CN106053625A - 一种用hplc法测定盐酸去甲乌药碱有关物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种HPLC法测定盐酸去甲乌药碱有关物质的方法，属于药物分析技术领域。具体的，本发明所述的测定方法，包括以下步骤：(1)测试溶液的制备；(2)对照品溶液的制备；(3)系统适用性对照品的制备；(4)测定方法：分别将对照溶液，测试溶液，系统适用性对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱条件如下：色谱柱：CAPCELL PAK C18 MG(S‑5)，检测波长：280‑290nm，进样量：10‑30μl，柱温：25‑35℃，流速：0.9‑1.1ml/min，流动相：乙酸铵溶液‑乙腈，进行梯度洗脱。

Description

一种用HPLC法测定盐酸去甲乌药碱有关物质的方法
技术领域
本发明涉及一种HPLC法测定盐酸去甲乌药碱有关物质的方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
盐酸去甲乌药碱(Higenamine hydrochloride)，适用于。其化学名称为1-(4-羟基苄基)-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐，分子式为C16H17NO3·HCl，化学结构如下：
目前，盐酸去甲乌药碱是以3,4-二甲氧基苯乙胺和4-甲氧基苯乙酸作为起始原料，分别经酰化反应、环合反应、还原反应、脱甲氧基反应，再精制后得盐酸去甲乌药碱。在此过程中生成如下3个中间体和2个终端产品中的副产物杂质。其中，杂质A是中间体II经硼氢化钠还原成中间体III时反应不完全，未还原的中间体II在其后与氢溴酸反应脱去甲基而产生去甲基中间体II。杂质B是中间体III进行脱甲基的副产品，经与文献资料比对认为该副产物杂质B为乌药碱，其药理活性显著低于去甲乌药碱，在正常工艺条件下制备盐酸去甲乌药碱样品中含量很低，不会产生显著毒副作用。
在药物制备和贮存过程中，对合成方法可能产生的杂质进行监测，对于终产品的质量生成过程及药品的质量控制非常重要。
本发明首次公开了一种盐酸去甲乌药碱有关物质的测定方法，采用C18色谱柱快速准确地测定盐酸去甲乌药碱及其中间体的杂质，从而实现盐酸去甲乌药碱及其中间体杂质的控制，保证了盐酸去甲乌药碱及其制剂的质量可控。
发明内容
本发明的目的是提供一种用HPLC法测定盐酸去甲乌药碱有关物质的方法，使其在系统适用性、专属性、重复性、线性、定量限、检测限等方面完全符合标准并具有较高的精密度，可用于盐酸去甲乌药碱合成过程和终产品及其制剂的质量控制。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种盐酸去甲乌药碱有关物质检测方法，包括以下步骤：
取盐酸去甲乌药碱待测品配制测试溶液，将测试溶液稀释1000倍作为对照溶液，然后以乙酸铵水溶液为流动相A、以乙腈为流动相B分别进行HPLC检测，以主成分自身对照法测定有关物质的含量。
具体的，本发明所述的测定方法，包括以下步骤：
(1)测试溶液的制备；
(2)对照品溶液的制备；
(3)系统适用性对照品的制备；
(4)测定方法：分别将对照溶液，测试溶液，系统适用性对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，
色谱条件如下：
色谱柱：CAPCELL PAK C18MG(S-5)，检测波长：280-290nm，进样量：10-30μl，柱温：25-35℃，流速：0.9-1.1ml/min，流动相：乙酸铵溶液-乙腈，进行梯度洗脱。
其中，乙酸铵溶液的浓度为0.04mol/L～0.06mol/L，更优选0.05mol/L。
其中，色谱条件中，乙酸铵溶液的pH值为3.0～4.0，更优选为3.5。
其中，色谱条件中，调节乙酸铵水溶液pH值的溶剂为冰乙酸，在乙酸铵溶液中所含体积比例范围为0.1％～1.0％。
其中，所述检测波长优选284nm。
其中，所述HPLC检测的检测的流速优选0.9-1.1ml/min，更优选为1.0ml/min。
其中，所述HPLC检测的进样量优选20μl。
其中，所述HPLC检测的柱温优选25-35℃，更优选30℃。
其中，梯度洗脱过程如下：
。
其中，(1)测试溶液的制备；取盐酸去甲乌药碱约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为测试溶液，其中所述流动相A-为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈。
优选的，(1)测试溶液的制备；取盐酸去甲乌药碱约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B＝93:7的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为测试溶液，其中所述流动相A-为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈。
其中，(2)对照品溶液的制备；精密量取1.0ml测试溶液，置100ml量瓶中，用流动相A-流动相B的混合溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用流动相A-流动相B的混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，其中所述流动相A-为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈。
优选的，(2)对照品溶液的制备；精密量取1.0ml测试溶液，置100ml量瓶中，用流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5μg的溶液，作为对照品溶液，其中所述流动相A-为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈。
其中，(3)系统适用性对照品的制备；取盐酸去甲乌药碱系统适用性对照品(含杂质A、杂质B)约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性对照品溶液，其中所述流动相A-为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈。
优选的，(3)系统适用性对照品的制备；取盐酸去甲乌药碱系统适用性对照品(含杂质A、杂质B)约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为系统适用性对照品溶液，其中所述流动相A-为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈。
其中，所述杂质A、杂质B的结构式如下：
进一步优选的，本发明所述色谱条件如下：
色谱柱：CAPCELL PAK C18MG(S-5)，型号为4.6mm×250mm，5μm，检测波长：284nm，进样量：20μl，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，流动相：0.05mol/L乙酸铵溶液-乙腈，其中乙酸铵溶液用冰乙酸调节pH至3.5，梯度洗脱过程如下：
。
更优选的，本发明所述的测定方法，包括以下步骤：
(1)测试溶液的制备；取盐酸去甲乌药碱约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B＝93:7的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为测试溶液，其中所述流动相A-为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈；
(2)对照品溶液的制备；精密量取1.0ml测试溶液，置100ml量瓶中，用流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5μg的溶液，作为对照品溶液；
(3)系统适用性对照品的制备；取盐酸去甲乌药碱系统适用性对照品(含杂质A、杂质B)约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为系统适用性对照品溶液；
(4)测定方法：分别将对照溶液，测试溶液，系统适用性对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，根据色谱图计算有关物质的含量；
色谱条件如下：
色谱柱：CAPCELL PAK C18MG(S-5)，型号为4.6mm×250mm，5μm，检测波长：284nm，进样量：20μl，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，流动相：0.05mol/L乙酸铵溶液-乙腈，其中乙酸铵溶液用冰乙酸调节pH至3.5，梯度洗脱过程如下：
。
本发明所述HPLC检测的色谱柱优选CAPCELL PAK C18MG(S-5)(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，它采用高纯度的十八烷基硅烷键合硅胶作为基质，并且减少了此硅胶的微细孔增大了有效比表面积使得分离效果更好。而且，该色谱柱采用了资生堂公司独自开发的新的包被技术Ultimate Polymer Coating，实现了世界最高水平的硅醇基封尾。由此，一直以来在中性条件下使用硅胶系ODS柱对困难的碱性化合物的分析第一次成为可能。
所述HPLC检测方法作为优选还包括在检测之前进行系统适用性检测步骤：
按照正式检测的色谱条件，分别进空白溶液、系统适用性对照品溶液、测试溶液，记录色谱图，出峰顺序依次为盐酸去甲乌药碱(保留时间约12分钟)，杂质A(相对保留时间约1.2)，杂质B(相对保留时间约1.5)，盐酸去甲乌药碱峰和杂质A峰之间的分离度应不低于2.0，理论板数按盐酸去甲乌药碱峰计算不低于5000。
在系统适用性试验中，针对照溶液以主成分峰面积计RSD为0.683％，不超过标准要求的2.0％；测试溶液中盐酸去甲乌药碱主成分的理论板数为8487，大于标准要求的5000。表明本发明所述检测方法的分析系统符合要求，可以稳定的测量主成分盐酸去甲乌药碱及有关物质。
在专属性的试验中，空白溶剂对检测无干扰，系统适用性对照品溶液中盐酸去甲乌药碱与杂质A的分离度4.74，大于标准要求的2.0，主峰纯度999.989，大于标准要求的990，且符合验证要求。表明本发明所述的检测方法可以完好的分离出各有关物质峰和盐酸去甲乌药碱主成分峰，各峰之间无干扰，利于检测。
在精密度试验中，通过6份测试溶液测定结果的最大偏差来考察检测方法的重复性；通过不同日、不同人、不同仪器重复重复性试验，计算12次测定结果之间的最大偏差来考察检测方法的中间精密度。在重复性试验中，6次测定结果中：杂质A最大偏差为0，小于标准要求的0.05％；杂质B最大偏差为0.01％，小于标准要求的0.05％；其他最大杂质最大偏差为0.01％，小于标准要求的0.05％；大于0.05％的杂质峰的个数一致；总杂质最大偏差为0.02％，小于标准要求的0.10％。符合验证要求。中间精密度试验中，已知杂质A最大偏差为0，小于标准要求的0.05％；杂质B最大偏差为0.01％，小于标准要求的0.05％；其他最大杂质最大偏差为0.01％，小于标准要求的0.05％；大于0.05％的杂质峰的个数一致，总杂质最大偏差为0.03％，小于标准要求的0.10％(限度≤1.0％)。符合验证要求。由重复性试验和中间精密度试验结果可证实本发明所述的检测方法具有良好的精密度。
在定量限试验中，相当于样品浓度0.02％的LOQ测试溶液信噪比约为10，保证样品中0.02％以上的有关物质可以定量检测；在检测限的试验中，相当于样品浓度0.006％的LOD测试溶液信噪比约为3，保证样品中0.006％以上的有关物质能够被检测到，证明本发明的灵敏度很高，可以满足盐酸去甲乌药碱有关物质检测灵敏度的要求。
在准确度的试验中，LOQ浓度下回收率：72.31％-92.27％(在50％-150％范围内)，回收率RSD为12.778％；其他浓度下回收率：98.91％-108.64％(在80.0％-180.0％范围内)，回收率最大RSD为3.7966％。符合验证要求，证明本发明的准确度很高。
在线性和范围的试验中，本发明所述的检测方法在LOQ-1.2％的范围内呈线性，且相关系数R2为0.99996，大于标准要求的R2为0.990，证明本发明所述的检测方法呈良好的线性关系。
由以上技术方案可知，本发明所述的检测方法对盐酸去甲乌药碱和其他有关物质的色谱峰分离度高、具有较好的系统适用性，同时在专属性、精密度、定量限、检测限、准确度、线性都符合标准。
本发明中，术语“盐酸去甲乌药碱”在没有明确区分的情况下，可以是盐酸去甲乌药碱的纯品、原料药、合成品等以下以盐酸去甲乌药碱作为主成分的产品。本发明的测定方法均适用于上述产品的质量控制，并且这些产品的有关物质测定方法也在保护本发明的保护范围内。
本发明中，术语“有关物质”是指在药物制备和贮存过程中，对合成方法可能产生的杂质(包括中间体、副产物等有机杂质)。
本发明所用原料都可以在市场上购买到，属于现有产品。
本发明中，盐酸去甲乌药碱系统适用性对照品(含杂质A、杂质B)：我公司对盐酸去甲乌药碱粗品(通过减少还原剂硼氢化钠用量及缩短脱甲基时间制得两个副产物含量较高样品)进行制备色谱分离，将分离出的两个副产物杂质A、杂质B进行了结构鉴定,并将杂质A、杂质B定量加入至盐酸去甲乌药碱标准品中，作为自制的二级标准品。含C16H17NO3.HCl应不低于99.0％，杂质A和杂质B均不低于0.2％。
本发明利用方便快捷的高效液相色谱法，对盐酸去甲乌药碱及其中间体杂质、副产物、起始物料的检测，可用于监测盐酸去甲乌药碱合成反应工艺、终产品或原料及制剂的质量。本发明的测定方法相对于现有方法而言，具有准确度高、精密度好、重现性好、稳定性好、专属性强等特点，同时本发明的测定方法操作简单，所用时间比较短，大大降低成本，节省时间。
附图说明
图1为盐酸去甲乌药碱有关物质检测空白溶液的液相色谱图；
图2为盐酸去甲乌药碱有关物质检测系统适用性对照溶液的液相色谱图；
图3为盐酸去甲乌药碱有关物质检测对照溶液的液相色谱图；
图4为盐酸去甲乌药碱有关物质检测测试溶液的液相色谱图。
具体实施方式
下面用具体实施例来进一步解释和说明本发明，但并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
实验材料与仪器条件
仪器：美国戴安U3000，VWD检测器及变色龙工作站，色谱柱：CAPCELL PAK C18MG(S-5)(4.6mm×250mm，5μm)，检测波长：284nm，进样量：20μl，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，流动相(水相-有机相)：0.05mol/L乙酸铵溶液(用冰乙酸调节pH至3.5)-乙腈梯度洗脱，其梯度比如表1。
表1
实验步骤
取本品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为测试溶液；精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，用流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5μg的溶液，作为对照溶液。另取盐酸去甲乌药碱系统适用性对照品(含杂质A、杂质B)约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为系统适用性对照品溶液。
分别取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10％。再取系统适用性对照品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。要求杂质A和盐酸去甲乌药碱之间的分离度应不低于2.0；理论板数按盐酸去甲乌药碱计算不低于5000。再精密量取测试溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
图2中，盐酸去甲乌药碱保留时间约12分钟，杂质A相对保留时间约1.2，杂质B相对保留时间约1.5。结果表明盐酸去甲乌药碱及其副产物杂质A、杂质B的色谱峰分离度良好，该检测方法可用于盐酸去甲乌药碱合成反应终产品的监控及其质量控制。
实施例2：本发明所述检测方法系统适用性检测
稀释溶液：流动相A(0.05mol/L乙酸铵溶液，用冰乙酸调节pH至3.5)-流动相B乙腈(93:7)(V/V)；
空白溶液：稀释溶液；
测试溶液：取盐酸去甲乌药碱标准品约25.0mg，置50ml量瓶中，用稀释溶液溶解后稀释定容，摇匀即得。
对照溶液：精密量取测试溶液1.0ml，置100ml量瓶中，用稀释溶液稀释定容，摇匀，即得。
按照实施例1色谱条件分别进样空白溶液、5针对照溶液、测试溶液，记录色谱图，见图3和图4，相应结果见表2。
表2系统适用性结果
根据图3、图4和表3的结果可知，所述检测方法系统稳定，符合系统适用性要求，且峰形较好，有利于有关物质的检测，适用于产品质量的控制。
实施例3：本发明所述检测方法专属性检测
所述检测方法的专属性是考察峰鉴别和选择性，评估方法对盐酸去甲乌药碱及其有关物质的专属性。同时采用DAD检测器，进行峰纯度检查，判断该色谱峰不包含其他杂质峰，色谱峰的纯度符合要求，具体试验结果见表3，对应色谱图见图1和图2。
表3专属性试验结果
根据图1、图2和表3可知，空白溶液无干扰，系统适应性对照溶液中盐酸去甲乌药碱和杂质A、杂质B之间最小分离度为4.74，大于标准要求的2.0，且盐酸去甲乌药碱的峰纯度为999.971，大于标准要求的990。这表明本发明所述的检测方法可以完美的分离出各个色谱峰，且主峰纯度高不存在杂质峰重合在主峰中的情况。
实施例4：本发明所述检测方法精密度检测
本发明所述的精密度试验通过6份测试溶液测定结果的最大偏差来考察检测方法的重复性；通过不同日、不同人、不同仪器重复重复性试验，计算12次测定结果之间的最大偏差来考察检测方法的中间精密度。重复性试验的结果见表4，中间精密度试验的结果见表5。
表4重复性试验结果
序号 杂质A％ 杂质B％ 其他最大杂质％ ≥0.05％杂质个数％ 总杂质％
重复性1 0 0.05 0.02 1 0.08
重复性2 0 0.06 0.02 1 0.07
重复性3 0 0.06 0.02 1 0.09
重复性4 0 0.05 0.02 1 0.07
重复性5 0 0.05 0.02 1 0.08
重复性6 0 0.06 0.01 1 0.07
最大偏差 0 0.01 0.01 0 0.02
表5中间精密度试验结果
序号 杂质A％ 杂质B％ 其他最大杂质％ ≥0.05％杂质个数％ 总杂质％
重复性1 0 0.05 0.02％ 1 0.08
重复性2 0 0.06 0.02％ 1 0.07
重复性3 0 0.06 0.02％ 1 0.09
重复性4 0 0.05 0.02％ 1 0.07
重复性5 0 0.05 0.02％ 1 0.08
重复性6 0 0.06 0.01％ 1 0.07
重复性7 0 0.05 0.01％ 1 0.06
重复性8 0 0.06 0.01％ 1 0.07
重复性9 0 0.05 0.01％ 1 0.06
重复性10 0 0.06 0.01％ 1 0.07
重复性11 0 0.06 0.01％ 1 0.07
重复性12 0 0.06 0.01％ 1 0.07
最大偏差 0 0.01 0.01 0 0.03
由表4可知，重复性试验6次测试有关物质中杂质A均未检出，杂质B的最大偏差为0.01％，其他单个杂质的最大偏差为0.01％，均小于限度的20％(0.05％)，总杂质的最大偏差为0.02％，小于限度的10％(0.10％)，证明该方法重复性好。由表5可知，中间精密度试验考察的12针测试溶液，杂质A均未检出，杂质B的最大偏差为0.01％，其他单个杂质的最大偏差为0.01％，均小于限度的20％(0.05％)，总杂质的最大偏差为0.03％，小于限度的10％(0.10％)，证明该检测方法的中间精密度试验符合要求。综合表4和表5的试验结果可证明本发明所述方法的精密度良好。
实施例5、本发明所述检测方法定量限和检测限检测
有关物质的定量限和检测限分别是可以定量检测的限度和能被测出的最低限度。对于有关物质，定量限(LOQ)和检出限(LOD)的根据信噪比法来确定。将实施案例2中的对照溶液按比例稀释至测出的信噪比信号≈10时则为定量限浓度，然后配制5份定量限浓度的溶液进样考察该方法在定量限浓度的精密度。继续按比例稀释定量限浓度溶液至信噪比信号≈3则为检测限浓度，结果见表6。
表6定量限和检测限结果
由表6可知，相当于样品浓度的0.02％的有关物质信噪比在10左右，表明样品中0.02％以上的有关物质可以定量检测；相当于样品浓度0.006％的有关物质信噪比在3左右，表明样品中0.006％以上的有关物质可以被检测到，证明本发明所述的检测方法灵敏度很高。
实施例6：本发明所述检测方法准确度检测
本发明所述检测方法的准备度测试，是回收率来考察，在定量限～总杂质的限度(1.0％)的浓度范围，分别选择定量限浓度，已知杂质和最大单杂的限度(0.1％)，总杂质的限度(1.0％)的80％、100％、120％，这5个浓度考察回收率，具体结果见表7。
表7准确度检测结果
由表7可知，LOQ浓度下回收率：72.31％-92.27％(在50％-150％范围内)，回收率RSD为12.778％；其他浓度下回收率：98.91％-108.64％(在80.0％-180.0％范围内)，回收率最大RSD为3.7966％，符合验证要求，证明本发明所述的检测方法测定的结果准确，与真实值接近。
实施例7：本发明所述检测方法线性的检测
本发明所述的检测方法的线性的检测，在相当于样品浓度的0.02％至1.2％的范围内取5个浓度点进行研究。线性关系以峰面积对被测物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，要求该线性相关系数R2应不小于0.990，测定结果见表8。
表8线性的检测结果
由表8可知，发明所述的检测方法针对有关物质的线性范围符合至少在LOQ值～总杂限度120％的范围内的线性要求，且相关归系数R2在0.990以上，证明呈良好的线性。
以上实施例仅为本发明的优选实施方案，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用HPLC法测定盐酸去甲乌药碱中有关物质的方法，包括以下步骤：
(1)测试溶液的制备；
(2)对照品溶液的制备；
(3)系统适用性对照品的制备；
(4)测定方法：分别将对照溶液，测试溶液，系统适用性对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，
色谱条件如下：
色谱柱：CAPCELL PAK C18MG(S-5)，检测波长：280-290nm，进样量：10-30μl，柱温：25-35℃，流速：0.9-1.1ml/min，流动相：乙酸铵溶液-乙腈，进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱条件中，乙酸铵溶液的浓度为0.04mol/L～0.06mol/L，更优选0.05mol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱条件中，乙酸铵溶液的pH值为3.0～4.0，更优选为3.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱条件中，调节乙酸铵水溶液pH值的溶剂为冰乙酸，在乙酸铵溶液中所含体积比例范围为0.1％～1.0％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，梯度洗脱过程如下：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱条件如下：
色谱柱：CAPCELL PAK C18MG(S-5)，型号为4.6mm×250mm，5μm，检测波长：284nm，进样量：20μl，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，流动相：0.05mol/L乙酸铵溶液-乙腈，其中乙酸铵溶液用冰乙酸调节pH至3.5，梯度洗脱过程如下：
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)测试溶液的制备；取盐酸去甲乌药碱约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为测试溶液，其中所述流动相A-为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)对照品溶液的制备；精密量取1.0ml测试溶液，置100ml量瓶中，用流动相A-流动相B的混合溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用流动相A-流动相B的混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，其中所述流动相A-为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)系统适用性对照品的制备；取盐酸去甲乌药碱系统适用性对照品(含杂质A、杂质B)约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性对照品溶液，其中所述流动相A-为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，
盐酸去甲乌药碱系统适用性对照品的制备：将杂质A、杂质B加入至盐酸去甲乌药碱标准品中。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)测试溶液的制备；取盐酸去甲乌药碱约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B＝93:7的混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为测试溶液，其中所述流动相A-为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈；
(2)对照品溶液的制备；精密量取1.0ml测试溶液，置100ml量瓶中，用流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液稀释至刻度，摇匀，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5μg的溶液，作为对照品溶液；
(3)系统适用性对照品的制备；取盐酸去甲乌药碱系统适用性对照品(含杂质A、杂质B)约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A-流动相B(93:7)的混合溶液溶解并稀释 至刻度，摇匀，制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为系统适用性对照品溶液；
(4)测定方法：分别将对照溶液，测试溶液，系统适用性对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，根据色谱图计算有关物质的含量；
色谱条件如下：
色谱柱：CAPCELL PAK C18MG(S-5)，型号为4.6mm×250mm，5μm，检测波长：284nm，进样量：20μl，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，流动相：0.05mol/L乙酸铵溶液-乙腈，其中乙酸铵溶液用冰乙酸调节pH至3.5，梯度洗脱过程如下：
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