，研碎，加入甲醇超声提取，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；
另取葛根对照药材，与所述供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取葛根素对照品适量，加入甲醇制备成溶液，作为对照品溶液；
分别吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6～8:2～3:0.2～0.4的三氯甲烷、甲醇和水作为展开剂，展开，取出晾干，置于紫外光下观察。
在其中一些实施例中，所述鉴别中对黄芪的鉴别方法为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物2g，研碎，加甲醇50mL超声提取29～31min，过滤，滤液蒸干，残渣加水饱和正丁醇20mL溶解得正丁醇液，正丁醇液用质量百分比为0.1～3％的氢氧化钠溶液洗涤2～7次(洗至氢氧化钠溶液不变色为止)，每次20mL，弃去所述氢氧化钠溶液，正丁醇液再用正丁醇饱和的水洗至中性，弃去水层，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取黄芪对照药材2g，与所述供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg所述黄芪甲苷对照品的溶液，作为对照品溶液；
分别吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为12～14：6～8:2～4的三氯甲烷、甲醇和水的下层溶液为展开剂，展开，取出晾干，喷以体积浓度为10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置可见光及波长为365nm的紫外光灯下检视；
所述鉴别中对葛根的鉴别方法为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物0.1g，研碎，加入甲醇20mL超声提取29～31min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，作为供试品溶液；
另取葛根对照药材0.25g，与所述供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取葛根素对照品适量，加入甲醇制备成浓度为1.5mg/mL溶液，作为对照品溶液；
分别吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6～8:2～3:0.2～0.4的三氯甲烷、甲醇和水作为展开剂，展开，取出晾干，置于波长为365nm的紫外光下观察；
所述鉴别中的对桑白皮的鉴别方法为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物1g，研碎，加入体积浓度为69～71％的乙醇水溶液100mL回流提取4～6h，过滤，滤液蒸干，残渣加入体积浓度为0.4～0.6％的硫酸水溶液50mL回流2.5～3.5h，过滤，滤液用氯仿萃取3～5次，每次30mL，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取桑白皮对照药材1.5g，与供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取东莨菪内酯和7-羟基香豆素对照品适量，加入甲醇制成东莨菪内酯和7-羟基香豆素浓度均为0.1mg/mL的混合溶液，作为对照品溶液；
分别吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6～7:3～4:0.04～0.06的沸点为60～90℃的石油醚、乙酸乙酯和乙酸为展开剂，展开，取出晾干，置于波长为365nm的紫外光下观察。
在其中一些实施例中，所述质量检测方法还包括含量测定，所述含量测定包括采用高效液相色谱法测定所述治疗糖尿病肾病的中药组合物中的葛根素的含量，具体测定方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为13.5：86.5的乙腈和体积浓度为0.2％的甲酸水溶液作为流动相；检测波长为250nm，理论板数按葛根素峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备：取葛根素对照品适量，精密称定，加体积浓度为30％的乙醇水溶液制成溶液，即得；
供试品溶液的制备：取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，粉碎，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为30％的乙醇水溶液，密塞，称重，超声处理，放冷，再称重，用体积浓度为30％的乙醇水溶液补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即可；
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
在其中一些实施例中，所述治疗糖尿病肾病的中药组合物中的葛根素的含量测定方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Phenomenex C18；柱温为25～40℃；以体积比为13.5：86.5的乙腈和体积浓度为0.2％的甲酸水溶液作为流动相；检测波长为250nm，理论板数按葛根素峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备：取葛根素对照品适量，精密称定，加体积浓度为30％的乙醇水溶液制成每1mL含有36～44μg所述葛根素对照品的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，粉碎，取粉末0.125g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为30％的乙醇水溶液100mL，密塞，称重，超声处理20min，放冷，再称重，用体积浓度为30％的乙醇水溶液补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即可；所述超声处理中的功率为120W，频率为40kHz；
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
在其中一些实施例中，所述含量测定还包括采用高效液相色谱法测定所述治疗糖尿病肾病的中药组合物中的黄芪甲苷的含量，具体测定方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为32:68的乙腈和水作为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成溶液，即得；
供试品溶液的制备：取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，研碎，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇，超声处理，放冷，过滤得滤液，蒸干，残渣加水溶解，再用水饱和正丁醇萃取4次，合并正丁醇液；再用稀氨水洗涤，取正丁醇液蒸干，残渣加适量甲醇溶解，定容，摇匀，过滤，即得；
测定方法：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算黄芪甲苷含量。
在其中一些实施例中，所述治疗糖尿病肾病的中药组合物中的黄芪甲苷的含量测定方法为：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温为25～40℃；以体积比为32:68的乙腈和水作为流动相；蒸发光散射检测器检测，所述蒸发光散射检测器的参数为N2流速为2.8mL/min，温度为105℃，理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含有0.225～0.275mg所述黄芪甲苷对照品的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，研碎，取2.5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，加甲醇100mL，超声处理30min，放冷，过滤得滤液，蒸干，残渣加20mL水溶解，再用水饱和正丁醇萃取4次，每次50mL，合并正丁醇液；再用稀氨水洗涤2次，每次50mL，取正丁醇液蒸干，残渣加适量甲醇溶解，定容至5mL，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得；所述超声处理中的功率为120W，频率为40KHz；
测定方法：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算黄芪甲苷含量。
在其中一些实施例中，所述治疗糖尿病肾病的中药组合物中含葛根以葛根素计，不少于20mg/g；含黄芪以黄芪甲苷计，不少于0.4mg/g。
在其中一些实施例中，所述质量检测方法还包括有性状检测，所述性状检测为采用目测、鼻嗅及口尝检测所述治疗糖尿病肾病的中药组合物是否符合咖啡色包衣微丸，丸心黄褐色或褐色，气微。
上述质量检测方法还包括检查，所述检查为参照《中国药典》2015年版四部通则丸剂项下要求检查，应符合《中国药典》2015年版四部通则丸剂项下有关的各项规定。
本发明相较现有技术的优点以及有益效果为：
本发明经过多大量研究建立针对本发明治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法；
本发明质量检测方法通过建立专属性强的鉴别以及进一步地建立重现性、稳定性及精密度良好的含量测定方法，能够有效控制本发明治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量，使本发明治疗糖尿病肾病的中药组合物质量达到稳定、可控、高效及安全。
附图说明
图1为本发明治疗糖尿病肾病的中药组合物中黄芪TLC鉴别三批验证结果图谱；
图2为本发明治疗糖尿病肾病的中药组合物中葛根TLC鉴别三批验证结果图谱(UV365nm)；
图3为本发明治疗糖尿病肾病的中药组合物中桑白皮TLC鉴别三批验证结果图谱(UV365nm)；
图4为葛根素含量测定专属性试验色谱图；
图5为葛根素含量测定不同色谱柱对应的色谱图；
图6为葛根素含量测定流动相不同比例条件下色谱图；
图7为葛根素含量测定不同柱温HPLC色谱图；
图8为葛根素标准曲线；
图9为黄芪甲苷含量测定专属性试验色谱图；
图10为黄芪甲苷含量测定不同色谱柱对应的色谱图；
图11为黄芪甲苷含量测定流动相不同比例条件下色谱图；
图12为黄芪甲苷含量测定不同柱温HPLC色谱图；
图13为黄芪甲苷标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法作进一步详细说明。
本发明实施例所用试剂、仪器均为市售普通产品：
其中，治疗糖尿病肾病的中药组合物为微丸，批号：20140801，20140802，20140803，均由广州康臣药物研究有限公司提供，制备工艺为：
1)准备如下重量比的药材：黄芪：葛根：桑白皮＝1：2：1；
2)以上三味药材，加乙醇回流提取两次，滤过，合并滤液，超滤，收集滤液，回收乙醇并浓缩至浓浸膏，收膏备用；
3)取以上浸膏，加适量药用辅料，混匀，制软材，制成微丸；干燥，过筛取合格微丸，包薄膜衣，干燥，过筛；收集合格微丸，质检，包装，即得微丸成品。
实施例
一种治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，包括性状、鉴别、检查和含量测定，具体如下：
一、性状：采用目测、鼻嗅及口尝，质量指标为：本品为咖啡色包衣微丸，丸心黄褐色或褐色；气微。
二、检查：参照《中国药典》2015年版四部通则丸剂项下要求检查，质量指标为应符合《中国药典》2015年版四部通则丸剂项下有关的各项规定。
三、鉴别：
(1)仪器：研钵、量筒、圆底烧瓶、冷凝管、蒸发皿、层析缸等均购于广州市东征化玻仪器有限公司、电热套(巩义市予华仪器有限责任公司)、BS224S分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、Linomat5半自动点样仪(瑞士卡玛)、硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂有限公司)、Reprostar3成像系统(瑞士卡玛)、GZX-GFC-01-2-BS烘箱(上海博泰实验设备有限公司)、TH-II加热器(上海科哲生化科技有限公司)；
(2)对照品：黄芪对照药材、葛根对照药材、桑白皮对照药材、黄芪甲苷对照品、葛根素对照品、东莨菪内酯和7-羟基香豆素均购于中国食品药品检定研究院；
(3)试剂：甲醇、盐酸、乙酸乙酯、三氯甲烷、水、石油醚(60～90℃沸程)、氢氧化钠、硫酸、乙酸、正丁醇、氯仿、硫酸乙醇试液；
(4)样品：批号：20140801，20140802，20140803，均由广州康臣药物研究有限公司提供。
(5)鉴别的检测方法：
①对黄芪的鉴别：
取样品2g，研碎，加甲醇50mL超声提取30min，过滤，滤液蒸干，残渣加水饱和正丁醇20mL溶解得正丁醇液，正丁醇液用质量百分比为1％的氢氧化钠溶液洗涤3～5次(洗至氢氧化钠溶液不变色为止)，每次20mL，弃去氢氧化钠溶液，正丁醇液再用正丁醇饱和的水洗至中性，弃去水层，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；按上述方法分别制备批号：20140801，20140802，20140803的三批次样品各三组供试品溶液，共9组供试品溶液。
另取黄芪对照药材2g，与供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg黄芪甲苷对照品的溶液，作为对照品溶液；
取缺黄芪的样品处方药材，与供试品溶液同法制得阴性样品溶液。
照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502项)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水(体积比为13:7:3)的下层溶液为展开剂，展开，取出晾干，喷以体积浓度为10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置可见光及紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点，结果见图1，图1中的1～3为批号20140801的供试品溶液；4～6为批号20140802的供试品溶液；7～9为批号20140803的供试品溶液；10为黄芪对照药材溶液；11为黄芪甲苷对照品溶液；12为阴性样品溶液，A为置UV365nm检视，B为置可见光下检视。
②对葛根的鉴别：
取样品0.1g，研碎，加入甲醇20mL超声提取30min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，作为供试品溶液；按上述方法分别制备批号：20140801，20140802，20140803的三批次样品各三组供试品溶液，共9组供试品溶液。
另取葛根对照药材0.25g，与供试品溶液同法制得葛根对照药材溶液；
再取葛根素对照品适量，加入甲醇制备成浓度为1.5mg/mL溶液，作为葛根素对照品溶液。
取缺葛根的样品处方药材，与供试品溶液同法制得阴性样品溶液。
照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502项)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷：甲醇：水(体积比为7:2.5:0.3)的溶液为展开剂，展开，取出晾干，置于紫外光(365nm)下观察。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，结果见图2，图2中，1～3为批号20140801的供试品溶液；4～6为批号20140802的供试品溶液；7～9为批号20140803的供试品溶液；10为葛根对照药材溶液；11为葛根素对照品溶液；12为阴性样品溶液。
③对桑白皮的鉴别：
取样品1g，研碎，加入体积浓度为70％的乙醇水溶液100mL回流提取5h，过滤，滤液蒸干，残渣加入体积浓度为0.5％的硫酸水溶液50mL回流3h，过滤，滤液用氯仿萃取4次，每次30mL，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；按上述方法分别制备批号：20140801，20140802，20140803的三批次样品各三组供试品溶液，共9组供试品溶液。
另取桑白皮对照药材1.5g，与供试品同法制得桑白皮对照药材溶液；
再取东莨菪内酯和7-羟基香豆素对照品适量，加入甲醇制成东莨菪内酯和7-羟基香豆素浓度均为0.1mg/mL的混合溶液，作为对照品溶液。
取缺桑白皮的样品处方药材，与供试品溶液同法制得阴性样品溶液。
照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502项)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(沸点为60～90℃)：乙酸乙酯：乙酸(体积比为6.5:3.5:0.05)的溶液为展开剂，展开，取出晾干，置于紫外光(365nm)下观察。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，结果见图3，图3中1～3为批号20140801的供试品溶液；4～6为批号20140802的供试品溶液；7～9为批号20140803的供试品溶液；10为桑白皮对照药材溶液；11为东莨菪内酯和7-羟基香豆素混合对照品溶液(Rf东莨菪内酯>Rf7-羟基香豆素)；12为阴性样品溶液。
四、含量测定
1、葛根素含量测定：
(1.1)仪器与试药
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪；DAD检测器；色谱柱：Phenomenex C18(250×4.6mm，5μm)；KQ3200DB型数控超声仪(巩义市予华仪器有限责任公司)；电热套(巩义市予华仪器有限责任公司)、BS224S分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；研钵、量筒、圆底烧瓶、冷凝管、蒸发皿等均购于广州市东征化玻仪器有限公司；电热套(巩义市予华仪器有限责任公司)。
试药：乙腈(色谱纯)；超纯水；甲酸(色谱纯)，乙醇、甲醇、葛根素对照品，样品(批号：20140801，20140802，20140803，均由广州康臣药物研究有限公司提供)。
(1.2)色谱条件
色谱柱：Phenomenex C18(250×4.6mm，5μm)
流动相：乙腈-0.2％甲酸＝13.5:86.5
检测波长：250nm
流速：1.0mL/min
柱温：25℃
进样量：10μL
(1.3)样品制备方法考察
提取溶剂考察：本品(批号：20140801)适量，粉碎，取粉末约0.125g，平行5份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入体积浓度为70％的乙醇水溶液、体积浓度为70％甲醇水溶液、体积浓度为30％乙醇水溶液、体积浓度为30％甲醇水溶液、水100mL，密塞，称重，超声(功率120W，频率40kHz)处理30min，放冷，再称重，用相应溶剂补足减少的重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液10μL，进样测定。结果表明，体积浓度为30％乙醇水溶液提取时葛根素含量最高，故选用体积浓度为30％乙醇水溶液作为提取溶剂，结果见表1。
表1不同提取溶剂考察结果
超声时间考察：本品(批号20140801)适量，粉碎，取粉末约0.125g，精密称定，平行4份，以体积浓度为30％乙醇水溶液为提取溶剂，分别考察超声时间为5、10、20、30min，结果超声20min时，葛根素含量最高，故制备供试品溶液采用体积浓度为30％乙醇水溶液超声时间提取20min。结果见表2。
表2超声时间考察结果
(1.4)色谱条件研究
(1.4.1)系统适应性研究：
色谱分离：本色谱条件下，葛根素的色谱峰保留时间约为11min，与其它峰分离良好，分离度大于1.5，对称性为0.98，符合标准。
理论塔板数：按公式n＝5.54(tR/Wh/2)计算葛根素峰的理论塔板数为13744，考虑到不同色谱柱条件：柱长、载体性能、填充情况、流动相、使用时间等差异，暂定葛根素色谱峰的理论塔板数不小于4000。
(1.4.2)对照品及供试品溶液制备：
对照品溶液1：取葛根素对照品适量，精密称定，置100mL量瓶中，加体积浓度为30％的乙醇水溶液溶解定容至刻度(0.169mg/mL)，作为葛根素对照品储备液。再取储备液适量制成每1mL含有42.25μg葛根素对照品的对照品溶液1。
对照品溶液2：取葛根素对照品适量，精密称定，置100mL量瓶中，加体积浓度为30％的乙醇水溶液溶解定容至刻度(0.169mg/mL)，作为葛根素对照品储备液。再取储备液适量制成每1mL含有42.25μg葛根素对照品的对照品溶液2。
供试品溶液：本品(批号：20140801)适量，粉碎，取粉末约0.125g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为30％的乙醇水溶液100mL，密塞，称重，超声(功率120W，频率40kHz)处理20min，放冷，再称重，用体积浓度为30％的乙醇水溶液补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即可。
阴性样品溶液：取不含葛根的样品处方量药材，按成品制备工艺及供试品溶液制备方法制备。
(1.4.3)波长选择：
根据《中国药典》2015版一部葛根素含量测定方法，确定葛根素的检测波长为250nm。
(1.4.4)专属性试验
分别取30％乙醇(体积浓度为30％的乙醇水溶液，溶剂对照)，对照品溶液1，供试品溶液以及阴性样品溶液各10μL，按本发明色谱条件进样测定，色谱图见图4，结果表明阴性无干扰。
(1.4.5)色谱柱考察
采用供试品溶液为样品，比较多个不同品牌色谱柱，包括Phenomenex、Agilent、Alltima。比较其色谱分离情况，结果见表3，色谱图见图5。结果表明Phenomenex色谱柱分离效果最好。
表3不同色谱柱分离情况比较
(1.4.6)流动相考察
采用供试品溶液为样品，比较多个流动相系统，色谱图见图6。包括以体积比13:87的乙腈-体积浓度为0.2％甲酸水溶液为流动相，以体积比为13.5:86.5的乙腈-体积浓度为0.2％甲酸水溶液为流动相，以体积比为14:86的乙腈-体积浓度为0.2％甲酸水溶液为流动相：最终确定流动相为乙腈：体积浓度0.2％甲酸水溶液＝13.5:86.5。
(1.4.7)柱温考察
采用供试品溶液为样品，考察柱温25℃、30℃、35℃对色谱分离的影响，结果表明温度对分离无影响，本研究选择25℃。见图7。
(1.5)方法学验证
(1.5.1)线性范围考察
精密量取葛根素对照品储备液适量，倍比稀释成浓度为169.00、84.500、42.250、21.125、10.563μg/mL的对照品溶液。分别精密吸取10μL，注入高效液相色谱仪，照(1.2)中所述色谱条件测定，记录峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y＝231.77X+206.07(R2＝0.9999)。可见，进样量在0.10563～1.69000μg范围内线性关系良好。取浓度为10.563μg/mL的对照品溶液适量，分别稀释至浓度为26.406、79.219ng/mL的对照品溶液，各精密吸取10μL，测定，取峰面积为噪音三倍(S/N＝3)时的进样量为最低检测限(LOD)；取峰面积为噪音十倍(S/N＝10)时的进样量为最低定量限(LOQ)。结果见表4、5及图8。
表4不同浓度的峰面积
表5检测限、定量限测定结果
(1.5.2)精密度试验
取浓度为42.250μg/mL葛根素对照品溶液，连续进样5次，计算RSD为0.35％，结果表明精密度良好。结果见表6。
表6精密度试验结果
(1.5.3)稳定性试验
分别精密吸取同一供试品溶液，于配制后0、2、4、8、24、48、96h进样测定，结果表明96小时内稳定，见表7。
表7稳定性试验结果
(1.5.4)重复性试验
本品(批号：20140801)适量，粉碎，取粉末约0.125g，精密称定，平行6份，按本发明供试品溶液制备方法制备，分别进样2次，测定葛根素的含量。结果RSD为0.68％，表明本法重复性良好，见下表8。
表8重复性试验结果
(1.5.5)加样回收试验
取本品(批号：20140802)粉末约0.06g，分别平行6份，精密称定；分别精密加入浓度为1.8448mg/mL的葛根素对照品1mL，挥干，按本发明供试品制备方法处理，按本发明色谱条件项下方法进样10μL测定，每份样品进样两针，计算其回收率及RSD值，结果见表9。
表9加样回收试验结果
(1.5)中试样品含量测定
分别取三批中试样品(批号：20140801、20140802、20140803)粉末约0.125g，精密称定，平行2份，按本发明供试品制备方法处理，按本发明色谱条件项下方法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，结果见表10。
表10三批样品中葛根素含量
结果三批样品中葛根素含量均大于20mg/g。
2、黄芪甲苷含量测定：
(2.1)仪器与试药
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪；蒸发光检测器(ALLTECH，2000ES)；色谱柱：Agilent EXTEND C18(4.6×250mm，5μm)；研钵、量筒、圆底烧瓶、冷凝管、蒸发皿等均购于广州市东征化玻仪器有限公司；电热套(巩义市予华仪器有限责任公司)；电热套(巩义市予华仪器有限责任公司)、BS224S分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。
试药：乙腈(色谱纯)；超纯水；正丁醇；甲醇；氨水；黄芪甲苷对照品，样品(批号：20140801，20140802，20140803)。
(2.2)色谱条件
色谱柱：Agilent EXTEND C18(4.6×250mm，5μm)
流动相：乙腈-水溶液(32:68)
检测器参数：N2流速为2.8mL/min，温度为105℃
流速：1mL/min
柱温：30℃
进样量：10μL
(2.3)样品制备方法考察
根据2015年版《中国药典》方法，确定甲醇为提取溶剂，并对提取方式、提取时间和萃取次数进行考察。
提取方式考察：本品(批号：20140801)粉碎，取粉末约2.5g，精密称定，采用不同提取方式进行样品处理，结果表明甲醇超声与索氏提取效果无明显差异，考虑到成本、工作效率等方面因素，选择甲醇超声提取。结果见表11。
表11提取方式考察结果
超声时间考察：本品(批号：20140801)粉碎，取粉末约2.5g，精密称定，采用不同超声时间进行样品处理，结果表明30min即可提取完全，故选择30min。结果见表12。
表12超声时间考察结果
萃取次数的考察：本品(批号：20140801)粉碎，取粉末约2.5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，加甲醇100mL，超声处理(功率120W，频率40KHz)30min，放冷，过滤得滤液，蒸干，残渣加20mL水溶解，采用水饱和正丁醇萃取不同次数进行样品处理，结果表明萃取4次与5次无明显差异，提取较为充分，故选择水饱和正丁醇萃取4次。结果见表13。
表13萃取次数考察结果
(2.4)色谱条件研究
(2.4.1)系统适应性研究
色谱分离：本色谱条件下，黄芪甲苷的色谱峰的保留时间约为13min，与其它色谱峰分离良好，分离度大于1.5，对称性为0.98，符合标准。
理论塔板数按公式n＝5.54(tR/Wh/2)计算黄芪甲苷峰的理论塔板数为14294，考虑到不同色谱柱条件(柱长、载体性能、填充情况、流动相比例、使用时间等)差异，暂定黄芪甲苷峰的理论塔板数不小于4000。
(2.4.2)对照品及供试品溶液制备
对照品溶液1：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成母液1(2.350mg/mL)，将其继续稀释至每1mL含有0.235mg黄芪甲苷对照品的对照品溶液1，备用。
对照品溶液2：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成母液2(2.472mg/mL)，将其继续稀释至每1mL含有0.2472mg黄芪甲苷对照品的对照品溶液2，备用。
供试品溶液：本品(批号：20140801)适量，粉碎，取粉末约2.5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，加甲醇100mL，超声处理(功率120W，频率40KHz)30min，过滤，得滤液，蒸干，残渣加20mL水溶解，再用水饱和正丁醇萃取4次，每次50mL，合并正丁醇液；再用稀氨水洗涤2次，每次50mL，取正丁醇液蒸干，残渣加适量甲醇溶解，定容至5mL，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得，备用。
阴性样品溶液：取不含黄芪的样品处方量药材，按成品制备工艺及供试品溶液的制备方法制备。
(2.4.3)专属性试验
分别取甲醇空白溶剂，对照品溶液1，供试品溶液以及阴性样品溶液各10μL，按本发明色谱条件进样检测，色谱图见图9，结果表明阴性无干扰。
(2.4.4)色谱柱考察
参考《中国药典》2015年版一部关于黄芪甲苷含量测定，其色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。采用供试品溶液为样品，比较多个不同品牌色谱柱，包括Phenomenex、Agilent、Alltima。比较其色谱分离情况，结果见图10、表14。结果三个厂家的色谱柱均能使黄芪甲苷达到很好的分离效果，本研究选用Agilent色谱柱。
表14不同色谱柱分离情况比较
(2.4.5)流动相考察
以《中国药典》2015版一部黄芪甲苷含量测定方法为基础，采用供试品溶液为样品，比较多个流动相系统，包括：乙腈-水溶液(体积比为31:69)，乙腈-水溶液(体积比为32:68)以及乙腈-水溶液(体积比为33:67)，色谱图见图11。最终确定流动相为：乙腈-水溶液(体积比为32:68)。
(2.4.6)柱温考察
本发明采用供试品溶液为样品，分别考察柱温25℃、30℃、40℃对黄芪甲苷分离度的影响，见图12。结果表明当柱温为30℃时效果最好，选择柱温为30℃。
(2.5)方法学验证
(2.5.1)线性范围考察
分别精密量取浓度为2.350mg/mL的对照储备液(母液1)适量置于容量瓶中，加甲醇分别稀释至浓度为0.705mg/mL、0.470mg/mL、0.235mg/mL、0.1175mg/mL、0.05875mg/mL的对照品溶液，照(2.2)中所述色谱条件测定，记录色谱图，以浓度与峰面积的对数分别为X轴和Y轴的对数进行线性回归。再取浓度为0.05875mg/mL的对照品溶液适量，分别稀释至浓度为29.375，19.583μg/mL的对照品溶液，取峰面积为噪音三倍(S/N＝3)时的进样量为最低检测限(LOD)；取峰面积为噪音十倍(S/N＝10)时的进样量为最低定量限(LOQ)。结果见表15、16，及图13。
表15不同浓度的峰面积
表16检测限、定量限测定结果
黄芪甲苷线性方程为：Y＝1.9012x+4.6015(R2＝0.9997)，可见，黄芪甲苷进样量在0.5875～7.0500μg范围内线性关系良好。最低检测限(LOD)为0.1959μg；最低定量限(LOQ)为0.2938μg。
(2.5.2)精密度试验
取浓度为0.235mg/mL黄芪甲苷对照品溶液，连续进样5次，RSD为2.89％。结果表明精密度良好。结果见表17。
表17精密度试验结果
(2.5.3)稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后0、4、8、12、16、24h进样测定，结果表明溶液在24小时内稳定。结果见表18。
表18稳定性试验结果
(2.5.4)重复性试验
本品(批号：20140801)适量，粉碎，取粉末约2.5g，精密称定，平行6份，按本发明供试品溶液制备方法制备，测定黄芪甲苷的含量，RSD为2.21％，结果表明本法重复性良好。见表19。
表19重复性试验结果
(2.5.5)加样回收试验
分别取本品(批号：20140801，黄芪甲苷含量为0.7962mg/g微丸)1.00g，1.25g，1.50g，平行3份，精密称定；另取黄芪甲苷对照品15.924mg溶于20mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度制得对照品溶液，精密移取0.8mL、1.0mL、1.2mL加入样品瓶中，按本发明供试品制备方法处理，按本发明色谱条件项下方法进样10μL测定，制成高中低三种浓度样品溶液各三份，每份样品进样两针，结果见表20，回收率在98-101％之间，RSD≤3％。
表20加样回收试验结果
(2.6)中试样品含量测定
分别取三批中试样品(批号：20140801，20140802，20140803)，粉碎，取粉末约2.5g，平行2份，按本发明供试品制备方法处理，按本发明色谱条件项下方法分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算黄芪甲苷含量，结果见表21。
表21三批样品中黄芪甲苷含量
结果三批样品中黄芪甲苷含量均大于0.4mg/g。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述治疗糖尿病肾病的中药组合物的有效成分主要由重量份比为0.5～1.5:1.5～2.5:0.5～1.5的黄芪、葛根和桑白皮制备而成，所述质量检测方法包括鉴别，所述鉴别包括采用薄层色谱法对所述桑白皮进行鉴别，鉴别步骤为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，研碎，加入体积浓度为69～71％的乙醇水溶液回流提取，过滤，滤液蒸干，残渣加入体积浓度为0.4～0.6％的硫酸水溶液回流，过滤，滤液用氯仿萃取2～6次，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；
另取桑白皮对照药材适量，与所述供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取东莨菪内酯和7-羟基香豆素对照品适量，加入甲醇制成东莨菪内酯和7-羟基香豆素的混合溶液，作为对照品溶液；
吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6～7:3～4:0.04～0.06的沸点为60℃～90℃的石油醚、乙酸乙酯和乙酸为展开剂，展开，取出晾干，置于紫外光下观察。
2.根据权利要求1所述的治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述鉴别还包括采用薄层色谱法对所述黄芪进行鉴别，鉴别步骤为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，研碎，加甲醇超声提取，过滤，滤液蒸干，残渣加水饱和正丁醇溶解得正丁醇液，正丁醇液用质量百分比为0.1～3％的氢氧化钠溶液洗涤2～7次，弃去所述氢氧化钠溶液，正丁醇液再用正丁醇饱和的水洗至中性，弃去水层，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；
另取黄芪对照药材适量，与所述供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成溶液，作为对照品溶液；
分别吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为12～14：6～8:2～4的三氯甲烷、甲醇和水的下层溶液为展开剂，展开，取出晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，分别置可见光下以及紫外光灯下检视。
3.根据权利要求2所述的治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述鉴别还包括采用薄层色谱法对所述葛根进行鉴别，鉴别步骤为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，研碎，加入甲醇超声提取，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；
另取葛根对照药材，与所述供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取葛根素对照品适量，加入甲醇制备成溶液，作为对照品溶液；
分别吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6～8:2～3:0.2～0.4的三氯甲烷、甲醇和水作为展开剂，展开，取出晾干，置于紫外光下观察。
4.根据权利要求3所述的治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述鉴别中对黄芪的鉴别方法为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物2g，研碎，加甲醇50mL超声提取29～31min，过滤，滤液蒸干，残渣加水饱和正丁醇20mL溶解得正丁醇液，正丁醇液用质量百分比为0.1～3％的氢氧化钠溶液洗涤2～7次，每次20mL，弃去所述氢氧化钠溶液，正丁醇液再用正丁醇饱和的水洗至中性，弃去水层，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取黄芪对照药材2g，与所述供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg所述黄芪甲苷对照品的溶液，作为对照品溶液；
分别吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为12～14：6～8:2～4的三氯甲烷、甲醇和水的下层溶液为展开剂，展开，取出晾干，喷以体积浓度为10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置可见光及波长为365nm的紫外光灯下检视；
所述鉴别中对葛根的鉴别方法为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物0.1g，研碎，加入甲醇20mL超声提取29～31min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，作为供试品溶液；
另取葛根对照药材0.25g，与所述供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取葛根素对照品适量，加入甲醇制备成浓度为1.5mg/mL溶液，作为对照品溶液；
分别吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6～8:2～3:0.2～0.4的三氯甲烷、甲醇和水作为展开剂，展开，取出晾干，置于波长为365nm的紫外光下观察；
所述鉴别中的对桑白皮的鉴别方法为：
取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物1g，研碎，加入体积浓度为69～71％的乙醇水溶液100mL回流提取4～6h，过滤，滤液蒸干，残渣加入体积浓度为0.4～0.6％的硫酸水溶液50mL回流2.5～3.5h，过滤，滤液用氯仿萃取3～5次，每次30mL，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取桑白皮对照药材1.5g，与供试品溶液同法制得对照药材溶液；
再取东莨菪内酯和7-羟基香豆素对照品适量，加入甲醇制成东莨菪内酯和7-羟基香豆素浓度均为0.1mg/mL的混合溶液，作为对照品溶液；
分别吸取所述供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6～7:3～4:0.04～0.06的沸点为60～90℃的石油醚、乙酸乙酯和乙酸为展开剂，展开，取出晾干，置于波长为365nm的紫外光下观察。
5.根据权利要求1所述的治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述质量检测方法还包括含量测定，所述含量测定包括采用高效液相色谱法测定所述治疗糖尿病肾病的中药组合物中的葛根素的含量，具体测定方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为13.5：86.5的乙腈和体积浓度为0.2％的甲酸水溶液作为流动相；检测波长为250nm，理论板数按葛根素峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备：取葛根素对照品适量，精密称定，加体积浓度为30％的乙醇水溶液制成溶液，即得；
供试品溶液的制备：取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，粉碎，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为30％的乙醇水溶液，密塞，称重，超声处理，放冷，再称重，用体积浓度为30％的乙醇水溶液补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即可；
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
6.根据权利要求5所述的治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述治疗糖尿病肾病的中药组合物中的葛根素的含量测定方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Phenomenex C18；柱温为25～40℃；以体积比为13.5：86.5的乙腈和体积浓度为0.2％的甲酸水溶液作为流动相；检测波长为250nm，理论板数按葛根素峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备：取葛根素对照品适量，精密称定，加体积浓度为30％的乙醇水溶液制成每1mL含有36～44μg所述葛根素对照品的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，粉碎，取粉末0.125g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为30％的乙醇水溶液100mL，密塞，称重，超声处理20min，放冷，再称重，用体积浓度为30％的乙醇水溶液补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即可；所述超声处理中的功率为120W，频率为40kHz；
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
7.根据权利要求5所述的治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述含量测定还包括采用高效液相色谱法测定所述治疗糖尿病肾病的中药组合物中的黄芪甲苷的含量，具体测定方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为32:68的乙腈和水作为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成溶液，即得；
供试品溶液的制备：取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，研碎，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇，超声处理，放冷，过滤得滤液，蒸干，残渣加水溶解，再用水饱和正丁醇萃取4次，合并正丁醇液；再用稀氨水洗涤，取正丁醇液蒸干，残渣加适量甲醇溶解，定容，摇匀，过滤，即得；
测定方法：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算黄芪甲苷含量。
8.根据权利要求7所述的治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述治疗糖尿病肾病的中药组合物中的黄芪甲苷的含量测定方法为：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温为25～40℃；以体积比为32:68的乙腈和水作为流动相；蒸发光散射检测器检测，所述蒸发光散射检测器的参数为N2流速为2.8mL/min，温度为105℃，理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含有0.225～0.275mg所述黄芪甲苷对照品的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取所述治疗糖尿病肾病的中药组合物适量，研碎，取2.5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，加甲醇100mL，超声处理30min，放冷，过滤得滤液，蒸干，残渣加20mL水溶解，再用水饱和正丁醇萃取4次，每次50mL，合并正丁醇液；再用稀氨水洗涤2次，每次50mL，取正丁醇液蒸干，残渣加适量甲醇溶解，定容至5mL，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得；所述超声处理中的功率为120W，频率为40KHz；
测定方法：分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算黄芪甲苷含量。
9.根据权利要求1～8任一项所述的治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述治疗糖尿病肾病的中药组合物中含葛根以葛根素计，不少于20mg/g；含黄芪以黄芪甲苷计，不少于0.4mg/g。
10.根据权利要求1～8任一项所述的治疗糖尿病肾病的中药组合物的质量检测方法，其特征在于，所述质量检测方法还包括有性状检测，所述性状检测为采用目测、鼻嗅及口尝检测所述治疗糖尿病肾病的中药组合物是否符合咖啡色包衣微丸，丸心黄褐色或褐色，气微。
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