CN109856276A

CN109856276A - 启脾丸的含量测定方法

Info

Publication number: CN109856276A
Application number: CN201910093695.5A
Authority: CN
Inventors: 罗轶; 朱雪妍; 吕轶峰; 白桂昌; 林敬开; 覃丽郦; 罗永强
Original assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute Of Food And Drug Control
Current assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute Of Food And Drug Control
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: CN109856276B

Abstract

本发明公开了一种启脾丸的含量测定方法，该方法通过采用高效液相色谱法单独测定人参成分的含量、同时测定甘草和陈皮成分的含量两步实现启脾丸含量的测定。该方法通过了方法学验证，精密度高、重现性好、稳定性好、回收率高、测定结果准确，该方法完善了启脾丸的质量检测标准，为启脾丸质量标准的建立奠定了基础。

Description

启脾丸的含量测定方法

技术领域

本发明涉及中医药检测技术领域，具体是一种启脾丸的含量测定方法。

背景技术

启脾丸（大蜜丸）由人参、麸炒白术、茯苓、甘草、陈皮、山药、莲子（炒）、炒山楂、六神曲（炒）、炒麦芽、泽泻等十一味药材细粉加炼蜜混合制得而成。启脾丸（水丸）由人参、麸炒白术、茯苓、甘草、陈皮、山药、莲子（炒）、炒山楂、六神曲（炒）、炒麦芽、泽泻等十一味药材细粉，过筛，混匀，用水泛丸，打光，干燥制得而成。

启脾丸具健脾和胃之功效；临床用于脾胃虚弱，消化不良，腹胀便溏。现行标准中国药典2015年版【含量测定】中，仅有对甘草的含量测定项目，而作为主药之一的人参只有薄层鉴别，并没有含量测定，这不利于对启脾丸整体质量的控制。陈洪岩等人在期刊“高效液相色谱四级杆飞行时间串联质谱法测定启脾丸中7种人参皂苷的含量” 《中国药师》2017年第3期中，公开了可以采用高效液相色谱四级杆飞行时间串联质谱(HPLC—QTOF．MS)梯度洗脱法同时测定7种人参皂苷的含量。寇亮也在期刊“高效液相色谱法测定启脾丸中橙皮苷的含量” 《西北民族大学学报:自然科学版》2009年第4期中，公开了可以利用高效液相色谱法测定启脾丸中橙皮苷的含量。虽然将两篇期刊的方法与中国药典2015年版结合也能够测定启脾丸中人参、甘草、陈皮的含量，可是其步骤比较繁琐，方法不够完善，因此，需要对其进行进一步的完善，简化含量测定的步骤，为启脾丸整体质量的控制提供技术基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种启脾丸的含量测定方法，该方法通过采用高效液相色谱法单独测定人参成分的含量、同时测定甘草和陈皮成分的含量两步实现启脾丸含量的测定，该方法通过了方法学验证，精密度高、重现性好、稳定性好、回收率高、测定结果准确，为启脾丸质量标准的建立奠定了基础。

为实现上述技术目的，具体内容如下：

启脾丸包括大蜜丸和水丸；一种启脾丸的含量测定方法包括以下两部分的内容：

1、采用高效液相色谱法单独测定启脾丸中人参成分的含量，具体包括以下内容：

（1）色谱条件：Thermo Acclaim^TM RSLC C₁₂₀ C₁₈（2.1×100mm，2.2μm），以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm；理论板数按人参皂苷Rg₁峰计算应不低于10000。

（2）对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品、人参皂苷Rc对照品、人参皂苷Rb₂对照品适量，精密称定；加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg₁对照品及人参皂苷Rb₁对照品各0.1mg，人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rc对照品及人参皂苷Rb₂对照品各0.5mg的混合溶液；即得。

（3）供试品溶液的制备：取样品10丸，剪碎，取大蜜丸5g或取水丸2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL（剩余滤液作为甘草、陈皮含量测定用），蒸干，残渣加水30mL使溶解，用水饱和正丁醇提取3次，每次50mL，合并正丁醇提取液，用氨试液50mL洗涤，弃去氨试液，再用水饱和正丁醇50mL洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

（4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。

内容1步骤（3）所述样品含人参以人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)、人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)、人参皂苷Rb₁ (C₅₄H₉₂0₂₃)、人参皂苷Rc (C₅₃H₉₀O₂₂)和人参皂苷Rb₂（C₅₃H₉₀O₂₂）的总量计，大蜜丸每丸不得少于1.4mg，水丸每粒不得少于0.14mg。

2、采用高效液相色谱法同时测定启脾丸中甘草和陈皮成分的含量，具体包括以下内容：

（1）色谱条件：Kromasil100-5 C₁₈ (250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；甘草苷和甘草酸的检测波长为237nm，橙皮苷的检测波长为283nm；理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000，按橙皮苷峰计算应不得低于2000。

（2）对照品溶液的制备：取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、橙皮苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1mL含甘草苷20μg、甘草酸铵0.1mg、橙皮苷0.12mg的溶液，即得。

（3）供试品溶液的制备：取样品10丸，剪碎，取大蜜丸5g或取水丸2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

（4）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

内容2步骤（3）所述样品每丸含甘草以甘草苷（C₂₁H₂₂O₉）计，大蜜丸每丸不得少于0.32mg，水丸每粒不得少于0.032mg；以甘草酸（C₂₁H₂₂O₉）计，大蜜丸每丸不得少于1.3mg，水丸每粒不得少于0.13mg；含陈皮以橙皮苷（C₂₈H₃₄O₁₅）计，大蜜丸每丸不得少于1.8mg，水丸每粒不得少于0.18mg。

本发明的有益效果是：

本发明通过采用高效液相色谱法单独测定人参成分的含量、同时测定甘草和陈皮成分的含量两步实现启脾丸含量的测定，建立了启脾丸中人参（人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂）、甘草（甘草苷、甘草酸）、陈皮（橙皮苷）的含量测定方法，可以快速准确地考察启脾丸中甘草、陈皮、人参的质量情况，检查企业是否存在不投料或少投料、劣药材投料的行为。本发明的方法通过了方法学验证，精密度高、重现性好、稳定性好、回收率高、测定结果准确，该方法完善了启脾丸的质量检测标准，为启脾丸质量标准的建立奠定了基础。

附图说明

图1是启脾丸（C公司，批号：171001）人参成分检测的高效液相色谱图；

图2是人参皂苷Rc的标准曲线图；

图3是人参皂苷Rg₁的标准曲线图；

图4是人参皂苷Re的标准曲线图；

图5是人参皂苷Rb₁的标准曲线图；

图6是人参皂苷Rb₂的标准曲线图；

图7是启脾丸缺人参阴性样品、对照品、对照制剂样品的高效液相色谱图；

图8是启脾丸（C公司，批号：171001）甘草、陈皮成分检测的高效液相色谱图；

图9是甘草苷的标准曲线图；

图10是甘草酸的标准曲线图；

图11是橙皮苷的标准曲线图；

图12启脾丸混合对照品溶液与缺甘草阴性样品的高效液相色谱图，检测波长为237nm；

图13启脾丸混合对照品溶液与缺陈皮阴性样品的高效液相色谱图，检测波长为283nm。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例，内容如下：

一、仪器与试药

安捷伦1290 超高效液相色谱仪，配DAD检测器；ML204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），Hei-VAP 型旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）。

人参皂苷Rg₁（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：110703-201731，含量93.6%）；人参皂苷Re（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：110754-201626，含量97.4%）；人参皂苷Rb₁（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：110704-201625，含量95.0%）；人参皂苷Rc（Ginsenoside Pc，供含测用，批号：PR180313-01，含量100%）；人参皂苷Rb₂（中国食品药品检定研究院提供，供含测用，批号：111715-201203，含量93.8%）；甘草酸铵（中国药品生物制品检定研究院提供，批号：110731-201619，纯度93.0%）；甘草苷（中国药品生物制品检定研究院提供，批号：111610-201607，纯度93.1%）；橙皮苷（中国药品生物制品检定研究院提供，批号：110721-201617，纯度96.1%）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

64批启脾丸均为2018年国家评价性抽验的样品，方法考察所用启脾丸为C公司生产，批号：171001。生产单位的名称均用字母代替，一个字母对应一个单位名称，同日申请的几个专利在此保持一致。

二、启脾丸包括大蜜丸和水丸；一种启脾丸的含量测定方法包括以下两部分的内容：

采用以上方法对不同厂家不同批号的64批启脾丸进行检测，测定结果见表3～4。

采用上述方法对不同厂家不同批号的64批启脾丸进行检测，结果见含量测定结果汇总表5～6。对各厂家的产品进行统计见统计表7～8。

最后进行限度拟定并计算合格率：

（1）人参：本次评价性抽验的64批启脾丸样品，其中大蜜丸62批，分别来自10家不同的生产单位；水丸2批，全部来自同1家单位。以人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)、人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)、人参皂苷Rb₁ (C₅₄H₉₂0₂₃)人参皂苷Rc (C₅₃H₉₀O₂₂)和人参皂苷Rb₃（C₅₃H₉₀O₂₂）5种人参皂苷总含量拟定限度，根据所有样品的平均值下浮20%拟定，但我们发现A公司寄送的人参药材中掺杂有西洋参，且探索性研究中发现本次抽样涉及的A公司和E公司2家生产单位生产的6批样品均存在西洋参掺伪的严重问题，这2家生产单位的样品5种人参皂苷的总含量均远远高于其他企业的样品，故我们对62个批号样品进行筛选，去掉存在西洋参掺伪问题的批号，然后计算平均值，下浮20%并适当放宽拟定限度。5种人参皂苷总含量的平均值为2.06mg/丸，拟定启脾丸大蜜丸5种人参皂苷的总含量不得少于1.4 mg/丸。

本次评价性抽验的水丸仅有2批，没有收到小蜜丸的样品，水丸和小蜜丸的含量限度，参照大蜜丸的含量限度，按处方量计算。

综上所述，拟定限度如下：样品每丸含人参以以人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)、人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)、人参皂苷Rb₁ (C₅₄H₉₂0₂₃)、人参皂苷Rc (C₅₃H₉₀O₂₂)和人参皂苷Rb₃（C₅₃H₉₀O₂₂）的总量计，大蜜丸每丸不得少于1.4mg，水丸每粒不得少于0.14mg。

（2）甘草、陈皮：依据启脾丸处方量，甘草和陈皮为细粉直接入药，故根据《中国药典》2015年版一部“甘草”、“陈皮”项下甘草苷、甘草酸和橙皮苷的含量限度，及样品的【处方】和【制法】，计算理论含量，按90%转移率拟定限度，结果如下：

样品每丸含甘草以甘草苷（C₂₁H₂₂O₉）计，小蜜丸每1g不得少于0.10mg，大蜜丸每丸不得少于0.32mg，水丸每粒不得少于0.032mg；以甘草酸（C₂₁H₂₂O₉）计，小蜜丸每1g不得少于0.43mg，大蜜丸每丸不得少于1.3mg，水丸每粒不得少于0.13mg；含陈皮以橙皮苷（C₂₈H₃₄O₁₅）计，小蜜丸每1g不得少于0.60mg，大蜜丸每丸不得少于1.8mg，水丸每粒不得少于0.18mg。

结果判定：对10家生产单位、去重批号的64批样品进行测定，结果人参皂苷总量与陈皮中橙皮苷含量均符合规定；A公司2批样品的甘草酸不符合规定，不合格率3.1%；14批样品中甘草苷不符合规定，不合格率21.9%，其中J制药厂甘草苷含量不合格率为57.1%，分析为投料所至；共有15批次样品不符合规定，不合格率23.4%。详见表9。

本发明还进行了实验条件的考察及方法学验证：

1、针对启脾丸中人参成分含量的测定：

（1）色谱柱和流动相的选择：

分别比较了以乙腈-水流动相不同梯度与流速洗脱的效果。经摸索，确定流动相梯度如表1，在此梯度下，分离效果好，峰形对称。见图1。

在色谱柱的选择上，我们试验了ACQUITY UPLC HSST3、CORTECS^TMUPLC C₁₈、Acclaim^TM RSLC C₁₈等，结果以Thermo Acclaim^TM RSLC C₁₂₀ C₁₈（2.1×100mm，2.2μm）的效果最佳，各峰之间的分离度良好。见图1。

（2）供试品溶液制备的考察。

1）提取方法的选择：分别对超声提取、加热回流、放置过夜加热回流进行比较。

①超声提取：取样品10丸，剪碎，取5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，超声处理30分钟（功率320W，频率40kHz），放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，加水30mL使溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取3次，每次50mL，合并正丁醇提取液，用氨试液50mL洗涤，弃去氨试液，再用水饱和正丁醇50mL洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过（0.22μm滤膜），即得。

②加热回流：取样品10丸，剪碎，取约5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，加水30mL使溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取3次，每次50mL，合并正丁醇提取液，用氨试液50mL洗涤，弃去氨试液，再用水饱和正丁醇50mL洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过（0.22μm滤膜），即得。

③放置过夜加热回流：取样品10丸，剪碎，取约5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，放置过夜，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，加水30mL使溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取3次，每次50mL，合并正丁醇提取液，用氨试液50mL洗涤，弃去氨试液，再用水饱和正丁醇50mL洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过（0.22μm滤膜），即得。

结果表明，加热回流提取待测成分含量高于超声提取，但放置过夜与未放置过夜未见明显差异，故选择加热回流方式进行提取，详见表10。

2）提取溶剂的选择

分别考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、无水乙醇、70%乙醇及50%乙醇六种溶剂的提取效果。

取样品10丸（袋），剪碎（粉碎），取适量（约相当于人参0.25g），精密称定6份，置锥形瓶中，精密加入上述六种溶剂50mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，加水30mL使溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取3次，每次50mL，合并正丁醇提取液，用氨试液50mL洗涤，弃去氨试液，再用水饱和正丁醇50mL洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过（0.22μm滤膜），即得。

测定结果显示，70%甲醇与70%乙醇提取待测成分含量较高，乙醇毒性较小，故选择70%乙醇为提取溶剂，详见表11。

3）提取溶剂用量的选择

取样品10丸，剪碎，取约5g，精密称定3份，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇20mL、50mL、100mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL、25mL、50mL，蒸干，加水30mL使溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取3次，每次50mL，合并正丁醇提取液，用氨试液50mL洗涤，弃去氨试液，再用水饱和正丁醇50mL洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过（0.22μm滤膜），即得。结果当70%乙醇用量为50mL、100mL时，待测成分提取较完全，故选择70%乙醇用量为50mL，详见表12。

4）提取时间的选择

分别比较了回流提取15分钟、30分钟、60分钟、90分钟的效果。

取样品10丸，剪碎，取约5g，取适量（约相当于人参0.25g），精密称定4份，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，加热回流15、30、60分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，加水30mL使溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取3次，每次50mL，合并正丁醇提取液，用氨试液50mL洗涤，弃去氨试液，再用水饱和正丁醇50mL洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过（0.22μm滤膜），即得。

测定结果显示，回流提取30分钟已基本提取完全，考虑到样品含量之间的差异，故选择提取60分钟，详见表13。

综合以上研究，拟定供试品溶液的制备方法如下：

取样品10丸，剪碎，取约5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL（剩余滤液作为甘草、陈皮含量测定用），蒸干，加水30mL使溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取3次，每次50mL，合并正丁醇提取液，用氨试液50mL洗涤，弃去氨试液，再用水饱和正丁醇50mL洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过（0.22μm滤膜），即得。

（3）线性关系的考察

称取人参皂苷Rg₁对照品10.14mg（纯度93.6%）、人参皂苷Re对照品16.03mg（纯度97.4%）、人参皂苷Rb₁对照品20.15mg（纯度91.1%）、人参皂苷Rc对照品18.22mg（纯度100%）、人参皂苷Rb₂对照品12.61mg（纯度93.8%），分别置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得人参皂苷Rg₁储备液0.949mg/mL、人参皂苷Re储备液1.561mg/mL、人参皂苷Rb₁储备液1.836mg/mL、人参皂苷Rc储备液1.822mg/mL、人参皂苷Rb₂储备液1.183mg/mL。

分别吸取人参皂苷Re储备液3.00mL、人参皂苷Rc储备液3.00mL、人参皂苷Rb₂储备液2.00mL，置同一10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取上述对照品混合溶液5.00mL、人参皂苷Rg₁储备液与人参皂苷Rb₁储备液各2.50mL，置同一10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为标准曲线溶液①（人参皂苷Rg₁237.25μg/mL、人参皂苷Re234.15μg/mL、人参皂苷Rb₁459μg/mL、人参皂苷Rc273.3μg/mL、人参皂苷Rb₂118.3μg/mL）；精密吸取标准曲线溶液①1.00mL，置5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为标准曲线溶液②（人参皂苷Rg₁47.45μg/mL、人参皂苷Re46.85μg/mL、人参皂苷Rb₁91.8μg/mL、人参皂苷Rc54.65μg/mL、人参皂苷Rb₂23.65μg/mL）；精密吸取标准曲线溶液②1.00mL，置5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为标准曲线溶液③（人参皂苷Rg₁9.49μg/mL、人参皂苷Re9.37μg/mL、人参皂苷Rb₁18.36μg/mL、人参皂苷Rc10.93μg/mL、人参皂苷Rb₂4.73μg/mL）。

分别精密吸取混合对照品溶液①2μL、4μL（线性6、7），混合对照品溶液②液1μL、3μL、5μL（线性3、4、5），混合对照品溶液③液1μL、3μL（线性1、2）注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线。

结果表明：人参皂苷Rg₁对照品在9.49ng～237.25 ng，人参皂苷Re对照品在9.37ng～234.15 ng，人参皂苷Rb₁对照品在18.36ng～459ng，人参皂苷Rc对照品在10.93ng～273.30ng，人参皂苷Rb₂对照品在4.73ng～118.30ng范围内线性关系良好。结果见表14，图2-6。

（4）重复性考察：取样品适量，研细，取5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，共取6份，按供试品溶液的制备方法，制得6份供试品溶液，各精密吸取1μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，测定峰面积，计算含量，结果见表15。

结果显示，启脾丸样品测得的人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂含量的RSD均小于3%，符合方法学要求，表明该法重复性好。

（5）精密度考察：取“重复性考察”项下的同一份供试品溶液，重复进样6次，测定峰面积，计算RSD，结果人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂的峰面积RSD均小于3%，符合方法学要求，表明该法精密度好，见表16。

（6）稳定性考察：取“重复性考察”项下的一份样品溶液，分别于0h、4h、8h、16h、20h、24h进样，记录峰面积，计算RSD，结果见表17。

结果显示，供试品溶液中人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₂在24h内测得的峰面积RSD均小于3%，说明供试品溶液在24h内稳定。

（7）专属性考察：按处方比例称取一定量的缺人参阴性样品，并按供试品溶液的制备制成阴性样品溶液。分别吸取对照品溶液、阴性样品溶液、供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，分析，结果阴性样品在对照品色谱峰相应位置无对应色谱峰，表明阴性无干扰，本法专属性好。见图7。

（8）回收率试验：

精密吸取“线性关系考察”项下人参皂苷Rg₁储备液（0.949mg/mL）、人参皂苷Re储备液（1.561mg/mL）、人参皂苷Rb₁储备液（1.836mg/mL）、人参皂苷Rb₂储备液（1.183mg/mL）各2.00mL，人参皂苷Rc储备液（1.822mg/mL）1.50mL，置同一200mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得加样用对照品溶液（人参皂苷Rg₁ 9.49μg/mL、人参皂苷Re 15.61μg/mL、人参皂苷Rb₁ 18.36μg/mL、人参皂苷Rb₂ 11.83μg/mL、人参皂苷Rc13.66μg/mL）。

取样品适量，研细，取约2.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入加样用对照品溶液25mL（人参皂苷Rg₁加入量0.2372mg、人参皂苷Re加入量0.3902mg、人参皂苷Rb₁加入量0.4588mg、人参皂苷Rb₂加入量0.2958mg、人参皂苷Rc加入量0.3415），再加入70%乙醇25mL，称定重量，并按供试品溶液的制备方法制成加样样品溶液。

精密吸取加样样品溶液1μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算回收率，结果样品中人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rc及人参皂苷Rb₂的回收率良好，符合方法学要求，见表18。

2、针对启脾丸中甘草、陈皮成分含量的测定：

（1）色谱柱和流动相的选择：

参照中国药典甘草中甘草苷、甘草酸的测定，采用乙腈-0.05%磷酸溶液系统进行梯度洗脱，经摸索，确定流动相梯度如下，在此梯度下，启脾丸供试品溶液甘草苷、甘草酸、橙皮苷分离效果好，峰形对称，故选择乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脱作为流动相。

在色谱柱的选择上，分别试验了Kromasil100-5 C₁₈ (250mm×4.6mm，5μm)、XBridge^TM C₁₈ (250mm×4.6mm，5μm)、Shield RP C₁₈ (250mm×4.6mm，5μm)等色谱柱，结果以Kromasil100-5 C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)的效果最佳，各峰之间的分离度良好。见图8。

（2）供试品溶液制备的考察:

1)提取方法的选择

分别对超声处理、加热回流提取方法进行比较。

超声提取：取样品10丸，剪碎，取5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，超声处理30分钟（功率320W，频率40kHz），放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

加热回流：取样品10丸，剪碎，取约5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

放置过夜加热回流：取样品10丸，剪碎，取约5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，放置过夜，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

测定结果显示，加热回流提取待测成分含量较高，且放置过夜与直接回流结果接近，故选择加热回流提取。

2）提取溶剂的选择

取样品10丸（袋），剪碎（粉碎），取5g（约相当于人参0.25g），精密称定6份，置锥形瓶中，精密加入上述六种溶剂50mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

测定结果显示，70%甲醇与70%乙醇提取待测成分含量较高，乙醇毒性较小，故选择70%乙醇为提取溶剂，详见表20。

3）提取溶剂用量的选择

分别对70%乙醇的用量：20mL、50mL、100mL进行考察，结果当70%乙醇用量为50mL、100mL时，待测成分提取较完全，故选择70%乙醇用量为50mL，详见表21。

4）提取时间的选择

分别比较了回流提取15分钟、30分钟、60分钟的效果。

取样品10丸，剪碎，取约5g，取适量，精密称定3份，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，加热回流15、30、60分钟，放冷，即得。

测定结果显示，回流提取30分钟已基本达到提取完全，故选择提取30分钟，详见表22。

综合以上研究，拟定供试品溶液的制备方法如下：

取样品10丸，剪碎，取约5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过(精密吸取续滤液25mL做人参测定的样品后，剩余滤液作为供试品溶液)，即得。

（3）线性关系试验

精密称取甘草苷对照品10.11mg（含量93.1%），置25mL量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀释至刻度，作为甘草苷对照品储备液（0.3765mg/mL）。精密称取橙皮苷对照品10.83mg（含量96.1%），置25mL量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀释至刻度，作为橙皮苷对照品储备液（0.4163mg/mL）。精密称取甘草酸铵对照品10.69mg（含量93.0%），置10mL量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀释至刻度，作为甘草酸对照品储备液（甘草酸：0.9740mg/mL，甘草酸重量-甘草酸铵重量/1.0207）。

精密吸取甘草苷对照品储备液0.50mL、橙皮苷对照品储备液3.00mL、甘草酸对照品储备液1.00mL，置同一5mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液①；精密吸取混合对照品溶液①5.00mL，置10mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液②。

分别精密吸取混合对照品溶液①10μL、15μL、20μL、25μL（线性5、6、7、8），混合对照品溶液②1μL、2μL、5μL、8μL、10μL（线性1、2、3、4）注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线。

结果表明：甘草苷对照品在18.82ng～941ng，甘草酸对照品在0.0974μg～4.870μg，橙皮苷对照品在0.125μg～6.258μg，范围内线性关系良好。结果见表23～24，图9～11。

（4）稳定性试验：对同一供试品溶液，按上述色谱条件，每隔一定时间测定一次，详见表25。试验表明，在24小时内，各个被测物均稳定。

（5）精密度试验：对同一供试品溶液，按上述色谱条件，连续测定6次。结果6次各成分峰面积的RSD均符合要求，详见表26。试验表明，本法的精密度良好。

（6）重复性试验：取启脾丸样品6份，按供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，测定，计算，结果重复性良好。见表27。

（7）专属性试验：分别取缺甘草的阴性对照制剂和缺橙皮的阴性对照制剂5g，按供试品溶液制备方法依法制成缺甘草、陈皮的阴性对照溶液，进样测定。结果甘草阴性对照色谱中，在与甘草苷、甘草酸对照品色谱峰相应的位置上，未检出色谱峰，见图12；陈皮阴性对照色谱中，在与橙皮苷对照品色谱峰相应的位置上，未检出色谱峰，见图13。表明阴性对照无干扰。

（8）加样回收率试验

加样用对照品溶液的配制：精密吸取线性关系试验项下的甘草苷对照品储备液10mL，精密称取橙皮苷对照品32.49mg、甘草酸铵对照品15.43mg，置同一20mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得（含甘草苷对照品11.76μg/mL、橙皮苷对照品97.57μg/mL、甘草酸对照品46.16μg/mL）。

测定：取已知含量的启脾丸样品，研细，取约2.5g，共6份，精密称定，精密加入加样用对照品溶液25mL，，再精密加入70%乙醇，依法制备供试品溶液，测定并计算，结果表明：本方法回收率良好，结果见表28。

Claims

1.一种启脾丸的含量测定方法，其特征在于，所述启脾丸包括大蜜丸和水丸；方法包括以下两部分的内容：（1）采用高效液相色谱法单独测定启脾丸中人参成分的含量，（2）采用高效液相色谱法同时测定启脾丸中甘草和陈皮成分的含量。

2.根据权利要求1所述启脾丸的含量测定方法，其特征在于，所述采用高效液相色谱法单独测定启脾丸中人参成分的含量，具体包括以下内容：

（1）色谱条件：Thermo Acclaim^TM RSLC C₁₂₀ C₁₈（2.1×100mm，2.2μm），以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱50分钟；检测波长为203nm；理论板数按人参皂苷Rg₁峰计算应不低于10000；

（2）对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb₁对照品、人参皂苷Rc对照品、人参皂苷Rb₂对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg₁对照品及人参皂苷Rb₁对照品各0.1mg，人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rc对照品及人参皂苷Rb₂对照品各0.5mg的混合溶液，即得；

（3）供试品溶液的制备：取样品10丸，剪碎，取大蜜丸5g或取水丸2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加水30mL使溶解，用水饱和正丁醇提取3次，每次50mL，合并正丁醇提取液，用氨试液50mL洗涤，弃去氨试液，再用水饱和正丁醇50mL洗涤1次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至5mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得；

3.根据权利要求2所述采用高效液相色谱法单独测定启脾丸中人参成分的含量，其特征在于，步骤（3）所述样品含人参以人参皂苷Rg₁(C₄₂H₇₂O₁₄)、人参皂苷Re(C₄₈H₈₂O₁₈)、人参皂苷Rb₁ (C₅₄H₉₂0₂₃)、人参皂苷Rc (C₅₃H₉₀O₂₂)和人参皂苷Rb₂（C₅₃H₉₀O₂₂）的总量计，大蜜丸每丸不得少于1.4mg，水丸每粒不得少于0.14mg。

4.根据权利要求1所述启脾丸的含量测定方法，其特征在于，所述采用高效液相色谱法同时测定启脾丸中甘草和陈皮成分的含量，具体包括以下内容：

（1）色谱条件：Kromasil100-5 C₁₈ (250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱40分钟；甘草苷和甘草酸的检测波长为237nm，橙皮苷的检测波长为283nm；理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000，按橙皮苷峰计算应不得低于2000；

（2）对照品溶液的制备：取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、橙皮苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1mL含甘草苷20μg、甘草酸铵0.1mg、橙皮苷0.12mg的溶液，即得；

（3）供试品溶液的制备：取样品10丸，剪碎，取大蜜丸5g或取水丸2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得；

5.根据权利要求4所述采用高效液相色谱法同时测定启脾丸中甘草和陈皮成分的含量，其特征在于，步骤（3）所述样品每丸含甘草以甘草苷（C₂₁H₂₂O₉）计，大蜜丸每丸不得少于0.32mg，水丸每粒不得少于0.032mg；以甘草酸（C₂₁H₂₂O₉）计，大蜜丸每丸不得少于1.3mg，水丸每粒不得少于0.13mg；含陈皮以橙皮苷（C₂₈H₃₄O₁₅）计，大蜜丸每丸不得少于1.8mg，水丸每粒不得少于0.18mg。