CN109975450A

CN109975450A - 启脾口服液的含量测定方法

Info

Publication number: CN109975450A
Application number: CN201910092514.7A
Authority: CN
Inventors: 罗轶; 朱雪妍; 吕轶峰; 白桂昌; 林敬开; 覃丽郦; 罗永强
Original assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute Of Food And Drug Control
Current assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute Of Food And Drug Control
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2019-07-05

Abstract

本发明公开了一种启脾口服液的含量测定方法，该方法通过采用高效液相色谱法单独测定人参成分的含量、同时测定甘草和陈皮成分的含量两步实现启脾口服液含量的测定。该方法通过了方法学验证，精密度高、重现性好、稳定性好、回收率高、测定结果准确，该方法完善了启脾口服液的质量检测标准，为启脾口服液质量标准的建立奠定了基础。

Description

启脾口服液的含量测定方法

技术领域

本发明涉及中医药检测技术领域，具体是一种启脾口服液的含量测定方法。

背景技术

启脾口服液由人参、麸炒白术、茯苓、甘草、陈皮、山药、炒莲子、炒山楂、炒六神曲、炒麦芽等十一味药材组成。将人参用70%乙醇回流提取三次，第一次3小时，第二次2小时，第三次3小时，提取液回收乙醇液，药液另取容器收集；陈皮、麸炒白术提取挥发油备用；药渣及蒸馏后的水溶液与其余茯苓等八味药合并，加水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，煎液滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.12～1.20（85℃）的浸膏，加乙醇至含醇量达70%，搅匀，静置24小时，取上清液回收乙醇，滤过，加入蔗糖150g制成单糖浆，山梨酸钾1.5g用水溶解，将上述挥发油加入其中，混匀，调节pH至4.0～5.0，制成1000mL，搅匀，滤过，灭菌，分装，即得。

启脾口服液具健脾和胃之功效；临床用于脾胃虚弱，消化不良，腹胀便溏。在现行标准【含量测定】控制的指标中，启脾口服液的含量测定指标为人参中人参皂苷Rg₁与人参皂苷Re的总量，该指标均不能有效、整体性评价启脾口服液的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种启脾口服液的含量测定方法，该方法通过采用高效液相色谱法单独测定人参成分的含量、同时测定甘草和陈皮成分的含量两步实现启脾口服液含量的测定，该方法通过了方法学验证，精密度高、重现性好、稳定性好、回收率高、测定结果准确，该方法完善了启脾口服液的质量检测标准，为启脾口服液质量标准的建立奠定了基础。

为实现上述技术目的，具体内容如下：

一种启脾口服液的含量测定方法，包括以下两部分的内容：

（1）采用高效液相色谱法单独测定启脾口服液中人参成分的含量，具体包括以下内容：

1）色谱条件：Thermo Acclaim^TM RSLC C₁₂₀ C₁₈（2.1×100mm，2.2μm），以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm；理论板数按人参皂苷Rg₁峰计算应不低于10000。

2）对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品、人参皂苷Rc对照品、人参皂苷Rb₂对照品适量，精密称定；加甲醇制成每1mL含人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb₁对照品各0.2mg，人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Rc对照品及人参皂苷Rb₂对照品各0.1mg的混合溶液；即得。

3）供试品溶液的制备：精密量取样品50mL，加入三氯甲烷振摇提取3次，每次30mL，弃去三氯甲烷提取液，水液加水饱和正丁醇振摇提取5次（50mL、30mL、30mL、20mL、20mL），合并正丁醇提取液，加氨试液洗涤4次，每次50mL，弃去氨试液，再加入水饱和正丁醇轻轻振摇洗涤2次，每次50mL，弃去水洗液，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。

步骤3）所述样品每1mL含人参以人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)、人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)、人参皂苷Rb₁ (C₅₄H₉₂0₂₃)、人参皂苷Rc (C₅₃H₉₀O₂₂)和人参皂苷Rb₂（C₅₃H₉₀O₂₂）的总量计，不得少于80μg。

（2）采用高效液相色谱法同时测定启脾口服液中甘草和陈皮成分的含量，具体包括以下内容：

1）色谱条件：Kromasil100-5 C₁₈ (250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；甘草苷和甘草酸的检测波长为237nm，橙皮苷的检测波长为283nm；理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000，按橙皮苷峰计算应不得低于2000。

2）对照品溶液的制备：取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、橙皮苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1mL含甘草苷20μg、甘草酸20μg、橙皮苷0.12mg的溶液，即得，其中甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207；

3）供试品溶液的制备：取样品适量，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；

4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

步骤3）所述样品每1mL含甘草以甘草苷（C₂₁H₂₂O₉）计，不得少于12μg，以甘草酸（C₂₁H₂₂O₉）计，不得少于18μg；含陈皮以橙皮苷（C₂₈H₃₄O₁₅）计，不得少于30μg。

本发明的有益效果是：

本发明通过采用高效液相色谱法单独测定人参成分的含量、同时测定甘草和陈皮成分的含量两步实现启脾口服液含量的测定，建立了启脾口服液中人参（人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂）、甘草（甘草苷、甘草酸）、陈皮（橙皮苷）的含量测定方法，可以快速准确地考察启脾口服液中甘草、陈皮、人参的质量情况，检查企业是否存在不投料或少投料、劣药材投料的行为。本发明的方法通过了方法学验证，精密度高、重现性好、稳定性好、回收率高、测定结果准确，该方法完善了启脾口服液的质量检测标准，为启脾口服液质量标准的建立奠定了基础。

附图说明

图1是5种皂苷混合对照品溶液对照品的高效液相色谱图；

图2是启脾口服液（K公司，批号：20180313）人参成分检测的高效液相色谱图；

图3是启脾口服液（K公司，批号：20171155）人参成分检测的高效液相色谱图；

图4是启脾口服液人参含量测定的散点图；

图5是启脾口服液人参含量测定的直方图；

图6是甘草苷、甘草酸、橙皮苷混合对照品的高效液相色谱图；

图7是启脾口服液（K公司，批号：20180313）甘草、陈皮成分检测的高效液相色谱图；图中上部分检测波长为237nm，测甘草酸和甘草苷，下部分检测波长为283nm，测橙皮苷；

图8是启脾口服液甘草苷含量测定的散点图；

图9是启脾口服液甘草苷含量测定的直方图；

图10是启脾口服液甘草酸含量测定的散点图；

图11是启脾口服液甘草酸含量测定的直方图；

图12是启脾口服液橙皮苷含量测定的散点图；

图13是启脾口服液橙皮苷含量测定的直方图；

图14是启脾口服液（K公司，批号：20170518）人参成分检测色谱柱和流动相考察的高效液相色谱图；

图15是人参皂苷Rc的标准曲线图；

图16是人参皂苷Rg₁的标准曲线图；

图17是人参皂苷Re的标准曲线图；

图18是人参皂苷Rb₁的标准曲线图；

图19是人参皂苷Rb₂的标准曲线图；

图20是启脾口服液缺人参阴性样品、对照品、样品的高效液相色谱对照图，从上至下分别是对照品、样品、缺人参阴性样品；

图21是启脾口服液（K公司，批号：20170518）甘草、陈皮成分检测色谱柱和流动相考察的高效液相色谱图，图中橙皮苷附近的大峰是山梨酸；

图22是甘草苷的标准曲线图；

图23是甘草酸的标准曲线图；

图24是橙皮苷的标准曲线图；

图25是启脾口服液混合对照品溶液与缺甘草阴性样品的高效液相色谱图，检测波长为237nm；

图26是启脾口服液混合对照品溶液与缺陈皮阴性样品的高效液相色谱图，检测波长为283nm。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例，本申请人对启脾口服液处方中人参、麸炒白术、陈皮、甘草等药味进行多组分含量测定研究，结果麸炒白术中的白术内酯I、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ峰色谱杂质成分干扰大，难以有效分离，暂无法建立麸炒白术的含量测定方法。因此，本发明通过建立启脾口服液中人参（人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂）、甘草（甘草苷、甘草酸）、陈皮（橙皮苷）的含量测定方法，用以考察启脾口服液中甘草、陈皮、人参的质量情况，检查企业是否存在不投料或少投料、劣药材投料的行为。内容如下：

1、仪器与试药：

（1）仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪，配DAD检测器；ML204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

（2）试药：人参皂苷Rg₁（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：110703-201731，含量93.6%）；人参皂苷Re（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：110754-201626，含量97.4%）；人参皂苷Rb₁（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：110704-201625，含量95.0%）；人参皂苷Rc（Ginsenoside Pc，供含测用，批号：PR180313-01，含量100%）；人参皂苷Rb₂（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：111715-201203，含量93.8%）；甘草酸铵（中国药品生物制品检定研究院，批号110731-201619，纯度93.0%）；甘草苷（中国药品生物制品检定研究院，批号111610-201607，纯度93.1%）；橙皮苷（中国药品生物制品检定研究院，批号110721-201617，纯度96.1%）；乙腈试剂为色谱纯，其他试剂均为分析纯；

启脾口服液均为2018年国家评价性抽验的样品；方法考察所用启脾口服液为K公司生产，批号20170518。

2、测定内容：一种启脾口服液的含量测定方法，包括以下两部分：

3）供试品溶液的制备：精密量取样品50mL，加入三氯甲烷振摇提取3次，每次30mL，弃去三氯甲烷提取液，水液加水饱和正丁醇振摇提取5次（50mL、30mL、30mL、20mL、20mL），合并正丁醇提取液，加氨试液洗涤4次，每次50mL，弃去氨试液，再加入水饱和正丁醇振摇洗涤2次，每次50mL，弃去水洗液，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，测定，K公司24批启脾口服液的人参皂苷含量测定结果见表3。

2）采用高效液相色谱法同时测定启脾口服液中甘草和陈皮成分的含量，具体包括以下内容：

4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。K公司24批启脾口服液的含量测定结果见表4-5，图1-13。

从检测结果可以看出，K公司生产的启脾口服液各含量测定数据离散程度均较高，表明该企业的药材来源及生产工艺欠稳定。

本发明还进行了实验条件的考察及方法学验证：

1、针对启脾口服液中人参成分含量的测定：

（1）色谱柱和流动相的选择：

分别比较了以乙腈-水流动相不同梯度与流速洗脱的效果。经摸索，确定流动相梯度如表1，在此梯度下，分离效果好，峰形对称。见图14。

在色谱柱的选择上，我们试验了ACQUITY UPLC HSST3、CORTECS^TMUPLC C₁₈、Acclaim^TM RSLC C₁₈等，结果以Thermo Acclaim^TM RSLC C₁₂₀ C₁₈（2.1×100mm，2.2μm）的效果最佳，各峰之间的分离度良好，见图14。

（2）线性关系的考察

称取人参皂苷Rg₁对照品10.14mg（纯度93.6%）、人参皂苷Re对照品16.03mg（纯度97.4%）、人参皂苷Rb₁对照品20.15mg（纯度91.1%）、人参皂苷Rc对照品18.22mg（纯度100%）、人参皂苷Rb₂对照品12.61mg（纯度93.8%），分别置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得人参皂苷Rg₁储备液0.949mg/mL、人参皂苷Re储备液1.561mg/mL、人参皂苷Rb₁储备液1.836mg/mL、人参皂苷Rc储备液1.822mg/mL、人参皂苷Rb₂储备液1.183mg/mL。

分别吸取人参皂苷Re储备液3.00mL、人参皂苷Rc储备液3.00mL、人参皂苷Rb₂储备液2.00mL，置同一10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取上述对照品混合溶液5.00mL、人参皂苷Rg₁储备液与人参皂苷Rb₁储备液各2.50mL，置同一10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为标准曲线溶液①（人参皂苷Rg₁237.25μg/mL、人参皂苷Re234.15μg/mL、人参皂苷Rb₁459μg/mL、人参皂苷Rc273.3μg/mL、人参皂苷Rb₂118.3μg/mL）；精密吸取标准曲线溶液①1.00mL，置5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为标准曲线溶液②（人参皂苷Rg₁47.45μg/mL、人参皂苷Re46.85μg/mL、人参皂苷Rb₁91.8μg/mL、人参皂苷Rc54.65μg/mL、人参皂苷Rb₂23.65μg/mL）；精密吸取标准曲线溶液②1.00mL，置5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为标准曲线溶液③（人参皂苷Rg₁9.49μg/mL、人参皂苷Re9.37μg/mL、人参皂苷Rb₁18.36μg/mL、人参皂苷Rc10.93μg/mL、人参皂苷Rb₂4.73μg/mL）。

分别精密吸取混合对照品溶液①2μL、4μL（线性6、7），混合对照品溶液②1μL、3μL、5μL（线性3、4、5），混合对照品溶液③1μL、3μL（线性1、2）注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线。

结果表明：人参皂苷Rg₁对照品在9.49ng～237.25 ng，人参皂苷Re对照品在9.37ng～234.15 ng，人参皂苷Rb₁对照品在18.36ng～459ng，人参皂苷Rc对照品在10.93ng～273.30ng，人参皂苷Rb₂对照品在4.73ng～118.30ng范围内线性关系良好。结果见表6，图15-19。

（3）重复性考察：精密量取样品50mL，共取6份，按供试品溶液的制备方法，制得6份供试品溶液，各精密吸取1μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，测定峰面积，计算含量，结果见表7。

结果显示，启脾口服液6份样品测得的人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂含量的RSD均小于3%，符合方法学要求，表明该法重复性好。

（4）精密度考察：取重复性考察项下的同一份供试品溶液，重复进样6次，测定峰面积，计算RSD，结果人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂的峰面积RSD均小于3%，符合方法学要求，表明该法精密度好，见表8。

（5）稳定性考察：取重复性考察项下的一份供试品溶液，分别于0h、4h、8h、16h、20h、24h进样测定，记录峰面积，计算RSD，结果见表9。

结果显示，供试品溶液中人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂在24h内测得的峰面积RSD均小于3%，说明供试品溶液在24h内稳定。

（6）专属性考察：按处方比例称取一定量的缺人参阴性样品，并按供试品溶液的制备制成阴性样品溶液。分别吸取对照品溶液、阴性样品溶液、含人参供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，分析，结果阴性样品在对照品色谱峰相应位置无对应色谱峰，表明阴性无干扰，本法专属性好。见图20。

（7）回收率试验

精密称取人参皂苷Rg₁对照品11.11mg（含量93.6%）、人参皂苷Re对照品18.05mg（含量97.4%）、人参皂苷Rb₂对照品13.56mg（含量93.8%）、人参皂苷Rc对照品10.42mg（含量100%），分别置10mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，作为人参皂苷Rg₁储备液（1.040mg/mL）、人参皂苷Re储备液（1.758mg/mL）、人参皂苷Rb₂储备液（1.272mg/mL） 2.00mL、人参皂苷Rc储备液（1.042mg/mL）；精密称取人参皂苷Rb₁对照品15.42mg（含量91.1%）置15mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，作为人参皂苷Rb₁储备液（0.937mg/mL）。

精密量取人参皂苷Rg₁储备液3.00mL、人参皂苷Re储备液5.00mL、人参皂苷Rb₁储备液10.00mL、人参皂苷Rb₂储备液2.00mL、人参皂苷Rc储备液5.00mL，置同一200mL量瓶中，氮气吹干甲醇，加水使溶解稀释至刻度，摇匀，即得加样用对照品溶液（人参皂苷Rg₁0.0156mg/mL、人参皂苷Re 0.0440mg/mL、人参皂苷Rb₁0.0468mg/mL、人参皂苷Rc0.0260mg/mL、人参皂苷Rb₂0.0127mg/mL）。

取样品25mL（人参皂苷Rg₁：0.01545mg/mL、人参皂苷Re：0.04539 mg/mL、人参皂苷Rb₁：0.04877mg/mL、人参皂苷Rc：0.02595mg/mL、人参皂苷Rb₂：0.01278mg/mL），精密加入上述加样用对照品溶液25mL（人参皂苷Rg₁加入量0.2372mg、人参皂苷Re加入量0.3902mg、人参皂苷Rb₁加入量0.4588mg、人参皂苷Rb₂加入量0.2958mg、人参皂苷Rc加入量0.3415），再加入70%乙醇25mL，称定重量并按供试品溶液的制备方法制成加样样品溶液。

精密吸取加样样品溶液1μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算回收率，结果样品中人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc及人参皂苷Rb₂的回收率良好，符合方法学要求，见表10。

（8）限度拟定：本次评价性抽验的24批启脾口服液样品，均来自K公司。考虑到《中国药典》2015年版第一增补本已经将人参含量限度，人参皂苷Rg₁和人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)的总量由40μg/mL降低为29μg/mL，故暂将人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)、人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)、人参皂苷Rb₁ (C₅₄H₉₂0₂₃)、人参皂苷Rc (C₅₃H₉₀O₂₂)和人参皂苷Rb₃（C₅₃H₉₀O₂₂）的总量限度拟定为：样品每1mL含人参以人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)、人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)、人参皂苷Rb₁(C₅₄H₉₂0₂₃)、人参皂苷Rc (C₅₃H₉₀O₂₂)和人参皂苷Rb₃（C₅₃H₉₀O₂₂）的总量计，不得少于80μg。

2、针对启脾口服液中甘草、陈皮成分含量的测定：

（1）色谱柱和流动相的选择：

参照中国药典甘草中甘草苷、甘草酸的测定，采用乙腈-0.05%磷酸溶液系统进行梯度洗脱，经摸索，确定流动相梯度如下，在此梯度下，启脾口服液供试品溶液甘草苷、甘草酸、橙皮苷分离效果好，峰形对称，故选择乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脱作为流动相。

在色谱柱的选择上，分别试验了Kromasil100-5 C₁₈ (250mm×4.6mm，5μm)、XBridge^TM C₁₈ (250mm×4.6mm，5μm)、Shield RP C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)等色谱柱，结果以Kromasil100-5 C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)的效果最佳，各峰之间的分离度良好，见图21。

（2）供试品溶液制备的考察

分别对样品溶液直接进样、甲醇稀释进样、乙醇稀释进样3种方法进行比较。

直接进样：取样品适量，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液①。

甲醇稀释：取样品适量，混匀，精密吸取5.00mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液②。

乙醇稀释：取样品适量，混匀，精密吸取5.00mL，置10mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液③。

精密吸取供试品溶液①、②、③各10μL，注入液相色谱仪，测定，测定结果显示，样品溶液直接进样、甲醇稀释进样、乙醇稀释进样3种方法测得的结果一致，为实验操作方便，选择样品溶液直接进样，详见表11。

则拟定供试品溶液的制备方法如下：启脾口服液取样品适量，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

（3）线性关系试验

精密称取甘草苷对照品10.11mg（含量93.1%），置25mL量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀释至刻度，作为甘草苷对照品储备液（0.3765mg/mL）。精密称取橙皮苷对照品10.83mg（含量96.1%），置25mL量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀释至刻度，作为橙皮苷对照品储备液（0.4163mg/mL）。

精密称取甘草酸铵对照品10.69mg（含量93.0%），置10mL量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀释至刻度，作为甘草酸对照品储备液（甘草酸：0.9740mg/mL，甘草酸重量-甘草酸铵重量/1.0207）。

精密吸取甘草苷对照品储备液0.50mL、橙皮苷对照品储备液3.00mL、甘草酸对照品储备液1.00mL，置同一5mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液①；精密吸取混合对照品溶液①5.00mL，置10mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液②。

分别精密吸取混合对照品溶液①10μL、15μL、20μL、25μL（线性6、7、8、9），混合对照品溶液②1μL、2μL、5μL、8μL、10μL（线性1、2、3、5）注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线。

结果表明：甘草苷对照品在18.82ng～941ng，甘草酸对照品在0.0974μg～4.870μg，橙皮苷对照品在0.125μg～6.258μg范围内线性关系良好。结果见表12～13，图22～24。

（4）稳定性试验：对同一供试品溶液，按上述色谱条件，每隔一定时间测定一次，详见表14。试验表明，在24小时内，各个被测物均稳定。

（5）精密度试验：对同一供试品溶液，按上述色谱条件，连续测定6次。结果6次各成分峰面积的RSD均符合要求，详见表15。试验表明，本法的精密度良好。

（6）重复性试验：取启脾口服液样品6份，按供试品溶液的制备方法，制成供试品溶液，测定，计算，结果重复性良好。见表16。

（7）专属性试验：分别取缺甘草的阴性对照制剂和缺橙皮的阴性对照制剂，分别按供试品溶液制备方法依法制成缺甘草、陈皮的阴性对照溶液，进样测定。结果甘草阴性对照色谱中，在与甘草苷、甘草酸对照品色谱峰相应的位置上，未检出色谱峰，见图25；陈皮阴性对照色谱中，在与橙皮苷对照品色谱峰相应的位置上，未检出色谱峰，见图26。表明阴性对照无干扰。

（8）加样回收率试验

精密称取甘草苷对照品13.52mg（含量93.1%），置50mL量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，作为甘草苷对照品储备液（0.2517mg/mL）。精密称取橙皮苷对照品9.86mg（含量96.1%），置100mL量瓶中，加水加热使溶解并稀释至刻度，作为橙皮苷对照品储备液（0.09475mg/mL）。

精密称取甘草酸铵对照品10.13mg（含量93.0%），置50mL量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，作为甘草酸对照品储备液（甘草酸：0.1846mg/mL，甘草酸重量-甘草酸铵重量/1.0207）。

取已知含量的启脾口服液样品，混匀，精密吸取5.00mL，共6份，置10mL量瓶中，精密加入上述甘草苷对照品储备液（0.2517mg/mL）0.50mL，橙皮苷对照品储备液（0.09475mg/mL）3.00mL，甘草酸对照品储备液（甘草酸：0.1846mg/mL）1.00mL，再加水稀释至刻度，测定并计算，结果表明：本方法回收率良好，结果见表17。

（9）限度拟定：取本次测定的24批启脾口服液含量测定数据，计算平均值，并在此基础上下浮20%并适当放宽拟定限度，结果如下：样品每1mL含甘草以甘草苷（C₂₁H₂₂O₉）计，不得少于12μg；以甘草酸（C₂₁H₂₂O₉）计，不得少于18μg，含陈皮以橙皮苷（C₂₈H₃₄O₁₅）计，不得少于30μg。

Claims

1.一种启脾口服液的含量测定方法，其特征在于，所述方法包括以下两部分的内容：（1）采用高效液相色谱法单独测定启脾口服液中人参成分的含量，（2）采用高效液相色谱法同时测定启脾口服液中甘草和陈皮成分的含量。

2.根据权利要求1所述启脾口服液的含量测定方法，其特征在于，所述采用高效液相色谱法单独测定启脾口服液中人参成分的含量，具体包括以下内容：

（1）色谱条件：Thermo Acclaim^TM RSLC C₁₂₀ C₁₈（2.1×100mm，2.2μm），以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱50分钟；检测波长为203nm；理论板数按人参皂苷Rg₁峰计算应不低于10000；

（2）对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品、人参皂苷Rc对照品、人参皂苷Rb₂对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb₁对照品各0.2mg，人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Rc对照品及人参皂苷Rb₂对照品各0.1mg的混合溶液，即得；

（3）供试品溶液的制备：精密量取样品50mL，加入三氯甲烷振摇提取3次，每次30mL，弃去三氯甲烷提取液，水液加水饱和正丁醇振摇提取5次，水饱和正丁醇的加入量依次是50mL、30mL、30mL、20mL、20mL，合并正丁醇提取液，加氨试液洗涤4次，每次50mL，弃去氨试液，再加入水饱和正丁醇轻轻振摇洗涤2次，每次50mL，弃去水洗液，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得；

（4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。

3.根据权利要求2所述采用高效液相色谱法单独测定启脾口服液中人参成分的含量，其特征在于，步骤（3）所述样品每1mL含人参以人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)、人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)、人参皂苷Rb₁ (C₅₄H₉₂0₂₃)、人参皂苷Rc (C₅₃H₉₀O₂₂)和人参皂苷Rb₂（C₅₃H₉₀O₂₂）的总量计，不得少于80μg。

4.根据权利要求1所述启脾口服液的含量测定方法，其特征在于，所述采用高效液相色谱法同时测定启脾口服液中甘草和陈皮成分的含量，具体包括以下内容：

（1）色谱条件：Kromasil100-5 C₁₈ (250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱40分钟；甘草苷和甘草酸的检测波长为237nm，橙皮苷的检测波长为283nm；理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000，按橙皮苷峰计算应不得低于2000；

（2）对照品溶液的制备：取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、橙皮苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1mL含甘草苷20μg、甘草酸20μg、橙皮苷0.12mg的溶液，即得；其中甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207；

（3）供试品溶液的制备：取样品适量，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；

（4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

5.根据权利要求4所述采用高效液相色谱法同时测定启脾口服液中甘草和陈皮成分的含量，其特征在于，步骤（3）所述样品每1mL含甘草以甘草苷（C₂₁H₂₂O₉）计，不得少于12μg，以甘草酸（C₂₁H₂₂O₉）计，不得少于18μg；含陈皮以橙皮苷（C₂₈H₃₄O₁₅）计，不得少于30μg。