CN104198619B

CN104198619B - 一种小儿止咳糖浆的质量检测方法

Info

Publication number: CN104198619B
Application number: CN201410489876.7A
Authority: CN
Inventors: 陈海刚; 刘春方; 符国成; 龚小兵
Original assignee: China Resources Sanjiu Chenzhou Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: China Resources Sanjiu Chenzhou Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-09-23
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2016-01-13
Anticipated expiration: 2034-09-23
Also published as: CN104198619A

Abstract

本发明涉及中药制剂检测领域，特别涉及一种小儿止咳糖浆的质量检测方法，包括以下步骤：将待测样品用甲醇稀释后注入液相色谱仪进行测定；液相色谱仪的检测条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，1％乙酸溶液为流动相B，按特定的程序梯度洗脱，波长252～256nm，流速0.8～0.9ml/min，柱温29～31℃，理论塔板数按照甘草酸铵峰计不得低于3000；得到的色谱图与对照指纹图谱比对判断待测样品的质量。本发明通过控制多个影响因素，提供的小儿止咳糖浆指纹图谱检测方法稳定、可靠、重复性好，实现了指纹图谱检测控制质量的目的，同时对确保每批产品质量的一致性具有重要意义。

Description

一种小儿止咳糖浆的质量检测方法

技术领域

本发明涉及中药制剂检测领域，具体而言，涉及一种小儿止咳糖浆的质量检测方法。

背景技术

中药指纹图谱建立的是全面反映中药所含有内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量，尤其是在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量。指纹图谱作为质量控制的方法已成为业界人士的共识，国际上也多采用指纹图谱对植物药进行质量控制。

小儿止咳糖浆主要成分包括甘草流浸膏150ml、桔梗流浸膏30ml、氯化铵10g和橙皮酊20ml；以上四味，氯化铵加适量水溶解，备用；另取蔗糖650g，加水煮沸，放冷，加入其余甘草流浸膏等三味，加苯甲酸钠2g，混匀，静置，取上清液，煮沸，滤过，滤液冷却至40℃以下，缓缓加入上述氯化铵溶液与香兰素25mg，加水至1000ml，混匀，即得。产品为红棕色的半透明黏稠液体；味甜。目前检测小儿止咳糖浆采用以下法定标准：

(1)、取本品2ml，加水6ml，摇匀，滤过，取滤液1ml，加稀盐酸数滴，生成沉淀，再加氨试液适量，沉淀可溶解。

(2)、取(1)项下的滤液，照铵盐与氯化物的鉴别方法试验，显相同的反应。

(3)、取本品20ml，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次15ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材0.5g，加甲醇20ml，加热回流20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(9﹕1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

还需要符合以下条件：相对密度应为1.20～1.30，pH值应为5.0～7.0，应符合糖浆剂项下有关的各项规定。

氯化铵含量的测定：用内容量移液管精密量取本品10ml，置凯氏烧瓶中，用水冲洗移液管内壁，洗液并入烧瓶中，加水250ml，摇匀，加玻璃珠数粒，再加20％氢氧化钠溶液10ml，立即用氮气球将烧瓶与冷凝管连接，冷凝管的尖端浸入4％硼酸溶液50ml的液面下，加热蒸馏，至2/3的溶液馏出时，将冷凝管提出接近液面，让蒸汽冲洗1分钟，用水淋洗尖端后停止蒸馏，馏出液加甲基红-溴甲酚绿混合指示液10滴，用硫酸滴定液(0.05mol/L)滴定，并将滴定结果用空白试验校正，即得。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于5.349mg的氯化铵(NH₄Cl)。本品每1ml含氯化铵(NH₄Cl)应为9.0mg～12.0mg。

甘草酸含量采用高效液相色谱法测定，具体如下：色谱条件与系统适应性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸(65﹕35﹕1)为流动相；检测波长为250nm。理论板数按甘草酸峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含40ug的溶液，即得(相当于每1ml含甘草酸39.18ug)。供试品溶液的制备：用内容量移液管精密量取本品1ml，置50ml量瓶中，用流动相冲洗移液管内壁，洗液并入量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每1ml含甘草以甘草酸(C₄₂H₆₂O₁₆)计，不得少于1.8mg。

从上述可知，目前，小儿止咳糖浆的质量控制标准仍然采用单一成分如通过对氯化铵或甘草酸的含量及其他常规定性方法来控制和体现。众所周知，中成药是从中药饮片中提取的很多成分的综合体，其药效也不是通过单个活性物质起作用的，不能以其中的某个别成分来确定其质量情况，因此，单一成分的检测并不能全面反映产品的质量情况。并且这种对质量判断存在片面性的情况下，容易让人通过其他手段来达到质量标准，但制得的产品质量却不符合治疗预期效果。此外，由于目前的检测方法只能针对每一个单独的样品批次进行质量评价，不能评价产品批与批之间的质量是否一致。

因此，目前的小儿止咳糖浆质量控制标准已不能真实反映小儿止咳糖浆的内在品质以及批与批之间产品质量的一致性。怎么建立一种中药指纹图谱来保证产品中大部分化学成分被色谱峰体现，并通过对比，能够有效控制产品的质量，确保每批产品质量的一致是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小儿止咳糖浆的质量检测方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了一种小儿止咳糖浆的质量检测方法，包括以下步骤：

将小儿止咳糖浆待测样品用甲醇稀释后注入液相色谱仪进行测定；

所述液相色谱仪的检测条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，1％乙酸溶液为流动相B，按以下程序梯度洗脱：

检测波长252～256nm，流速0.8～0.9ml/min，柱温29～31℃，理论塔板数按照甘草酸铵峰计不得低于3000；

将得到的色谱图与对照指纹图谱比对判断待测样品的质量。

优选地，所述检测波长为254nm。

优选地，所述流速为0.8ml/min。

优选地，所述柱温为30℃。

优选地，待测样品注入液相色谱的体积为5～20μl。

优选地，待测样品注入液相色谱的体积为10～15μl，优选为10μl。

优选地，小儿止咳糖浆待测样品的稀释倍数为45～55倍，优选为50倍。

优选地，检测待测样品时以甘草酸铵作为对照品。

优选地，对照指纹图谱有10个特征峰，以甘草酸铵为参照，得到的其它峰的相对保留时间如下：1号峰0.209±0.38％、2号峰0.332±0.49％、3号峰0.338±0.40％、4号峰0.494±0.38％、5号峰0.522±0.49％、6号峰0.554±0.67％、7号峰0.827±0.55％、8号峰0.971±0.29％、9号峰1.000±0.28％、10号峰1.078±0.49％；

其中，2、4、5、9号峰分别对应甘草苷、新橙皮苷、橙皮苷、甘草酸铵。

优选地，待测样品的色谱图与对照指纹图谱比对的相似度在0.9以上判定为合格品。

本发明实施例提供的小儿止咳糖浆的质量检测方法，通过控制多个影响因素，如波长的筛选、流动相考察、供试品制备的优化、参照峰选择等，最终得到的小儿止咳糖浆指纹图谱检测方法稳定、可靠、重复性好，实现了用指纹图谱检测小儿止咳糖浆来进行质量控制的目的，对有效控制小儿止咳糖浆产品的质量，确保每批产品质量的一致性具有重要意义。

附图说明

图1示出了本发明实施例1中不同检测波长得到的色谱图；

图2示出了本发明实施例1中不同流动相得到的色谱图；

图3示出了本发明实施例1中不同洗脱梯度得到的色谱图；

图4示出了本发明实施例1中不同的供试品溶液得到的色谱图；

图5示出了本发明实施例1中混合标样溶液与供试品溶液对比的色谱图；

图6示出了本发明实施例1中混合标样溶液与甘草阴性制剂对比的色谱图；

图7示出了本发明实施例2中空白试验得到的色谱图；

图8示出了本发明实施例2中精密度试验得到的色谱图；

图9示出了本发明实施例2中重复性试验得到的色谱图；

图10示出了本发明实施例2中稳定性试验得到的色谱图；

图11示出了本发明实施例3中不同批次样品得到的色谱图；

图12示出了本发明实施例3中得到的对照指纹图谱。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

1.检测波长的选择

采用HPLC法对相同的样品检测，HPLC法所用高效液相色谱仪型号为WaterS2695-2489，以紫外可见光检测器作为多波长检测手段对四个波长进行考察，选用的4个检测波长分别为λ＝237nm、λ＝254nm、λ＝283nm和λ＝345nm，以色谱峰数、分离度等评价。HPLC的其他检测条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1mol/L磷酸氢二钾(磷酸调节约pH＝6.5)乙酸为流动相B，按照表1的梯度进行洗脱，进样量10μl，流速：0.8ml/min，柱温：30℃。梯度程序如下：

表1梯度1洗脱程序

时间min	乙腈％	1％乙酸溶液％
			0～20	13→30	87→70
20～50	30→60	70→40
			50～75	60→80	40→20
75～85	80→13	20→87
			85～90	13	87

得到的图谱见图1。从图1可以看出，检测波长254nm时，色谱峰数较多，指纹特征明显，较其余三者反应信息更多；结合小儿止咳糖浆处方药味分析，甘草等占处方中药总量大部分，而它们指标成分吸收波长在230nm～260nm之间。因此，同时对波长252nm、253nm、254nm、255nm、256nm等分别进行了测定，发现其峰型与波长254nm一致。因此，可以选用252～256nm进行检测，其中，波长254nm的峰型更好，更优选地，所述检测波长为254nm。以下的检测波长均采用λ＝254进行。

2.流动相的选择

小儿止咳糖浆处方中甘草、桔梗、陈皮等所含成分略偏酸性，流动相应略偏酸，通过查阅文献，小儿止咳糖浆中主要成分的HPLC分离一般采用的有机相为甲醇、乙腈，水相为磷酸溶液、乙酸溶液的流动相组合。另外，指纹图谱要求尽量多的检出峰，一般使用梯度洗脱进行分离。为了使在梯度洗脱过程中pH值变化范围小，pH更符合一般C18柱要求的流动相，对不同组合、不同比例的流动相进行pH值测定，结果如表2所示。

表2不同组合、不同比例的流动相的pH值

比例	80:20	66.7:33.3	100:0	0:100
					0.2％磷酸/甲醇	2.181	2.285	1.820	5.910
0.2％磷酸/乙腈	1.983	2.071	1.820	4.302
					1％乙酸/甲醇	2.858	3.039	2.685	5.910
1％乙酸/乙腈	2.849	3.054	2.685	4.302

从表2中列出的流动相的组合得到的pH值可知，1％乙酸/甲醇，1％乙酸/乙腈流动相组合pH值在梯度中波动小，pH值均在3左右，非常适合C18色谱柱的使用条件，故选择1％乙酸/甲醇，1％乙酸/乙腈作为流动相进行测定，测定结果如图2所示。

从图2可以看出，1％乙酸/甲醇为流动相色谱峰分离一般，峰数较多，基线不平稳；1％乙酸/乙腈为流动相色谱峰分离较好，峰数较多，色谱峰高适中，只有2个峰分离度不佳，需进一步优化。

3.洗脱程序的选择

由于流动相组成为1％乙酸/乙腈，流动相色谱峰分离较好，峰数较多，色谱峰高适中，色谱峰分离、峰数等相对较优，因此选用1％乙酸/乙腈作为流动相并进一步优化洗脱梯度条件，洗脱梯度条件见表3所示，得到的测定图谱如图3所示。

从图3可以看出，使用梯度3的程序进行洗脱，得到的图谱效果较好，基线平稳，谱峰分离较好，峰数较多，色谱峰高适中优选梯度3的程序做为流动相洗脱梯度。以下选择梯度3的程序做为流动相进行洗脱。

4.供试品溶液制备的考察

精密量取小儿止咳糖浆(批号1404001N)供试品三份，每份均为1ml，分别置50ml容量瓶中；其中，第一份加入甲醇稀释至刻度，摇匀，取适量过0.45μm微孔滤膜，取滤液，即得；第二份加入乙醇稀释至刻度，摇匀，取适量过0.45μm微孔滤膜，取滤液，即得；第三份加入乙腈/水(1:1)稀释至刻度，摇匀，取适量过0.45μm微孔滤膜，取滤液，即得。分别将各滤液进样10μl，测定，得到的图谱如图4所示。

由图4可知：相同条件下，采用甲醇处理样品所得色谱图色谱峰峰数多，分离度好，基线平稳，选择甲醇用于供试品溶液的制备。

5.参照物的选择

根据小儿止咳糖浆处方药材指标成分，拟定参照物溶液制备如下：取适量的甘草酸铵、橙皮苷、新橙皮苷、甘草苷作为对照品，加甲醇制备成含甘草酸铵40μg/ml、橙皮苷40μg/ml、新橙皮苷40μg/ml和甘草苷40μg/ml的混合标样溶液，摇匀，即得；同时按供试品制备方法制备甘草阴性制剂；分别进样10μl，测定，混合标样溶液分别与供试品溶液(样品)和甘草阴性制剂得到的色谱图比较，结果见图5和图6。其中，混合标样所用试剂均购买至中国药品生物制品检定所。

由图5可知，甘草酸铵色谱峰在色谱图中位置适中，吸收强度大，分离良好，且甘草在处方中药量占非常大，符合参照物选择的标准。从图6可以看出，甘草阴性样品中溶液色谱图在甘草酸铵色谱峰相应位置无干扰，说明以甘草酸铵作为参照峰专属性良好。因此，选择甘草酸铵作为指纹图谱的参照物。

实施例2

实施例1得到的检测方法具体为：

将小儿止咳糖浆待测样品用甲醇稀释50倍后取10μl注入液相色谱仪进行测定；

所述液相色谱仪的检测条件为：

检测波长254nm，流速0.8ml/min，柱温30℃，理论塔板数按照甘草酸铵峰计不得低于3000。将该检测方法进行方法学考察。

1.空白试验

为考察供试品溶解溶剂对指纹图谱中各色谱峰的干扰，进行空白试验。进样10μl甲醇，运行梯度，记录色谱图，如图7所示，结果表明空白样品基线平稳、基本无干扰。

2.精密度试验

取同一批供试品(批号1404001N)溶液，连续进样6次，每次10μl，记录色谱图，色谱图如图8所示。采用2012年版中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算相似度和RSD值，结果见表3所示。

表3精密度试验相似度结果

进样号	1	2	3	4	5	6	RSD％
								相似度	1	0.999	0.999	0.999	0.998	0.999	0.02

从图8和表3可以看出，连续进样6次相似度结果相对标准偏差小于3％，仪器精密度良好。

3.重复性试验

取同一批样品(批号1404001N)6份，按照供试品溶液制备方法制备，分别进样10μl，记录色谱图，色谱图如图9所示；采用2012年版中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算相似度，RSD值，所得结果见表4。

表4重复性试验相似度结果

进样号	1	2	3	4	5	6	RSD％
								相似度	0.999	0.998	0.998	0.998	0.999	1	0.05

从图9和表4可以看出，重复性相似度结果小于3％，表明方法重复性良好。

4.稳定性试验

取同一批供试品(批号1404001N)溶液，分别于0h、3h、6h、9h、15h、24h时间点进样，进样量10μl，记录色谱图，色谱图如图10所示；采用2012年版中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算相似度，RSD值，所得结果见表5。

表5稳定性试验相似度结果

时间(h)	0	3	6	9	15	24	RSD％
								相似度	1	0.999	0.999	0.998	0.998	0.998	0.05

从图10和表5可以看出，被测成分稳定性相似度结果在3％以内，表明样品在24h内稳定性良好。

综上表明，该检测方法用于小儿止咳糖浆指纹图谱的检测稳定、可靠、重复性好。

实施例3

对照指纹图谱的确定

取小儿止咳糖浆样品，批号1301006N、1301007N、1303013N、1303014N、1305007N、1305008N、1309005N、1309006N、1401013N、1401014N，共计10批样品，按照拟定供试品制备方法制备，具体如下：

液相色谱仪的检测条件为：

检测波长254nm，流速0.8ml/min，柱温30℃，理论塔板数按照甘草酸铵峰计不得低于3000。

记录色谱图(见图11)，色谱图扣除0～3.0min(溶剂峰)，采用2012年版中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以批号1401014N色谱图为参照图谱，进行多点校正，全谱图匹配，生成对照指纹图谱(见图12)，同时计算相似度，所得结果见表6。

表6不同批次指纹图谱相似度结果

批号	相识度
		1301006N	0.961
1301007N	0.958
		1303013N	0.996
1303014N	0.997
		1305007N	0.995
1305008N	0.996
		1309005N	0.994
1309006N	0.994
		1401013N	0.994
1401014N	0.993

试验结果表明：按照现工艺大生产试制产品，其相似度在0.95以上，说明按现工艺生产的试制批间差异小，产品相对稳定。

将得到的这10批样品的图谱经多点校正，全谱图匹配而生成对照指纹图谱，图谱稳定，具有很好的参照价值。

本研究通过多个波长的筛选、流动相考察、供试品制备优化、参照峰选择等确定了小儿止咳糖浆指纹图谱检测方法，通过方法学验证表明：小儿止咳糖浆指纹图谱的检测稳定、可靠、重复性好。

此外，本申请人还做过将待测样品用甲醇稀释45～55倍(如45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍等)后取5～20μl之间的任一数值(如5μl、6μl、8μl、10μl、12μl、15μl、18μl、20μl等)注入液相色谱仪进行测定，得到的图谱与用甲醇稀释50倍后取10μl注入液相色谱仪进行测定得到的图谱一致；测试了流速为0.8～0.9ml/min，柱温为29～31℃，测定得到的图谱一致。

将待测样品按照对照指纹图谱的方法进行检测，得到的图谱与对照指纹图谱进行比对，验证了多批样品，检测稳定、可靠、重复性好。

其中，对照指纹图谱中有10个特征峰，以甘草酸铵为参照，得到的其它峰的相对保留时间如下：1号峰0.209±0.38％、2号峰0.332±0.49％、3号峰0.338±0.40％、4号峰0.494±0.38％、5号峰0.522±0.49％、6号峰0.554±0.67％、7号峰0.827±0.55％、8号峰0.971±0.29％、9号峰1.000±0.28％、10号峰1.078±0.49％；

因此，通过该方法对每批产品进行检测，产品的待测液的制备为：用移液管精密量取本品1ml，置50ml容量瓶中，用甲醇冲洗移液管内壁，洗液并入量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得；同时检测参照物，参照物溶液的制备为：取甘草酸铵加甲醇制备成每1ml含40μg的溶液，即得。分别将参照物溶液和待测液注入液相色谱仪，测定得到特征指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱软件与对照指纹图谱进行对比，相似度在0.9以上，判定合格，否则不符合质量要求。如相似度低于0.9说明该批产品存在质量问题、影响小儿用药的安全性和有效性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种小儿止咳糖浆的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述液相色谱仪的检测条件为：

将得到的色谱图与对照指纹图谱比对判断待测样品的成分；

所述对照指纹图谱有10个特征峰，以甘草酸铵为参照，得到的其它峰的相对保留时间如下：1号峰0.209±0.38％、2号峰0.332±0.49％、3号峰0.338±0.40％、4号峰0.494±0.38％、5号峰0.522±0.49％、6号峰0.554±0.67％、7号峰0.827±0.55％、8号峰0.971±0.29％、9号峰1.000±0.28％、10号峰1.078±0.49％；

2.根据权利要求1所述的小儿止咳糖浆的检测方法，其特征在于，所述检测波长为254nm。

3.根据权利要求1所述的小儿止咳糖浆的检测方法，其特征在于，所述流速为0.8ml/min。

4.根据权利要求1所述的小儿止咳糖浆的检测方法，其特征在于，所述柱温为30℃。

5.根据权利要求1所述的小儿止咳糖浆的检测方法，其特征在于，待测样品注入液相色谱的体积为5～20μl。

6.根据权利要求1所述的小儿止咳糖浆的检测方法，其特征在于，待测样品注入液相色谱的体积为10～15μl。

7.根据权利要求1所述的小儿止咳糖浆的检测方法，其特征在于，小儿止咳糖浆待测样品的稀释倍数为45～55倍。

8.根据权利要求7所述的小儿止咳糖浆的检测方法，其特征在于，小儿止咳糖浆待测样品的稀释倍数为50倍。

9.根据权利要求1所述的小儿止咳糖浆的检测方法，其特征在于，检测待测样品时以甘草酸铵作为对照品。

10.根据权利要求1-9任一项所述的小儿止咳糖浆的检测方法，其特征在于，待测样品的色谱图与对照指纹图谱比对的相似度来判定为合格品。