CN104502518B - 一种治疗小儿厌食症的中药制剂的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗小儿厌食症的中药制剂的检测方法，该中药制剂是由黄芪、山楂、白术、绞股蓝、麦芽、北沙参、枸杞子和牡蛎药材制备而成；该中药制剂的检测方法包括：黄芪、山楂、白术和枸杞子进行薄层定性鉴别；采用气相色谱法对辅料甘油的含量测定检查；采用高效液相色谱法，使用蒸发光散射检测器测定黄芪甲苷的含量。该检测方法具有简便、易行、重复性好的特点，有利于对该中药制剂的质量控制，有助于提高该药物临床使用安全性和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗小儿厌食症的中药制剂的检测方法，更具体地说是小儿芪楂口服液的检测方法，包括定性鉴别和含量测定，属于中药现代化领域。
背景技术
小儿芪楂口服液为黄芪、山楂、白术、绞股蓝等八味药材制备而成，具有健脾益气、消积增食的功效，用于小儿厌食脾胃气虚证，其在治疗小儿厌食症方面有显著的临床疗效。
发明专利申请CN1709335A和CN101164595A已公开了一种治疗小儿厌食症的中药制剂小儿芪楂口服液的处方及制备方法。为有效确保该中药制剂的质量和疗效，本发明拟建立一种专属性强、科学简便的定性和定量检测方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种治疗小儿厌食症的中药制剂的检测方法，包括定性鉴别和含量测定。对其中的黄芪、山楂、白术和枸杞子进行薄层定性鉴别；采用气相色谱法对中药制剂中辅料甘油的含量测定检查；采用高效液相色谱法，使用蒸发光散射检测器对中药制剂中的黄芪甲苷的含量测定。本发明技术方案方法具有简便、可行、准确、重复性良好特点，并可以作为本发明中药制剂质量控制方法，进一步保证药品质量的稳定性和疗效。
本发明内容中所述的中药制剂，均指小儿芪楂口服液，其具体的处方配比组成为：黄芪200g、山楂300g、白术200g、绞股蓝50g、麦芽150g、北沙参200g、枸杞子200g、牡蛎200g。
该制剂具体的制备方法为，以上八味，牡蛎打碎，加水煎煮1小时后，再加入黄芪等七味药材，加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，减压浓缩至相对密度为1.68～1.18(80℃热测)的浸膏，加乙醇使含醇量达70％，静置24小时，取上清液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水适量，静置24小时，取上清液，滤过，滤液加入蔗糖100g，甜菊素0.6g，甘油50ml，山梨酸钾2g，煮沸15分钟，静置过夜，滤过，自滤器加蒸馏水调整总量至1000ml。灌封，灭菌，即得。
小儿芪楂口服液由八味药材组成，经试验研究，采用薄层鉴别方法对其中黄芪、山楂、白术和枸杞子进行了定性鉴别，方中其它四味中药材因在薄层色谱板上无特征性斑点因此未进行定性薄层鉴别。
为了避免本制剂在长期贮藏期间产生沉淀，达不到中国药典附录口服液项下的要求，在制剂工艺中添加了5％的甘油作为助溶剂。为控制成品质量，对其中的甘油含量列入检验标准中的检查项下。采用气相色谱法对甘油进行含量测定，经过实施例中一系列方法学考察试验证明，本含量测定方法切实可行。
黄芪为方中君药，黄芪甲苷为有效成分，采用高效液相色谱法对制剂中黄芪甲苷进行含量测定，经过实施例中一系列方法学考察试验证明，本含量测定方法切实可行。
一种治疗小儿厌食症的中药制剂的检测方法，所述的中药制剂是由黄芪200g、山楂300g、白术200g、绞股蓝50g、麦芽150g、北沙参200g、枸杞子200g、牡蛎200g的原料药制备而成，其特征在于，所述的检测方法是采用薄层色谱法对该中药制剂中黄芪、山楂、白术和枸杞子进行定性鉴别；采用气相色谱法对该中药制剂中辅料甘油的含量测定检查；采用高效液相色谱法对该中药制剂中黄芪甲苷的含量测定。
所述的检验方法，具体包括：
(1)黄芪的鉴定方法为：取本品少量，有机溶剂萃取后分离蒸干，将残渣溶解作为供试品溶液；
(2)山楂的鉴定方法为：取本品少量，色谱柱分离后分离蒸干，将残渣溶解作为供试品溶液；
(3)白术的鉴定方法为：取本品少量，有机溶剂提取后分离蒸干，将残渣溶解作为供试品溶液；
(4)枸杞子的鉴定方法为：取本品少量，有机溶剂萃取后分离蒸干，将残渣溶解作为供试品溶液；
(5)甘油的含量测定方法：
a.照气相色谱法(中国药典2010年版一部附录VIE)测定。
b.校正因子测定精密取萘适量，加有机溶剂制成溶液，作为内标溶液，另取精密称定甘油适量，置量瓶中，精密加入内标溶液适量，加有机溶液定容至刻度，摇匀，注入气相色谱仪，测定，计算校正因子。
c.测定法精密吸取样品适量精密加入内标溶液适量，加有机溶液定容至刻度，摇匀，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。
(6)黄芪甲苷的含量测定方法：
a.照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定。
b.对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量，加有机溶剂制成溶液，即得。
c.供试品溶液的制备精密量取本品适量，用有机溶剂萃取，合并溶液，用氨试液充分洗涤，弃去氨试液后蒸干，残渣用有机溶剂溶解并转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得。
d.测定法精密吸取对照品溶液，供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
进一步地，所述的检验方法具体包括：
(1)黄芪的鉴定方法为：取本品少量，用水饱和的正丁醇液萃取，用氨试液，用正丁醇饱和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液微量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
(2)山楂的鉴别方法：取本品少量，加在聚酰胺柱上，用水洗脱，弃去洗脱液，再分别用两种不同浓度乙醇溶液洗脱，收集后一种浓度乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取金丝桃苷对照品少量，加甲醇溶解，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液微量，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，放置后置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(3)白术的鉴别方法：取本品少量，加稀盐酸调节PH值，用三氯甲烷-正丁醇振摇提取，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取白术对照药材少量，加甲醇超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液微量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(4)枸杞子的鉴别方法：取本品少量，加乙酸乙酯萃取，浓缩为供试品溶液。另取枸杞子对照药材少量，加热煮沸，滤液加乙酸乙酯萃取，合并提取液，浓缩作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(5)甘油的含量测定方法：
a.照气相色谱法(中国药典2010年版一部附录VIE)测定。
b.色谱条件与系统适用性试验酸性聚乙二醇(PEG)毛细管柱；初始温度165℃，升温至240℃；分流比5:1。理论板数按萘峰计算应不低于10000。
c.校正因子测定精密取萘适量，加有机溶剂制成溶液，作为内标溶液，另取精密称定甘油适量，置量瓶中，精密加入内标溶液适量，加有机溶液定容至刻度，摇匀，注入气相色谱仪，测定，计算校正因子。
d.测定法精密吸取样品适量精密加入内标溶液适量，加有机溶液定容至刻度，摇匀，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。
(6)黄芪甲苷的含量测定方法：
a.照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定。
b.色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水为流动相；蒸发光散射检测器。理论板数以黄芪甲苷峰计算应不低于3000。
c.对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量，加有机溶剂制成溶液，即得。
d.供试品溶液的制备精密量取本品适量，用有机溶剂萃取，合并溶液，用氨试液充分洗涤，弃去氨试液后蒸干，残渣用有机溶剂溶解并转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得。
e.测定法精密吸取对照品溶液，供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
本发明中药制剂的检测方法包括以下步骤：
(1)黄芪的鉴别方法：取本品10ml，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次30ml，弃去氨试液，用正丁醇饱和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13：7:2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点；紫外灯(365nm)下显相同颜色的荧光斑点。
(2)山楂的鉴别方法：取本品30ml，加在聚酰胺柱(60-100目，3g，内径2cm，湿法装柱)上，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再20％乙醇100ml洗脱，最后用40％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1.5ml超声使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取金丝桃苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液1.5μl、对照品溶液0.5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-甲酸(50:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，放置后置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(3)白术的鉴别方法：取本品10ml，加稀盐酸调节PH值2～3，用三氯甲烷-正丁醇(2:1)振摇提取3次，每次20ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取白术对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(5:3:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(4)枸杞子的鉴别方法：取本品10ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并提取液，浓缩至约1ml，作为供试品溶液。另取枸杞子对照药材0.5g，加水40ml，加热煮沸15分钟，放冷，滤过，滤液加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并提取液，浓缩至约1ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液5μl、对照药材溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(3:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(5)甘油的含量测定方法：
a.照气相色谱法(中国药典2010年版一部附录VIE)测定。
b.色谱条件与系统适用性试验酸性聚乙二醇(PEG)毛细管柱(柱长30m，内径0.32mm，膜厚度0.5μm)；柱温为程序升温，初始温度165℃，保持8分钟，再以每分钟35℃的速率升温至240℃，保持5分钟；分流比5:1。理论板数按萘峰计算应不低于10000。
c.校正因子测定精密取萘适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含12mg的溶液，作为内标溶液。另取甘油300mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入内标溶液5ml，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，吸取1μl，注入气相色谱仪，测定，计算校正因子。
d.测定法精密吸取样品5ml，置100ml量瓶中，加无水乙醇85ml，摇匀，精密加入内标溶液5ml，超声处理(功率250W，频率40kz)5分钟，放冷，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。
本发明采用气相色谱法测定本中药制剂中甘油含量时，供试品中甘油色谱峰完全达到基线分离，配制缺甘油的阴性样品，照上述色谱条件，吸取溶剂、内标溶液、供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液各1μl，注入气相色谱仪中测定。结果表明，阴性样品无干扰。方法学研究表明，采用气相色谱法测定本制剂中甘油含量，具有较好精密度、准确度。
(6)黄芪甲苷的含量测定方法：
照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(37:63)为流动相；蒸发光散射检测器。理论板数以黄芪甲苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取本品20ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
测定法精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
本发明采用高效液相色谱法使用蒸发光散射检测器检测时，供试品中黄芪甲苷色谱峰完全达到基线分离，阴性液无干扰，且黄芪甲苷色谱峰有较高的相应信号。方法学研究表明，采用高效液相色谱法使用蒸发光散射检测器检测的方法测定本品中黄芪甲苷含量，具有较好重现性、稳定性和精密度。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明检测方法简便、快捷、准确，灵敏度好、稳定性高，提高了对药品质量的有效控制，保证了质量。
附图说明
图1为实施例的甘油专属性试验气相色谱图；
图2为实施例的黄芪甲苷对照品高效液相色谱图；
图3为实施例的黄芪甲苷的供试品高效液相色谱图；
图4为实施例的缺黄芪阴性液样品高效液相色谱图。
具体实施方式
仪器和试药：
Shimadzu10A高效液相色谱仪(二元泵、柱温箱、SPD-10VP检测器、HW色谱工作站)；Sedex75型蒸发光散射检测器；KromasilC18(10nm5μm，4.6×250mm)色谱柱；HypersilODSC18(10μ，ID4.6×250mm)色谱柱；DiamonsilC18(5μ，250×4.6mm)色谱柱，理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；
Agilent6890型气相相色谱仪；DB-1石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；KB-Wax石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.50μm)；KB-Awax石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.50μm)，理论板数按萘峰计算应不低于10000。
10批本小儿芪楂口服液均为吉林敖东延边药业股份有限公司提供，其样品编号分为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8Y9、Y10。
甘油(分析纯，含量≥99.0％)；萘(分析纯，含量≥99.0％)；黄芪甲苷对照品(批号：0781-200311)；白术对照药材(批号：120925-200407)；枸杞子对照药材(批号：121072-200505)；乙腈为色谱纯；水为二次重蒸水；其余试剂均为分析纯。上述对照品及对照药材均购于中国药品生物制品检定所。
实施例1：本发明中药制剂的薄层鉴别
(1)黄芪的鉴别方法：取本品10ml，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次30ml，弃去氨试液，用正丁醇饱和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13：7:2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点；紫外灯(365nm)下显相同颜色的荧光斑点。
(2)山楂的鉴别方法：取本品30ml，加在聚酰胺柱(60-100目，3g，内径2cm，湿法装柱)上，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再20％乙醇100ml洗脱，最后用40％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1.5ml超声使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取金丝桃苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液1.5μl、对照品溶液0.5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-甲酸(50:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，放置后置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(3)白术的鉴别方法：取本品10ml，加稀盐酸调节PH值2～3，用三氯甲烷-正丁醇(2:1)振摇提取3次，每次20ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取白术对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(5:3:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(4)枸杞子的鉴别方法：取本品10ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并提取液，浓缩至约1ml，作为供试品溶液。另取枸杞子对照药材0.5g，加水40ml，加热煮沸15分钟，放冷，滤过，滤液加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并提取液，浓缩至约1ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液5μl、对照药材溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(3:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例2本发明中药制剂中甘油的含量测定方法
色谱条件：检测器FDI；载气N21.0ml/min；氢气40ml/min；空气400ml/min；分流比5:1；进样口温度260℃；检测器温度300℃；柱温为程序升温，初始温度165℃，保持8分钟，再以每分钟35℃的速率升温至240℃；进样量1μl。
内标溶液的制备：取萘适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含12mg的溶液，即得。
对照品溶液的制备：取甘油300mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入内标溶液5ml，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：精密量取本中药制剂(样品Y4)5ml，置100ml量瓶中，精密加入内标溶液5ml，超声处理5分钟，放冷，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取取续滤液，即得。
专属性试验：配制缺甘油的阴性样品，按供试品溶液制备方法配制阴性样品，照上述色谱条件，吸取溶剂、内标溶液、供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液1μl，注入气相色谱仪中测定。结果表明，阴性样品无干扰。
线性关系的考察：精密称取萘151.4mg，置250ml量瓶中，加无水乙醇使溶解并定容至刻度，摇匀，得内标溶液。再精密称取甘油520.8mg，置50ml量瓶中，加内标溶液使溶解并定容至定容，摇匀，分别精确吸取1、2、3、4、5、10ml，置10ml量瓶中，加内标溶液稀释至刻度，摇匀，各吸取1μl，按上述色谱条件测定。以对照品浓度(mg/ml)为横坐标(X)，甘油峰与萘峰面积的比值(AR/AS)为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程为：Y＝0.4001X-0.1359，r＝0.99995，结果见表1。结果表明，甘油进样浓度在1.0416～10.416mg/ml的范围内线性关系良好。
表1、线性关系考察结果
精密度试验：
(1)重复性取同一批样品(样品Y4)六份，按正文含量测定方法操作，计算。结果表明方法重复性良好，相对标准偏差为1.12％。结果见表2。
表2重复性考察结果
(2)重现性：通过两个实验室对三批样品按正文含量测定方法操作，以验证方法的重现性。测定结果表明，本文方法重复性良好，结果见表3。
表3、重现性考察结果
准确度试验：精密量取六份已知含量的样品Y4(重复性试验测定结果为67.805mg/ml)3ml，置100ml量瓶中，精密加对照品溶液(浓度：67.484mg/ml，溶剂为水)2ml，加无水乙醇85ml，摇匀，精密加内标溶液5ml，超声处理5分钟，放冷，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得准确度测定用样品溶液；按正文样品含量测定方法进行测定，计算准确度，见表4。结果表明：本方法的准确度较好，平均回收率为100.02％，相对标准偏差为1.49％。
表4、准确度测定结果
含量限度的确定：对六批样品进行测定，结果见表5。
表5、含量测定结果表
根据上述测定结果，甘油的含量限度按实际加入量(63g/1000ml)的±10％拟定，即：暂定本品含甘油(C3H8O3)应为5.7％～6.9％(g/ml)。
范围：范围考察浓度设计为±20％，即4.56％和8.28％。样品Y4浓度为6.79％，以此样品模拟，取样量分别约为3ml和7ml。范围考察方法具体如下。
(1)重复性
取样品六份，按正文含量测定方法操作，计算，结果见表6～7。
表6、低浓度重复性考察结果
表7、高浓度重复性考察结果
(2)准确度
A.低浓度准确度试验精密度取六份已知含量的样品Y4(重复性试验测定结果为67.805mg/ml)2ml，置100ml量瓶中，精密加对照品溶液(浓度：48.91mg/ml，溶剂为水)3ml,加无水乙醇85ml,摇匀，精密加内标溶液5ml，超声处理5分钟，放冷，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得低溶度准确度测定用样品溶液；按正文样品含量测定方法进行测定，计算准确度，见表8，平均回收率为99.74％，相对标准偏差为1.30％。
表8、低浓度准确度考察结果
B.高浓度准确度试验精密量取六份已知含量的样品Y4(重复性试验测定结果为67.805mg/ml)4ml，置100ml量瓶中，精密加对照品溶液(浓度：315.2mg/ml，溶剂为水)1ml，加无水乙醇85ml，摇匀，精密加内标溶液5ml，超声处理5分钟，放冷，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得高浓度准确度测定用样品溶液；按正文样品含量测定方法进行测定，计算准确度，见表9，平均回收率为100.03％，相对标准偏差为1.36％。
表9、高浓度准确度考察结果
(3)实验结果比较
对范围考察的重复性和准确度实验结果进行比较，结果相对标准偏差均小于2％，符合范围考察的要求。见表10。
表10、范围考察结果
耐用性实验：
(1)进样口和检测器温度的考察
通过对不同的进样口和检测器温度进行比较试验，结果进样口温度在240℃～260℃，检测器温度在250℃～300℃效果比较理想，本实验选择进样口温度260℃，检测器温度在300℃。
(2)载气流速的考察
通过对不同的载气(N2)流速进行比较试验，结果流速为1ml/min时分离理想。
(3)色谱柱的选择
试验中的色谱柱DB-1石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；KB-Wax石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.50μm)；KB-Awax石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.50μm)；
采用上述色谱柱，按正文含量测定方法对同一批样品Y4，进行含量测定，结果：DB-1出峰时间快，拖尾严重，分离不理想；KB-Wax拖尾，峰对称性较差；KB-Awax峰形较好，分离理想。因此，本方法宜选用偏酸性的聚乙二醇毛细管柱。
(4)供试品溶液稳定性考察
将供试样品Y4溶液室温保存，每隔2小时或更长时间测定一次，计算甘油与内标物的峰面积比值，相对标准偏差为0.87％。结果表明：供试品溶液在24小时内保持稳定。结果见表11。
表11、稳定性考察结果
实施例3本发明中药制剂中黄芪甲苷的含量测定方法
色谱条件：色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相：乙腈-水(37：63)；采用蒸发光散射检测器检测，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃；柱温25℃；载气(N2)压力3.5bar；流速：1.0ml/min；进样量对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液10μl。
供试品溶液的制备：
(1)供试品溶液的制备条件的选择
制备方法的选择：A.精密量取样品Y320ml，加乙醚10ml，振摇，弃去乙醚液，药液加三氯甲烷-正丁醇(2:1)振摇提取3次，每次15ml，合并提取液，蒸干，残渣加2％氢氧化钾的甲醇溶液50ml，加热回流1h，蒸干，残渣加水30ml(10，10，10ml)使溶解，置分液漏斗中，加三氯甲烷-正丁醇(2:1)振摇提取3次，每次15ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。B.精密量取本品20ml，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
试验结果表明，方法A与方法B含量基本一致，但方法B操作更简单，主峰分离度亦不受影响，故确定方法B为供试品溶液的制备方法，尚需对提取次数进行考察。
提取次数的考察：实验结果见表12，结果表明提取4次可将黄芪甲苷基本提取完全。
表12、提取次数考察结果
(2)供试品溶液制备方法的确认
通过上述考察，确认供试品溶液的制备方法为，精密量取本中药制剂20ml，以水饱和正丁醇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔虑膜(0.45μm)滤过，既得。
对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得。
专属性考察：配黄芪的阴性样品，按供试品溶液制备方法配制，吸取阴性样品溶液10μl，注入液相色谱仪中测定。结果表明，阴性样品无干扰。
线性关系的考察：精密称取黄芪甲苷对照品51.5mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。分别精密吸取上述对照品溶液0.2、0.5、1、2、3、5、10ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各精密吸取10μl，按上述色谱条件测定，以进样量的对数值(X：logM)和峰积分面积的对数值(Y：logA)进行线性回归，得回归方程为：Y＝1.4824X+0.751r＝0.99991。结果表明，黄芪甲苷进样量在412～20600ng的范围内线性关系良好。
表13、线性关系考察结果
精密度试验：
(1)重复性取同一批样品Y3六份，按正文含量测定方法操作，计算，结果表明方法重复性良好，相对标准偏差为1.36％，见表14。
表14、重复性考察结果
(2)中间精密度在同一实验室，由不同分析人员在不同日期对三批样品按正文含量测定方法操作，计算。结果表明本文方法中间精密度良好，见表15。
表15、中间精密度考察结果
重现性试验：
通过两个实验室对三批样品按正文含量测定方法操作，以验证方法的重现性。测定结果表明，本文方法重复性良好，见表16。
表16、重现性考察结果
准确度试验：
精密量取已知含量的样品Y3(重复性试验测定结果为58.93μg/ml)10ml，精密加入黄芪甲苷对照品溶液(浓度：1.19mg/ml)0.5ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得准确度测定用样品溶液。按正文样品含量测定方法进行测定，计算准确度，见表17。结果表明，本方法的准确度较高，平均回收率为97.80％，相对标准偏差为1.48％。
表17、黄芪甲苷回收率测定结果
含量限度的确定：对本中药制剂十批样品进行测定，结果见表18。
表18、黄芪甲苷含量测定结果表
据上述测定结果，综合考虑黄芪药材的实际含量及制备工艺、大生产等因素，暂定本中药制剂每支黄芪及黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.42mg。
Claims (17)
1.一种治疗小儿厌食症的中药制剂的检测方法，所述的中药制剂是由黄芪200g、山楂300g、白术200g、绞股蓝50g、麦芽150g、北沙参200g、枸杞子200g、牡蛎200g的原料药制备而成，所述的检测方法是采用薄层色谱法对该中药制剂中黄芪、山楂、白术和枸杞子进行定性鉴别；采用气相色谱法对该中药制剂中辅料甘油的含量进行测定；采用高效液相色谱法对该中药制剂中黄芪甲苷的含量进行测定；其特征在于：
所述白术的鉴别方法：取本品少量，加稀盐酸调节pH值，用三氯甲烷-正丁醇振摇提取，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取白术对照药材少量，加甲醇超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法，中国药典2010年版一部附录VIB试验，吸取上述两种溶液微量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于白术的鉴别方法：取本品10ml，加稀盐酸调节pH值2～3，用2:1的三氯甲烷-正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取白术对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录VIB试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5:3:0.2的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于黄芪的鉴定方法为：取本品少量，有机溶剂萃取后分离蒸干，将残渣溶解作为供试品溶液。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于山楂的鉴定方法为：取本品少量，色谱柱分离后分离蒸干，将残渣溶解作为供试品溶液。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于枸杞子的鉴定方法为：取本品少量，有机溶剂萃取后分离蒸干，将残渣溶解作为供试品溶液。
6.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于黄芪的鉴定方法为：取本品少量，用水饱和的正丁醇液萃取，用氨试液，用正丁醇饱和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录VIB试验，吸取上述两种溶液微量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于黄芪的鉴别方法为：取本品10ml，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次30ml，弃去氨试液，用正丁醇饱和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录VIB试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以13:7:2的三氯甲烷-甲醇-水10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点；紫外灯365nm下显相同颜色的荧光斑点。
8.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于山楂的鉴定方法为：取本品少量，加在聚酰胺柱上，用水洗脱，弃去洗脱液，再分别用两种不同浓度乙醇溶液洗脱，收集后一种浓度乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取金丝桃苷对照品少量，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录VIB试验，吸取上述两种溶液微量，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，放置后置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于山楂的鉴定方法为：取本品30ml，加在聚酰胺柱上，柱规格：粒径60-100目，3g，内径2cm，湿法装柱，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再20％乙醇100ml洗脱，最后用40％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1.5ml超声使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液；另取金丝桃苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录VIB试验，吸取上述供试品溶液1.5μl、对照品溶液0.5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-甲酸50:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，放置后置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
10.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于枸杞子的鉴别方法：取本品少量，加乙酸乙酯萃取，浓缩为供试品溶液；另取枸杞子对照药材少量，加热煮沸，滤液加乙酸乙酯萃取，合并提取液，浓缩作为对照药材溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录VIB试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
11.如权利要求10所述的检测方法，其特征在于枸杞子的鉴别方法：取本品10ml，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并提取液，浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取枸杞子对照药材0.5g，加水40ml，加热煮沸15分钟，放冷，滤过，滤液加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并提取液，浓缩至1ml，作为对照药材溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录VIB试验，吸取上述供试品溶液5μl、对照药材溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以3:2:1的乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
12.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于甘油的含量测定方法：
a.照气相色谱法中国药典2010年版一部附录VIE测定；
b.校正因子测定精密取萘适量，加有机溶剂制成溶液，作为内标溶液，另取精密称定甘油适量，置量瓶中，精密加入内标溶液适量，加有机溶液定容至刻度，摇匀，注入气相色谱仪，测定，计算校正因子；
c.测定法精密吸取样品适量精密加入内标溶液适量，加有机溶液定容至刻度，摇匀，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。
13.如权利要求12所述的测定方法，其特征在于甘油的含量测定方法：
a.照气相色谱法中国药典2010年版一部附录VIE测定；
b.色谱条件与系统适用性试验酸性聚乙二醇PEG毛细管柱；初始温度165℃，升温至240℃；分流比5:1，理论板数按萘峰计算应不低于10000；
c.校正因子测定精密取萘适量，加有机溶剂制成溶液，作为内标溶液，另取精密称定甘油适量，置量瓶中，精密加入内标溶液适量，加有机溶液定容至刻度，摇匀，注入气相色谱仪，测定，计算校正因子；
d.测定法精密吸取样品适量精密加入内标溶液适量，加有机溶液定容至刻度，摇匀，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。
14.如权利要求13所述的检测方法，其特征在于甘油的含量测定方法：
a.照气相色谱法中国药典2010年版一部附录VIE测定；
b.色谱条件与系统适用性试验酸性聚乙二醇PEG毛细管柱柱长30m，内径0.32mm，膜厚度0.5μm；柱温为程序升温，初始温度165℃，保持8分钟，再以每分钟35℃的速率升温至240℃，保持5分钟；分流比5:1，理论板数按萘峰计算应不低于10000；
c.校正因子测定精密取萘适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含12mg的溶液，作为内标溶液，另取甘油300mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入内标溶液5ml，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，吸取1μl，注入气相色谱仪，测定，计算校正因子；
d.测定法精密吸取样品5ml，置100ml量瓶中，加无水乙醇85ml，摇匀，精密加入内标溶液5ml，超声处理5分钟，功率250W，频率40kz，放冷，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，吸取续滤液1μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。
15.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于黄芪甲苷的含量测定方法：
a.照高效液相色谱法中国药典2010年版一部附录VID测定；
b.对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量，加有机溶剂制成溶液，即得；
c.供试品溶液的制备精密量取本品适量，用有机溶剂萃取，合并溶液，用氨试液充分洗涤，弃去氨试液后蒸干，残渣用有机溶剂溶解并转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得；
d.测定法精密吸取对照品溶液，供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
16.如权利要求15所述的检测方法，其特征在于黄芪甲苷的含量测定方法：
a.照高效液相色谱法中国药典2010年版一部附录VID测定；
b.对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成溶液，即得；
c.供试品溶液的制备精密量取本品适量，用水饱和的正丁醇萃取，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得；
d.测定法精密吸取对照品溶液，供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
17.如权利要求16所述的检测方法，其特征在于黄芪甲苷的含量测定方法：
a.照高效液相色谱法中国药典2010年版一部附录VID测定；
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以37:63的乙腈-水为流动相；蒸发光散射检测器；理论板数以黄芪甲苷峰计算应不低于3000；
b.对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；
c.供试品溶液的制备精密量取本品20ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜0.45μm滤过，即得；
d.测定法精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
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- 2014-12-04 CN CN201410734572.2A patent/CN104502518B/zh active Active
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| CN104502518A (zh) | 2015-04-08 |
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