CN114689776A - 一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法 - Google Patents

一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法，包括以下步骤，供试品溶液的制备、对照品参照物溶液的制备、各单味饮片参照物溶液的制备、各阴性对照溶液的制备、色谱条件和测试，分别精密吸取供试品溶液、对照品参照物溶液、各单味饮片参照物溶液和各阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明具有稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握等优点。

Description

一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法。
背景技术
古代经典名方是组方合理、疗效确切、具有明显特色与优势的古代中医典籍所记载的方剂，是我国医学先贤留给后人的宝贵财富，也是我国中医药宝库的重要组成部分，至今仍广泛使用。但因其调配、携带、煎煮、汤液味苦量大等不便因素，严重影响其临床应用，不能适应现代人的生活要求。为了保持汤剂的优势，克服汤剂的种种不足，在国家科技部“重大新药创制”科技重大专项项目的大力支持下及院士、行业专家的反复探讨后，以经典名方标准汤的质量属性为评价指标，生产出与其在质量及药效基本保持一致的标准颗粒剂。
乌药汤作为国家《古代经典名方目录(第一批)》收载的品种，载于《兰室秘藏》(金·李东垣)，由乌药、木香、香附子(炒)、当归、甘草5味药组成，本方行气和血止痛，“治妇人血海疼痛”，常用于血气凝滞之痛经。方中乌药、香附二药共为君药，乌药善理胸腹寒冷逆滞之气，并通行上下，散寒止痛，香附辛苦入肝胆二经，开郁散结，疏肝络之郁气，辅以木香除胀消痞，调胃肠气机，结合乌药共奏行气止痛之效。当归既可补血又可活血，通调肝脾之气血而调经止痛，甘草益气缓急，调和诸药。文献报道，该方及其加味方在治疗原发性痛经、溃疡性结肠炎、慢性萎缩性胃炎胃节律过缓等疾病中均有良好疗效。目前乌药汤标准颗粒及其复方制剂现有的质量研究较少，缺少一种有效手段对其进行质量控制。
发明内容
为解决前述问题，本发明提供一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法，全面反映乌药汤及其复方制剂的质量水平，为生产出与传统汤剂在质量及药效基本保持一致的标准颗粒剂提供指导。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、供试品溶液的制备：取乌药汤标准汤剂粉末1g，精密称定，置锥形瓶中，加入95％乙醇25mL，超声30min，至室温后再加95％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)、对照品参照物溶液的制备：取木香烃内酯、去氢木香烃内酯和甘草苷对照品适量，精密称定，加95％乙醇制成每1mL含0.2mg木香烃内酯、每1mL含0.5mg去氢木香烃内酯和每1mL含0.2mg甘草苷的溶液；
(3)、各单味饮片参照物溶液的制备：分别取乌药标准汤剂粉末、木香标准汤剂粉末、炒香附标准汤剂粉末、当归标准汤剂粉末、甘草标准汤剂粉末各1g，精密称定，置锥形瓶中，加入95％乙醇25mL，超声30min，至室温后再加95％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，分别得到乌药参照物溶液、木香参照物溶液、炒香附参照物溶液、当归参照物溶液、甘草参照物溶液；
(4)、各阴性对照溶液的制备：取95％乙醇滤过，取续滤液，作为不含有乌药汤的空白阴性对照溶液；另分别取不含有乌药的乌药汤第一阴性对照标准汤剂、不含有木香的乌药汤第二阴性对照标准汤剂、不含有炒香附的乌药汤第三阴性对照标准汤剂、不含有当归的乌药汤第四阴性对照标准汤剂、不含有甘草的乌药汤第五阴性对照标准汤剂各1g，精密称定，置锥形瓶中，加入95％乙醇25mL，超声30min，至室温后再加95％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，分别得到不含有乌药的乌药汤第一阴性对照溶液、不含有木香的乌药汤第二阴性对照溶液、不含有炒香附的乌药汤第三阴性对照溶液、不含有当归的乌药汤第四阴性对照溶液、不含有甘草的乌药汤第五阴性对照溶液；
(5)、色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250mm，内径为4.6mm，硅胶粒径为5μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为210nm-365nm；柱温：25℃-35℃；流速：0.8-1.2mL/min；流动相：乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度脱洗；
(6)、测试：分别精密吸取供试品溶液、对照品参照物溶液、各单味饮片参照物溶液和各阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
优选的，步骤(1)中，所述乌药汤标准汤剂粉末制备方法为：取乌药20g、木香20g、炒香附80g、当归20g、甘草20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得。
优选的，步骤(3)中，所述乌药标准汤剂粉末、木香标准汤剂粉末、炒香附标准汤剂粉末、当归标准汤剂粉末和甘草标准汤剂粉末制备方法为：
乌药标准汤剂粉末制备：取乌药20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
木香标准汤剂粉末制备：取木香20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
炒香附标准汤剂粉末制备：取炒香附20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
当归标准汤剂粉末制备：取当归20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
甘草标准汤剂粉末制备：取甘草20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得。
优选的，步骤(4)中，所述不含有乌药的乌药汤第一阴性对照标准汤剂、不含有木香的乌药汤第二阴性对照标准汤剂、不含有炒香附的乌药汤第三阴性对照标准汤剂、不含有当归的乌药汤第四阴性对照标准汤剂和不含有甘草的乌药汤第五阴性对照标准汤剂制备方法为：
不含有乌药的乌药汤第一阴性对照标准汤剂的制备：取木香20g、炒香附80g、当归20g、甘草20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
不含有木香的乌药汤第二阴性对照标准汤剂的制备：取乌药20g、炒香附80g、当归20g、甘草20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
不含有炒香附的乌药汤第三阴性对照标准汤剂的制备：取乌药20g、木香20g、当归20g、甘草20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
不含有当归的乌药汤第四阴性对照标准汤剂的制备：取乌药20g、木香20g、炒香附80g、甘草20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
不含有甘草的乌药汤第五阴性对照标准汤剂的制备：取乌药20g、木香20g、炒香附80g、当归20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得。
优选的，步骤(5)中，所述色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250mm，内径为4.6mm，硅胶粒径为5μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为210nm，理论板数按木香烃内酯峰计算应不低于3000；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；流动相：乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度脱洗；梯度脱洗程序为：
0-35min，流动相A为15-50％，流动相B为85-50％；
35-50min，流动相A为50-53％，流动相B为50-47％；
50-65min，流动相A为53-57％，流动相B为475-43％；
65-80min，流动相A为57-59％，流动相B为43-41％。
优选的，所述的特征图谱中应呈现5个特征峰，分别与相应的5个参照物峰保留时间相同，其中与木香烃内酯参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间与相对保留峰面积，其相对保留时间应在规定值的±8％之内，规定值为：峰1 0.224、峰20.396、峰3 0.956、峰4为S峰1.000和峰5 1.057；各峰的相对保留面积应在规定值的±8％之内，规定值为：峰1 1.091、峰2 0.572、峰3 1.020、峰4为S峰1.000、峰5 2.206。
本技术方案的有益效果如下：
(1)本发明在建立乌药汤标准汤剂的特征图谱过程中，确认了5个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积进行了研究，保证了制剂的化学组成稳定性和使用安全性。
(2)乌药汤标准汤剂中化学成分复杂，要实现其特征峰的分离难度大，本发明在建立特征图谱的过程中，采用了梯度洗脱的方法，解决了特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题。
(3)建立乌药汤标准汤剂的特征图谱，克服了单一成分含量测定难以反映整体含量的缺陷，可以从整体上、宏观上控制乌药汤及其复方制剂的内在质量，保证了药物的疗效，使经典名方得到了更为正规的质量控制。
(4)本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。
附图说明
图1为乌药汤采用不同检测波长时的色谱图；
图2为乌药汤采用不同柱温时的色谱图；
图3为乌药汤采用不同流速时的色谱图；
图4为乌药汤标准汤剂特征图谱色谱峰指认，；
图5为第一阴性对照标准汤剂、乌药汤标准汤剂、乌药标准汤剂样品的特征图谱；
图6为第二阴性对照标准汤剂、乌药汤标准汤剂、木香标准汤剂样品的特征图谱；
图7为第三阴性对照标准汤剂、乌药汤标准汤剂、炒香附标准汤剂样品的特征图谱；
图8为第四阴性对照标准汤剂、乌药汤标准汤剂、当归标准汤剂样品的特征图谱；
图9为第五阴性对照标准汤剂、乌药汤标准汤剂、甘草标准汤剂样品的特征图谱；
图10为乌药汤精密度特征图谱，峰1：甘草苷；峰4：木香烃内酯(S峰)；峰5：去氢木香烃内酯；
图11为乌药汤对照特征图谱；峰1：甘草苷；峰4：木香烃内酯(S峰)；峰5：去氢木香烃内酯。
具体实施方式
1、仪器及材料
仪器：AgiLent高效液相色谱仪，DiamonsiL 5μm C18(2)色谱柱(250×4.6mm)，万分之一天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)，百万分之一天平(XP26，梅特勒-托利多公司)，数控超声波清洗器(KQ500D，昆山市超声仪器有限公司)，超纯水系统(MoceLL 1820A型，MoLecuLar)。
试剂：乙醇(成都市科隆化学品有限公司)、乙腈(SIGMA-ALORICH)、水为超纯水(实验室自制)。
试药：木香烃内酯对照品(批号：111524-201710，含量：99.5％，中国食品药品检定研究院)；
去氢木香烃内酯对照品(批号：111525-201711，含量：99.8％，中国食品药品检定研究院)；
甘草苷对照品(批号：111610-201908，含量：95.0％，中国食品药品检定研究院)。
乌药(批号：WY-200901)、木香(批号：MX-200901)、炒香附(批号：CXF-200901)、当归(批号：DG-200901)、甘草(批号：GC-200901)。
2、拟定高效液效检测方法
(1)、供试品溶液的制备：取乌药汤标准汤剂粉末1g，精密称定，置锥形瓶中，加入95％乙醇25mL，超声30min，至室温后再加95％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
(2)、对照品参照物溶液的制备：取木香烃内酯、去氢木香烃内酯和甘草苷对照品适量，精密称定，加95％乙醇制成每1mL含0.2mg木香烃内酯、每1mL含0.5mg去氢木香烃内酯和每1mL含0.2mg甘草苷的溶液；
(3)、各单味饮片参照物溶液的制备：分别取乌药标准汤剂粉末、木香标准汤剂粉末、炒香附标准汤剂粉末、当归标准汤剂粉末、甘草标准汤剂粉末各1g，精密称定，置锥形瓶中，加入95％乙醇25mL，超声30min，至室温后再加95％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，分别得到乌药参照物溶液、木香参照物溶液、香附参照物溶液、当归参照物溶液、甘草参照物溶液；
(4)、各阴性对照溶液的制备：取95％乙醇滤过，取续滤液，作为不含有乌药汤的空白阴性对照溶液；另分别取不含有乌药的乌药汤第一阴性对照标准汤剂、不含有木香的乌药汤第二阴性对照标准汤剂、不含有炒香附的乌药汤第三阴性对照标准汤剂、不含有当归的乌药汤第四阴性对照标准汤剂、不含有甘草的乌药汤第五阴性对照标准汤剂各1g，精密称定，置锥形瓶中，加入95％乙醇25mL，超声30min，至室温后再加95％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，分别得到不含有乌药的乌药汤第一阴性对照溶液、不含有木香的乌药汤第二阴性对照溶液、不含有炒香附的乌药汤第三阴性对照溶液、不含有当归的乌药汤第四阴性对照溶液、不含有甘草的乌药汤第五阴性对照溶液；
(5)、色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250mm，内径为4.6mm，硅胶粒径为5μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为210nm，理论板数按木香烃内酯峰计算应不低于3000；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；流动相：乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度脱洗；梯度脱洗程序为：
0-35min，流动相A为15-50％，流动相B为85-50％；
35-50min，流动相A为50-53％，流动相B为50-47％；
50-65min，流动相A为53-57％，流动相B为475-43％；
65-80min，流动相A为57-59％，流动相B为43-41％。
(6)、测试：分别精密吸取供试品溶液、对照品参照物溶液、各单味饮片参照物溶液和各阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3、色谱条件考察
3.1、波长考察
在以上拟定的实验条件基础上，对检测波长为210nm、254nm、290nm、320nm、365nm时进行考察。如图1所示。
结果表明，检测波长对测定的影响较大，检测波长在210nm时，色谱图中显示出数量更多的色谱峰信息，选取210nm为测定条件。
3.2、柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察。如图2所示。
结果表明，不同柱温对测定的影响不大，色谱图中主要色谱峰均能得到较好分离，耐用性较好，选取30℃为测定条件。
3.3、流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min时进行了考察。如图3所示。
结果表明，在三种流速条件下，色谱图中主要色谱峰均能得到较好分离，耐用性较好，选取流速1.0mL/min为测定条件。
4、色谱峰指认
供试品溶液的制备：取乌药汤标准汤剂粉末1g，精密称定，置锥形瓶中，加入95％乙醇25mL，超声30min，至室温后再加95％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
对照品参照物溶液的制备：取木香烃内酯、去氢木香烃内酯和甘草苷对照品适量，精密称定，加95％乙醇制成每1mL含0.2mg木香烃内酯、每1mL含0.5mg去氢木香烃内酯和每1mL含0.2mg甘草苷的溶液；
色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250mm，内径为4.6mm，硅胶粒径为5μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为210nm，理论板数按木香烃内酯峰计算应不低于3000；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；流动相：乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度脱洗；梯度脱洗程序为：
0-35min，流动相A为15-50％，流动相B为85-50％；
35-50min，流动相A为50-53％，流动相B为50-47％；
50-65min，流动相A为53-57％，流动相B为475-43％；
65-80min，流动相A为57-59％，流动相B为43-41％；
测试：分别精密吸取供试品溶液和对照品参照物溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
对乌药汤特征图谱峰进行定位。如图4所示。
结果表明，峰1为甘草苷，峰4为木香烃内酯，峰5为去氢木香烃内酯，以木香烃内酯为参照峰。
5、专属性考察
分别取缺每味饮片的乌药汤阴性溶液标准汤剂粉末，按照拟定供试品溶液的制备方法制备，得到缺每味饮片的阴性样品溶液。
分别取乌药、木香、炒香附、当归、甘草单味饮片标准汤剂粉末按照拟定的参照物溶液的制备方法制备，得到每味药材参照物溶液。
分别取木香烃内酯对照品、去氢木香烃内酯对照品、甘草苷对照品适量，按照拟定的对照品溶液的制备方法制备每种对照品的对照品溶液。
将供试品溶液、缺每味饮片的阴性样品溶液、每味饮片的药材参照物溶液、每种对照品的对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，按拟定的色谱条件进样分析，如图5-图9所示。
乌药汤标准汤剂特征图谱共有峰来源归属：峰1、2来自甘草，峰3来自当归，峰4、5来自木香，以木香烃内酯为参照峰。
6、精密度试验
取乌药汤标准汤剂冻干粉，依供试品溶液制备方法制备1份供试样品溶液，按拟定色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，并按国家药典会提供的中药色谱指纹相似度评价系统A版对其进行相似度评价，以6次测定的图谱生成对照图谱，如图10，并以此计算相似度，结果见表1-3。
表1精密度试验相似度结果
Figure BDA0002874387390000081
表2精密度考察-特征峰保留时间
Figure BDA0002874387390000082
表3精密度考察-特征峰峰面积
Figure BDA0002874387390000083
Figure BDA0002874387390000091
结果表明，乌药汤色谱峰的保留时间的和峰面积的RSD均小于3％，表明乌药汤液相色谱特征图谱精密度试验符合要求。
7、重复性考察
取乌药汤标准汤剂冻干粉，依供试品溶液制备方法制备6批供试样品溶液，精密吸取10μL，按拟定色谱条件进样，记录色谱峰的保留时间和峰面积。以木香烃内酯为参照，计算谱图中各峰的相对保留时间及峰面积相对比值，并计算RSD的值，以考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性，结果见表4-5。
表4重复性考察—特征峰相对保留时间比值
Figure BDA0002874387390000092
表5重复性考察—特征峰相对峰面积比值
Figure BDA0002874387390000093
结果表明，乌药汤色谱峰的保留时间的和峰面积的RSD均小于3％，表明乌药汤液相色谱特征图谱重复性试验符合要求。
8、稳定性试验
取乌药汤标准汤剂冻干粉，依供试品溶液制备方法制备供试样品溶液，精密吸取10μL，按拟定色谱条件，分别于0、3、6、9、12、24h进样，记录色谱峰的保留时间和峰面积。以木香烃内酯为参照，计算谱图中各峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD的值，以考察色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的一致性，结果见表6-8。
表6稳定性试验相似度结果
Figure BDA0002874387390000101
表7稳定性考察-特征峰相对保留时间
Figure BDA0002874387390000102
表8稳定性考察-特征峰相对峰面积
Figure BDA0002874387390000103
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD均小于3％，相对峰面积的RSD为表明乌药汤液相色谱特征图谱24h内稳定性性试验符合要求。
9、特征图谱建立
最终规定：供试品特征图谱中应呈现5个特征峰，应分别与相应的5个参照物峰保留时间相同，与木香烃内酯参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间与相对保留峰面积，各峰的相对保留时间应在规定值的±8％之内，规定值为：峰1 0.224、峰20.396、峰3 0.956、峰4为S峰1.000和峰5 1.057；各峰的相对保留面积应在规定值的±8％之内，规定值为：峰1 1.091、峰2 0.572、峰3 1.020、峰4为S峰1.000、峰5 2.206。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对乌药汤标准汤剂特征图谱进行合成，建立了乌药汤标准汤剂特征图谱的对照特征图谱，如图11所示。
综上，本发明首次建立了经典名方乌药汤标准汤剂的特征图谱，该特征图谱可充分展示乌药汤的化学成分特征，全面地反映化乌药汤的质量信息，从而能够达到全面、有效地控制经典名方乌药汤标准颗粒质量的目的。同时，本发明中的特征图谱构建方法重现性良好，准确可靠，稳定性好。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、供试品溶液的制备：取乌药汤标准汤剂粉末1g，精密称定，置锥形瓶中，加入95%乙醇25mL，超声30min，至室温后再加95%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
（2）、对照品参照物溶液的制备：取木香烃内酯、去氢木香烃内酯和甘草苷对照品适量，精密称定，加95%乙醇制成每1mL含0.2mg木香烃内酯、每1mL含0.5mg去氢木香烃内酯和每1mL含0.2mg甘草苷的溶液；
（3）、各单味饮片参照物溶液的制备：分别取乌药标准汤剂粉末、木香标准汤剂粉末、炒香附标准汤剂粉末、当归标准汤剂粉末、甘草标准汤剂粉末各1g，精密称定，置锥形瓶中，加入95%乙醇25mL，超声30min，至室温后再加95%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，分别得到乌药参照物溶液、木香参照物溶液、炒香附参照物溶液、当归参照物溶液、甘草参照物溶液；
（4）、各阴性对照溶液的制备：取95%乙醇滤过，取续滤液，作为不含有乌药汤的空白阴性对照溶液；另分别取不含有乌药的乌药汤第一阴性对照标准汤剂、不含有木香的乌药汤第二阴性对照标准汤剂、不含有炒香附的乌药汤第三阴性对照标准汤剂、不含有当归的乌药汤第四阴性对照标准汤剂、不含有甘草的乌药汤第五阴性对照标准汤剂各1g，精密称定，置锥形瓶中，加入95%乙醇25mL，超声30min，至室温后再加95%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，分别得到不含有乌药的乌药汤第一阴性对照溶液、不含有木香的乌药汤第二阴性对照溶液、不含有炒香附的乌药汤第三阴性对照溶液、不含有当归的乌药汤第四阴性对照溶液、不含有甘草的乌药汤第五阴性对照溶液；
（5）、色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm， 内径为4.6mm，硅胶粒径为5 μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为210nm-365nm；柱温：25℃-35℃；流速：0.8-1.2mL/min；流动相：乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度脱洗；
（6）、测试：分别精密吸取供试品溶液、对照品参照物溶液、各单味饮片参照物溶液和各阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.根据权利要求1所述的一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，所述乌药汤标准汤剂粉末制备方法为：取乌药20g、木香20g、炒香附80g、当归20g、甘草20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得。
3.根据权利要求1所述的一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法，其特征在于：步骤（3）中，所述乌药标准汤剂粉末、木香标准汤剂粉末、炒香附标准汤剂粉末、当归标准汤剂粉末和甘草标准汤剂粉末制备方法为：
乌药标准汤剂粉末制备：取乌药20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
木香标准汤剂粉末制备：取木香20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
炒香附标准汤剂粉末制备：取炒香附20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
当归标准汤剂粉末制备：取当归20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
甘草标准汤剂粉末制备：取甘草20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得。
4.根据权利要求1所述的一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法，其特征在于：步骤（4）中，所述不含有乌药的乌药汤第一阴性对照标准汤剂、不含有木香的乌药汤第二阴性对照标准汤剂、不含有炒香附的乌药汤第三阴性对照标准汤剂、不含有当归的乌药汤第四阴性对照标准汤剂和不含有甘草的乌药汤第五阴性对照标准汤剂制备方法为：
不含有乌药的乌药汤第一阴性对照标准汤剂的制备：取木香20g、炒香附80g、当归20g、甘草20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
不含有木香的乌药汤第二阴性对照标准汤剂的制备：取乌药20g、炒香附80g、当归20g、甘草20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
不含有炒香附的乌药汤第三阴性对照标准汤剂的制备：取乌药20g、木香20g、当归20g、甘草20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
不含有当归的乌药汤第四阴性对照标准汤剂的制备：取乌药20g、木香20g、炒香附80g、甘草20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得；
不含有甘草的乌药汤第五阴性对照标准汤剂的制备：取乌药20g、木香20g、炒香附80g、当归20g，混合粉碎过2号筛得粗粉，取粗粉20g的加入400mL水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤，再加水400mL，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，合并滤液，冷冻干燥，即得。
5.根据权利要求1所述的一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法，其特征在于：步骤（5）中，所述色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm， 内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为210nm，理论板数按木香烃内酯峰计算应不低于3000；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；流动相：乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度脱洗；梯度脱洗程序为：
0-35min，流动相A为15-50%，流动相B为85-50%；
35-50min，流动相A为50-53%，流动相B为50-47%；
50-65min，流动相A为53-57%，流动相B为475-43%；
65-80min，流动相A为57-59%，流动相B为43-41%。
6.根据权利要求1所述的一种乌药汤高效液相特征图谱的构建方法，其特征在于：所述的特征图谱中应呈现5个特征峰，应分别与相应的5个参照物峰保留时间相同，其中与木香烃内酯参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间与相对保留峰面积，其相对保留时间应在规定值的±8％之内，各峰规定值为：峰1 0.224、峰2 0.396、峰3 0.956、峰4为S峰 1.000和峰5 1.057；各峰的相对保留面积应在规定值的±8％之内，规定值为：峰1 1.091、峰2 0.572、峰3 1.020、峰4为S峰 1.000、峰5 2.206。
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