CN110297052A - 消痞和胃中药制剂中三七含量的hplc测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种消痞和胃中药制剂中三七含量的HPLC测定方法。该方法包括：(1)对照品人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1溶液的制备；(2)供试品消痞和胃中药制剂溶液的制备；(3)HPLC测定。本发明的方法操作简便、准确度高、专属性好、精密度和重现性良好，能保证消痞和胃中药制剂的质量稳定。

Description

消痞和胃中药制剂中三七含量的HPLC测定方法
技术领域
本发明涉及药物质量控制方法技术领域，具体涉及一种消痞和胃中药制剂中三七含量的HPLC测定方法。
背景技术
消痞和胃中药制剂主要是隔山消、刺梨叶、柳枝、三七按一定重量配比制备而成。理气和胃，消痞止痛。用于脾胃气滞所致的胃脘灼热胀痛，泛吐酸水，痞满嘈杂。消痞和胃中药制剂顾名思义就是用来消痞和胃的，因为消痞和胃中药制剂四种不同的中药成分共奏理气和胃，消痞止痛之功效。在临床试验上也证明消痞和胃中药制剂具有不错的治疗效果，比如消痞和胃中药制剂具有调节胃肠运动，促进胃排空的作用。试验证明：消痞和胃中药制剂临床和动物实验均未观察到明显毒副作用，服用消痞和胃中药制剂安全，临床疗效显著,具有推广应用价值。
有关消痞和胃中药制剂的质量标准和质量控制方法，现有技术中的测量方法是测定人参皂苷Rg1(C42H72O14)和三七皂苷R1(C47H80O18)的总量，为三七有效成分中的两个目标物，而中药混合物药材中有可能某一个的有效成分含量高，某一个有效成分含量低，不能全面的体现三七药材的质量。目前尚未有统一成熟的标准，也尚未有关于消痞和胃中药制剂中三七含量控制的成熟做法，因此迫切需要一种能够快速、高效地测定消痞和胃中药制剂中三七活性成分含量的测定方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明的一个目的在于提出一种所需时间短、简单易行、鉴定结果客观准确的消痞和胃中药制剂中三七含量的检测方法。
本发明的技术方案为，建立一种消痞和胃中药制剂中三七含量的HPLC测定方法，包括分别制备供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱法测定，其特征在于：
所述对照品：人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1；
所述色谱的条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.01-0.1％磷酸溶液为流动相B，A+B＝100％，采用梯度洗脱：0-35min，15-25％A，35-55min，19-29％A，55-60min，25-35％A，60-80min，29-40％A；检测波长为203nm±3nm；柱温：25-35℃。
优选的，所述流动性B为0.05％磷酸溶液；所述检测波长为203nm；所述梯度洗脱为0-35min，19％A，35-55min，19-29％A，55-60min，29％A，60-80min，29-40％A。
优选的，所述对照品溶液的制备方法为：
称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每lml含人参皂苷Rg10.4mg、人参皂苷Rb10.4mg、三七皂苷R10.lmg的混合溶液。
优选的，所述供试品溶液的制备方法为：
取消痞和胃中药制剂0.5～1.0g，精密称定，置烧瓶中，加人甲醇25ml，称定重量，放置过夜，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液制成。
优选的，所述柱温为30℃。
优选的，所述高效液相色谱的进样量为10μl。
本发明的有益效果：
本发明人经过多次研究探索，探究了适于消痞和胃中药制剂中三七有效成分含量的HPLC测定方法，该测定方法操作简单，高效且省时，具有高精密度和重现性，因此其鉴定结果客观准确。本发明的方法测定人参皂苷Rg1(C42H72O14)、人参皂苷Rb1(C54H92O23)及三七皂苷R1(C47H80O18)的总量，比现有方法只测定其中的人参皂苷Rg1(C42H72O14)和三七皂苷R1(C47H80O18)的总量更能体现三七药材有效成分含量情况。
附图说明
图1为消痞和胃中药制剂空白溶剂的色谱图。
图2为消痞和胃中药制剂阴性对照品的色谱图。
图3为消痞和胃中药制剂供试品溶液的色谱图。
图4为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品混合溶液的色谱图。
图5为三七皂苷R1对照品的色谱图。
图6为人参皂苷Rg1对照品的色谱图。
图7为人参皂苷Rb1对照品的色谱图。
图8为三七皂苷R1浓度与峰面积的线性关系图。
图9为人参皂苷Rg1浓度与峰面积的线性关系图。
图10为人参皂苷Rb1浓度与峰面积的线性关系图。
具体实施方式
以下配合图式及本发明的较佳实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段。
实施例1
(1)精密称取三七皂苷R1对照品约10mg、人参皂苷Rg1对照品约40mg、人参皂苷Rb1对照品约40mg、置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5ml置10ml的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度；
对照品来源信息见表1：
表1对照品来源信息
名称 批号 含量 来源
人参皂苷Rg<sub>1</sub> 110703-201530 91.7％ 中国食品药品检定研究院
人参皂苷Rb<sub>1</sub> 110704-201223 95.9％ 中国食品药品检定研究院
三七皂苷R<sub>1</sub> 110745-201318 94.0％ 中国食品药品检定研究院
(2)取供试品消痞和胃胶囊1.0g，精密称定，置烧瓶中，精密加人甲醇25ml，称定重量，放置过夜，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
上述供试品消痞和胃胶囊为中国发明专利公开号为CN1413712A所公开的消痞和胃胶囊。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm；柱温：30℃。理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于6000。
(3)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定；
上述实验的仪器与试剂信息见表2
表2.实验仪器与试剂
图1至图7为所测得的HPLC的色谱图，可以对照图3的供试品色谱图和其他对照品的色谱图，出峰效果良好。
(4)用外标法以峰面积计算样品三七的含量；取所述消痞和胃胶囊样品3批分别进行测定，所检测的消痞和胃胶囊中的三七的平均含量为2.23mg/粒。
实施例2
实施例2同实施例1相同，其供试品溶液为改进后的消痞和胃胶囊，该消痞和胃胶囊制备方法如下：
原料：隔山消120重量份，刺梨叶80重量份，柳枝60重量份和三七60重量份；步骤：先将上述各味中草药净选，将三七在60℃～80℃的温度下干燥后，粉碎成细粉、过筛备用；然后将隔山消、刺梨叶、柳枝加14倍量的水(8、6)煎煮二次：第一次1.5小时，第二次1小时，合并两次煎煮滤液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.20(50℃热测)的清膏；清膏中加入三七细粉，经真空干燥成干膏，粉碎成细粉，过80目筛，加微粉硅胶5-10g，装入胶囊，制成300粒，即得。
供试品溶液消痞和胃胶囊溶液制备如下：
取上述胶囊内容物，混匀，取约0.5g，置烧瓶中，精密加人甲醇25ml，称定重量，放置过夜，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例3
实施例3同实施例1相同，其供试品溶液为消痞和胃颗粒，该消痞和胃颗粒制备方法如下：
原料：隔山消120重量份，刺梨叶80重量份，柳枝60重量份，三七60重量份，步骤：先将上述各味中草药净选，将三七在60℃～80℃的温度下干燥后，粉碎成细粉、过筛备用；然后将隔山消、刺梨叶、柳枝加14倍量的水(8、6)煎煮二次：第一次1.5小时，第二次1小时，合并两次煎煮滤液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.20(50℃热测)的清膏；清膏中加入三七细粉搅拌均匀，加入麦芽糊精60-100g，乳糖40-60g，混合均匀，制粒，干燥，加硬脂酸镁1-8g，封装为250袋，即得。
供试品溶液消痞和胃颗粒溶液制备如下：
取上述消痞和胃颗粒内容物，混匀，取约0.5g，置烧瓶中，精密加人甲醇25ml，称定重量，放置过夜，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例4
实施例4同实施例1相同，其供试品溶液为消痞和胃片，该消痞和胃片制备方法如下：
原料：隔山消120重量份，刺梨叶80重量份，柳枝60重量份，三七60重量份，步骤：先将上述各味中草药净选，将三七在60℃～80℃的温度下干燥后，粉碎成细粉、过筛备用；然后将隔山消、刺梨叶、柳枝加14倍量的水(8、6)煎煮二次：第一次1.5小时，第二次1小时，合并两次煎煮滤液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.20(50℃热测)的清膏；清膏中加入三七细粉搅拌均匀，加淀粉30-60g，加微晶纤维素10-20g，混合均匀，制粒，干燥，加硬脂酸镁1-8g，混合均匀，压片，即得。
供试品溶液消痞和胃颗粒溶液制备如下：
取上述消痞和胃片，研细，混匀，取约0.5g，置烧瓶中，精密加人甲醇25ml，称定重量，放置过夜，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法学验证
(1)系统适用性
取药材隔山消、刺梨叶、柳枝，用淀粉替代三七按处方及制法制作阴性对照制剂。精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品及三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每lml含人参皂苷Rg10.4mg、人参皂苷Rb10.4mg、三七皂苷R10.lmg的混合溶液，作为对照品溶液。按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液，及样品溶液。取10μl注入色谱仪，记录色谱图，理论板数按三七皂苷R1峰计算不得低于6000，阴性对照对样品测定无干扰，相邻杂峰的分离度应符合要求，三七皂苷R1的保留时间为49.055min；人参皂苷Rg1的保留时间为52.903min；人参皂苷Rb1的保留时间为74.584min。
(2)线性试验
精密称取三七皂苷R1对照品约10mg、人参皂苷Rg1对照品约40mg、人参皂苷Rb1对照品约40mg、置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1.25ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.75ml分别置5个10ml的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度；分别取上述溶液10μl及定量限浓度样品10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积和浓度计算线性方程。结果见表3至表5及图8至图10。
表3三七皂苷R1线性关系数据
表4人参皂苷Rg1线性关系数据
表5人参皂苷Rb1线性关系数据
(3)精密度
仪器精密度：
取对照品的浓度的溶液，连续进样，进样6次，每次10μl，以峰面积计算相对标准偏差，结果见表6。
表6含量测定仪器精密度试验结果
重复性：
取本品供试品样品6份，按含量项下的方法测定样品的含量，以含量结果计算相对标准偏差，具体见表7。
表7含量测定重复性试验结果
(4)溶液稳定性：
取本品供试品样品1份，置室温条件下放置10小时，于0、2、4、6、8、10小时进样测定，结果见表8。
表8含量测定溶液稳定性试验结果
(5)准确度
精密称取本品供试品样品9份，每份约0.5g，置25ml容量瓶中，分别精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品及三七皂苷R1约6mg、6mg、1.5mg各3份置上述的3个25ml容量瓶中，按含量项下供试品溶液制备，作为80％供试品；分别精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品及三七皂苷R1约8mg、8mg、2mg各3份置上述的3个25ml容量瓶中，按含量项下供试品溶液制备，作为100％供试品；分别精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品及三七皂苷R1约10mg、10mg、2.5mg各3份置上述的3个25ml容量瓶中，按含量项下供试品溶液制备，作为120％供试品。分别取上述溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算所加入对照品的测量值，计算回收率的相对标准偏差，结果见表9和表10。
表9准确度试验结果(1)
表10准确度试验结果(2)
(6)检测限与定量限
取混合对照溶液，用甲醇分别以不同比例稀释后，按含量色谱条件进样，以信噪比约为3：1为最小检测线，信噪比约为10：1为定量限。
三七皂苷R1检测线浓度为：0.97μg/ml；定量限浓度为：1.94μg/ml，人参皂苷Rg1检测线浓度为：1.99μg/ml；定量限浓度为：3.98μg/ml；人参皂苷Rb1检测线浓度为：7.9μg/ml；定量限浓度为：15.8μg/ml。
(7)色谱条件的耐用性：
取本品供试品样品，分别微小改变柱温、流动相pH、不同的色谱柱进行含量测定。测定结果见表11至表13。由下表可知所有参数进行微小调整对结果均无影响。
不同的柱温的改变的测量结果：
表11含量测定HPLC方法的耐用性不同的柱温
不同的流动相的PH值的改变的测量结果：
表12含量测定HPLC方法的耐用性不同的流动相的PH值
不同的色谱柱的改变的测量结果：
表13含量测定HPLC方法的耐用性不同的色谱柱
结论：以上结果表明，本方法用于消痞和胃胶囊中三七含量检测灵敏，方法可靠。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种消痞和胃中药制剂中三七含量的HPLC测定方法，包括分别制备供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱法测定，其特征在于：
所述对照品：人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1；
所述色谱的条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.01-0.1％磷酸溶液为流动相B，A+B＝100％，采用梯度洗脱：0-35min，15-25％A，35-55min，19-29％A，55-60min，25-35％A，60-80min，29-40％A；检测波长为203nm±3nm；柱温：25-35℃。
2.如权利要求1所述的HPLC测定方法，其特征在于，所述流动相B为0.05％磷酸溶液；所述检测波长为203nm；所述梯度洗脱为0-35min，19％A，35-55min，19-29％A，55-60min，29％A，60-80min，29-40％A。
3.如权利要求1所述的HPLC测定方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法为：
称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每lml含人参皂苷Rg10.4mg、人参皂苷Rb10.4mg、三七皂苷R10.lmg的混合溶液。
4.如权利要求1所述的HPLC测定方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括：
取消痞和胃中药制剂0.5～1.0g，精密称定，置烧瓶中，加入甲醇25ml，称定重量，放置过夜，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液制成。
5.如权利要求1所述的HPLC测定方法，其特征在于，所述柱温为30℃。
6.如权利要求1所述的HPLC测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的进样量为10μl。
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