CN105424822B - 检测替格瑞洛中(1r,2s)‑2‑(3,4‑二氟苯基)环丙胺的方法 - Google Patents

检测替格瑞洛中(1r,2s)‑2‑(3,4‑二氟苯基)环丙胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测替格瑞洛中(1R,2S)‑2‑(3,4‑二氟苯基)环丙胺的方法，包括以下步骤：a、取(1R,2S)‑2‑(3,4‑二氟苯基)环丙胺(R)‑扁桃酸，制备对照品溶液，用高效液相色谱方法进行检测，得到标准曲线；b、取待检的替格瑞洛样品，制备供试品溶液，用高效液相色谱方法进行检测；c、计算替格瑞洛样品中的(1R,2S)‑2‑(3,4‑二氟苯基)环丙胺含量。本发明高效液相色谱方法，(1R,2S)‑2‑(3,4‑二氟苯基)环丙胺与其他杂质之间的分离度高，其他杂质不干扰(1R,2S)‑2‑(3,4‑二氟苯基)环丙胺的检测。

Description

检测替格瑞洛中(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的方法
技术领域
本发明属于化学分析、检测领域，具体涉及检测替格瑞洛中(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的方法。
背景技术
替格瑞洛(Ticagrelor商品名：BRILINTA)，化学名为(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-丙硫基-3H-1,2,3-三唑基[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)-1,2-环戊烷二醇(分子式：C23H28F2N6O4S)，是由阿斯利康制药有限公司(AstraZeneca AB)开发的一种选择性的二磷酸腺苷(ADP)受体拮抗剂，通过激活P2Y12-受体，可逆性的阻滞ADP介导的血小板活化和聚集。
FDA于2011年7月20日批准替格瑞洛片上市，用于急性冠脉综合征(不稳定性心绞痛、非ST段抬高心肌梗死或ST段抬高心肌梗死)患者，包括接受药物治疗和经皮冠状动脉介入(PCI)治疗的患者，降低血栓性心血管事件的发生率。替格瑞洛片的抗血小板作用具有可逆性，直接作用于ADP受体，不经肝代谢，不受体内代谢影响，起效时间为30分钟。抢救ACS患者有着突出的优势，具有非血小板介导的作用，能够提高血液腺苷浓度，改善心肌血供，降低心梗面积，同时，较氯吡格雷抗血小板作用更强、更持久，维持期血小板抑制作用更强，适合急性冠状动脉综合征患者长期使用。因此，替格瑞洛与氯吡格雷同为血小板抑制剂，临床试验表明安全性和有效性都更优，具有替代氯吡格雷的潜力，所以市场潜力巨大，应用前景广阔。
目前,替格瑞洛主要通过以下路线合成：
其中，TG-2所示的化合物为(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(分子式：C9H9F2N)，是合成替格瑞洛的起始原料。由于受到工艺技术和控制水平的限制，生产得到的替格瑞洛产品中，很容易就存在有未反应的(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺，作为杂质存在。
(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺具有致癌性示警结构，根据ICH Q3A(R2)、M7以及文献1(文献1：Romualdo Benigni,Cecilia Bossa,Olga Tcheremenskaia.Developmentof structural alerts for the in vivo micronucleus assay in rodents[J].JRCScientific and Technical Reports,24.)，文献2(文献2：替格瑞洛片(JXHL1000319、320)国际多中心临床试验申请药学审评报告.)中明确提到该物质为基因毒性杂质，需要将替格瑞洛中的(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的含量控制在8ppm以内，保证每日总摄入量不超过1.5μg；因而，十分有必要对替格瑞洛中(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺含量进行监控。
现有技术中，也未见有检测替格瑞洛中(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺含量的相关报道。因此，为了更好地监控替格瑞洛药物的产品质量，进一步保证患者的用药安全，需要建立一种检测替格瑞洛药物中(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测替格瑞洛中(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的方法。
本发明提供的一种检测替格瑞洛中(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的方法，包括以下步骤：
a、取(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸，制备对照品溶液，用高效液相色谱方法进行检测，得到标准曲线；
b、取待检的替格瑞洛样品，制备供试品溶液，用高效液相色谱方法进行检测；
c、计算替格瑞洛样品中的(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺含量；
步骤a和b所用高效液相色谱方法的色谱条件为：
C18色谱柱；流动相A为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈；
梯度洗脱条件如下：
检测波长为200nm～242nm。
进一步的，步骤a中，制备对照品溶液的溶剂为乙腈-水；步骤b中，制备供试品溶液的溶剂为乙腈-水。
进一步的，所述的乙腈-水中，乙腈与水的体积比为35:65。
进一步的，步骤a中，所述标准曲线是对照品色谱峰的峰面积与对照品浓度之间的线性关系方程。
进一步的，所述的色谱条件中，C18色谱柱为Waters Xselect CSH C18柱，长度为150mm，内径为4.6mm，填料的粒径为3.5μm。
进一步的，所述的色谱条件中，柱温为30℃～40℃。
进一步的，所述的色谱条件中，流动相A的pH值为3.0～4.0；最好是，流动相A的pH值为3.5。
进一步的，所述的色谱条件中，流速为0.8ml/min～1.1ml/min。
进一步的，所述的色谱条件中，进样体积为10μl～50μl；最好是，进样体积为20μl。
进一步的，所述的色谱条件中，检测波长为210nm。
本发明提供了一种检测替格瑞洛中(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的高效液相色谱方法，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺与其他杂质之间的分离度高，其他杂质不干扰(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的检测；同时，本发明方法具有良好的专属性、线性关系、精密度、灵敏度和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为监控替格瑞洛药物中的(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺含量提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了替格瑞洛药物的用药安全。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明检测条件下限度浓度的(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液的HPLC图。
图2为本发明检测条件下扁桃酸对照品溶液的HPLC图。
图3为本发明检测条件下杂质Ⅳ、杂质Ⅴ混合杂质对照品溶液的HPLC图。
图4为本发明检测条件下(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸和杂质Ⅳ、杂质Ⅴ混合溶液的HPLC图。
图5为本发明检测条件下供试品溶液的HPLC图。
图6为对比试验1色谱条件下(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液的HPLC图。
图7为对比试验1色谱条件下扁桃酸对照品溶液的HPLC图。
图8为对比试验1色谱条件下杂质Ⅳ对照品溶液的HPLC图。
图9为对比试验1色谱条件下混合杂质溶液1的HPLC图
图10为对比试验1色谱条件下混合杂质溶液2的HPLC图
图11为对比试验2色谱条件下(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液的HPLC图。
图12为对比试验2色谱条件下杂质Ⅳ对照品溶液的HPLC图。
图13为对比试验2色谱条件下杂质Ⅴ对照品溶液的HPLC图。
图14为对比试验2色谱条件下杂质Ⅵ对照品溶液的HPLC图。
图15为对比试验2色谱条件下混合杂质溶液的HPLC图。
图16为对比试验2色谱条件下供试品溶液的HPLC图。
图17为对比试验2色谱条件下(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品定量限溶液的HPLC图。
图18为对比试验3色谱条件下混合杂质对照溶液的242nm波长下的HPLC图。
图19为对比试验3色谱条件下混合杂质对照溶液的210nm波长下的HPLC图。
图20为试验例1第1项下替格瑞洛的紫外光谱图。
图21为试验例1第1项下(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸的紫外光谱图。
图22为试验例1第2项下溶剂的HPLC图。
图23为试验例1第2项下(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液的HPLC图。
图24为试验例1第2项下供试品溶液的HPLC图。
图25为试验例1第3项下(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的标准曲线图，纵坐标为峰面积，横坐标为浓度。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
替格瑞洛的批号为20140801；杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的对照品(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸盐的批号为TG-2-20131126，含量：99.7％，通过购买市售产品标定后使用。杂质Ⅳ批号为20140220，含量：99.8％；杂质Ⅴ批号为20140221，含量：99.6％；杂质Ⅵ批号为20140307，含量：98.7％；均来源于成都百裕科技制药有限公司。
杂质Ⅳ为替格瑞洛中杂质，其名称为(1S,2S,3R,5S)-3-(7-羟基-5-丙硫基-3I-[1,2,3]三氮唑[4,5-d]嘧啶-3-基)-5-(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇。
式Ⅴ为替格瑞洛中杂质，其名称为(1S,2S,3R,5S)-3-(7-氨基-5-丙硫基-3H-[1,2,3]三氮唑[4,5-d]嘧啶-3-基)-5-(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇。
式Ⅵ为替格瑞洛中杂质，其名称为(1S,2S,3R,5S)-3-(5-氨基-6-氯-2-丙硫基嘧啶-4－氨基)-5-(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇。
AUW220D型精密电子天平可购自岛津公司；LC-20AT型高效液相色谱泵可购自岛津公司，LC-20AT型高效液相色谱泵可购自岛津公司，SPD-M20A DAD检测器可购自岛津公司，SIL-20A自动进样器可购自岛津公司，LcSolution工作站可购自岛津公司；Waters 1525型高效液相色谱泵可购自沃特世公司，Waters 2489紫外检测器可购自沃特世公司，Waters2707自动进样器可购自沃特世公司，Breeze2工作站可购自沃特世公司；C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱可购自岛津公司；Agilent ZorbaxC18(250mm×4.6mm,3.5μm)可购自安捷伦有限公司；Waters Xselect CSH C18(4.6×150mm，3.5μm)可购自沃特世科技(上海)有限公司。
实施例1、本发明检测替格瑞洛中原料杂质的高效液相色谱方法
色谱柱：Waters Xselect CSH C18，4.6mm×150mm，3.5μm；
流动相A：0.05mol/L磷酸盐缓冲液(取0.05mol/L磷酸二氢钠溶液，用磷酸调pH值至3.5)；
流动相B：乙腈；
溶剂：乙腈-水(35:65)
柱温：40℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长210nm)。
进样体积：20μL。
梯度洗脱条件如下：
检测步骤：
取(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺0.08μg的对照品溶液。
取扁桃酸对照品适量，加溶剂配制成每1mL约含扁桃酸100μg的扁桃酸对照品溶液。
取杂质Ⅳ、杂质Ⅴ适量，加溶剂配制成每1mL约含各杂质0.5μg的混合杂质对照品溶液。
取替格瑞洛样品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含10mg的供试品溶液。
测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图1～图5。
图1为(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液的HPLC图，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的保留时间为6.187min。
图2为扁桃酸对照品溶液的HPLC图，扁桃酸的保留时间为3.583min。
图3为混合杂质对照品溶液的HPLC图，杂质Ⅳ的保留时间为7.782min，杂质Ⅴ的保留时间为8.893min。
图4为(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液、混合杂质对照品溶液的HPLC图，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的保留时间为6.257min，杂质Ⅳ的保留时间为7.501min，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺与杂质之间的分离度为4.820，杂质Ⅳ和杂质Ⅴ不干扰(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的检测，可以用于的(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的定性和/或定量检测。
图5为供试品溶液的HPLC图，替格瑞洛主峰的保留时间为21.171min，不干扰(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的检测，供试品中未检出(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺。
结果表明，本发明的色谱条件下，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺与杂质之间的分离度高，杂质Ⅳ和杂质Ⅴ不干扰(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的检测。
对比试验1：
色谱柱：Agilent Zorbax C184.6mm×250mm，3.5μm；
流动相A：磷酸盐缓冲液①〔取1.0mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH值至3.0)10ml，加水至900ml〕-乙腈(90:10)；
流动相B：磷酸盐缓冲液②〔取1.0mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH值至3.0)10ml，加水至300ml〕-乙腈(30:70)；
溶剂：乙腈-水(50:50)
柱温：35℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长210nm、242nm)。
梯度洗脱条件如下：
取杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺300μg的对照品溶液。
取扁桃酸适量，加溶剂配制成每1mL约含扁桃酸100μg的对照品溶液。
取杂质Ⅳ适量，加溶剂配制成每1mL约含杂质Ⅳ100μg的对照品溶液。
另取杂质Ⅳ、杂质Ⅴ、杂质Ⅵ适量，加溶剂配制成每1mL约含各杂质5μg的混合杂质溶液1。
同法配制(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸和杂质Ⅳ、杂质Ⅴ、杂质Ⅵ混合杂质溶液2。
测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图6～10所示。
图6为对比试验1色谱条件下(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液的HPLC图，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺保留时间为6.718min。
图7为对比试验1色谱条件下扁桃酸对照品溶液的HPLC图，扁桃酸的保留时间4.992min。
图8为对比试验1色谱条件下杂质Ⅳ对照品溶液的HPLC图，杂质Ⅳ的保留时间为6.842min。
图9为对比试验1色谱条件下混合杂质溶液1的HPLC图，杂质Ⅴ的保留时间8.662min，杂质Ⅵ的保留时间为10.832min。
图10为对比试验1色谱条件下混合杂质溶液2的HPLC图，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺和杂质Ⅳ的色谱峰完全重合，无法进行检测。
对比试验2：
色谱柱：Agilent Zorbax C184.6mm×250mm，3.5μm；
磷酸盐浓溶液的配制：取1.0mol/L磷酸二氢钠溶液，用磷酸分别调pH值至3.2)流动相A：磷酸盐缓冲液①〔取1.0mol/L磷酸二氢钠溶液10ml，加水至900ml〕-乙腈(90:10)；
流动相B：甲醇-乙腈(50:50)
溶剂：乙腈-水(50:50)
柱温：35℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长210nm、242nm)。
梯度洗脱条件如下：
取杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺300μg的对照品溶液。取(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液，加溶剂稀释至每1mL约含(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺0.2μg的对照品溶液
取替格瑞洛样品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。
取杂质Ⅳ、杂质Ⅴ、杂质Ⅵ适量，加溶剂分别配制成每1mL约含各杂质100μg的各杂质溶液。
另取杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸和杂质Ⅳ、杂质Ⅴ、杂质Ⅵ对照品溶液适量，加溶剂稀释至每1ml含各杂质5μg的混合杂质溶液。
测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图11～17所示。
图11为对比试验2色谱条件下(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液的HPLC图，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的保留时间为8.377min。
图12为对比试验2色谱条件下杂质Ⅳ对照品溶液的HPLC图，杂质Ⅳ的保留时间为8.858min。
图13为对比试验2色谱条件下杂质Ⅴ对照品溶液的HPLC图，杂质Ⅴ的保留时间为10.441min。
图14为对比试验2色谱条件下杂质Ⅵ对照品溶液的HPLC图，杂质Ⅵ对照峰，保留时间为12.478min。
图15为对比试验2色谱条件下混合杂质溶液的HPLC图，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺和杂质Ⅳ的色谱峰的保留时间分别为8.425、8.654min，两者之间的分离度低，为1.043。
图16为对比试验2色谱条件下供试品溶液的HPLC图，替格瑞洛峰的保留时间为23.743min。
图17为对比试验2色谱条件下(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品定量限溶液的HPLC图，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺浓度为0.2μg/ml，信噪比约为10:1，该色谱柱上样量一般不得超过1mg/ml，按此浓度计算，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺限度浓度应为0.004μg/ml，低于检测限，因此，对比试验2的方法不能准确检测杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺。
对比试验3：
色谱柱：COSMOSIL C184.6mm×150mm，5μm；
流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH值至4.0)；
流动相B：甲醇:乙腈＝50:50；
溶剂：乙腈-水(50:50)
柱温：35℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长210nm)。
梯度洗脱条件如下：
取杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸和杂质Ⅳ、杂质Ⅴ、杂质Ⅵ对照品溶液适量，加溶剂稀释至每1ml含各杂质5μg的混合杂质溶液。
测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图18～19所示。
图18为对比试验3色谱条件下混合杂质对照溶液的242nm波长下的HPLC图；在242nm处，杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺几乎无吸收，杂质Ⅳ保留时间为9.745min。
图19为对比试验3色谱条件下混合杂质对照溶液的210nm波长下的HPLC图；在210nm下，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的保留时间为10.194min，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺和杂质Ⅳ的分离度为1.537，但色谱柱条件限制杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的灵敏度不够，原因同对比试验2。
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例。
试验例1、本发明检测方法的方法学研究
本试验例中各种试验均采用如下条件：
色谱柱：Waters Xselect CSH C184.6mm×150mm，3.5μm；
流动相A：0.05mol/L磷酸盐缓冲液(用磷酸调pH值至3.5)；
流动相B：乙腈；
溶剂：乙腈-水(35:65)
柱温：40℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长210nm)。
进样体积：20μL。
梯度洗脱条件如下：
1、检测波长
取替格瑞洛和杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸对照品各适量，用溶剂溶解并稀释制成适宜浓度的溶液，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录IVA)在200～400nm范围内进行光谱扫描，紫外光谱图如图20～21所示。
结果显示，替格瑞洛在200～300nm均有吸收，而(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的紫外吸收在末端吸收段，因此选择在200～242nm范围内选择测定波长，最终选择检测波长210nm作为杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺测定的检测波长。
2、专属性试验
取(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸对照品适量，用溶剂溶解并稀释制成每1mL中各约含0.08μg的溶液，作为杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液。另取替格瑞洛适量，用溶剂溶解并稀释制成每1mL中约含10.0mg的溶液，作为供试品溶液。另取替格瑞洛中杂质Ⅳ、杂质Ⅴ适量，配制混合杂质对照品溶液。分别精密取上述混合杂质对照品溶液、供试品溶液、(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液及溶剂各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如图3～5，22～24所示。
结果表明，在本发明检测方法的条件下，替格瑞洛样品及替格瑞洛中其余杂质对(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的测定无干扰，证明本发明检测方法的专属性强。
3、标准曲线和线性范围
精密量取(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品溶液适量，用溶剂溶解并稀释制成一系列浓度的对照品溶液。分别精密取不同浓度的对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。分别测定峰面积，结果见表1。
表1、线性关系
以杂质对照品溶液的浓度为横坐标X，以其峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的线性回归方程及相关系数r，标准曲线如图25所示。
结果表明，本发明检测方法中杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的浓度在0.0169μg/mL～0.1906μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝69053.3876X+48.9232，r＝0.9996，证明本发明方法线性范围广，准确度高。
此外，从标准曲线方程和图可以看出，斜率远远大于截距，标准曲线接近原点，说明各杂质的含量测定适合于本发明的外标一点法。
4、精密度试验
取试验例1第3项下浓度为0.0805μg/mL的对照品溶液，精密取20μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，按照本发明的检测方法分别测定峰面积，结果见表2。
表2、精密度试验结果
编号 1 2 3 4 5 6 平均 RSD
保留时间 6.17 6.165 6.16 6.163 6.162 6.177 6.166 0.10％
峰面积 5684 5542 5677 5743 5842 5564 5675 1.97％
理论板数 7662 7759 7643 7509 7446 7473 7582 1.64％
拖尾因子 0.94 0.93 0.91 0.93 0.94 0.93 0.930 1.18％
计算得到杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺峰面积的RSD为：1.97％，证明本发明的检测方法精密度优异。
5、定量限
精密量取试验例第3项下浓度约为0.0169μg/mL的对照品溶液，精密取20μl，注入液相色谱仪，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，按照本发明的检测方法分别测定峰面积，结果见表3。
表3、定量限试验结果
编号 1 2 3 4 5 6 平均 RSD
保留时间 6.126 6.118 6.119 6.13 6.123 6.127 6.124 0.08％
峰面积 1331 1286 1203 1200 1205 1248 1246 4.32％
理论板数 9037 9231 9200 8701 9186 8910 9044 2.29％
拖尾因子 1.09 0.91 0.94 0.98 0.99 1.01 0.987 6.30％
杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的峰高约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N＝10计，得杂质TG-2的定量限为0.338ng，证明本发明方法的检测灵敏度高，可以充分满足含量测定的要求。
6、重复性试验
精密称取替格瑞洛6份，各约100mg，分别置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。精密量取上述6份供试品溶液各20μL，按照本发明的检测方法进行检测，按外标法以峰面积计算杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的含量，结果见表4。
表4、重复性试验结果
由上述结果可知，本发明检测方法的重复性良好。
7、溶液稳定性试验
精密称取替格瑞洛100.26mg，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。分别于配制后0h、1h、2h、4h、6h、8h进样10μL，记录色谱图，考察其供试品溶液中杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的稳定性情况，结果见表5。
表5、供试品溶液稳定性试验结果表
由上述结果可知，在配制后8小时内供试品溶液中杂质TG-2均未检出，证明本发明检查方法供试品溶液稳定。
8、回收率试验
精密称取替格瑞洛9份，各约100mg，分别置10mL量瓶中，加入试验例第3项下各杂质浓度约为0.8μg/mL的对照品溶液0.8mL、1.0mL、1.2mL各3份，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为回收率供试品溶液。分别精密取9份回收率供试品溶液及试验例第4项下的对照品溶液各20μL进样测定，记录色谱图，计算杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的测得量、对照品加入量及回收率，结果见表6。
计算公式：
式中：a为供试品中所含杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的量(μg)；
b为杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺对照品加入量(μg)；
c为杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的测得量(μg)。
表6、(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺回收率试验结果
结果表明，本发明检测方法测定替格瑞洛中的基因毒性杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺，回收率在91.41％～103.35％之间，相对标准偏差为3.64％，证明本发明的检测方法回收率好，准确度高。
综上所述，本发明提供了一种检测替格瑞洛中(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的高效液相色谱方法，(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺与其他杂质之间的分离度高，其他杂质不干扰(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的检测；同时，本发明方法具有良好的专属性、线性关系、精密度、灵敏度和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为监控替格瑞洛药物中的(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺含量提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了替格瑞洛药物的用药安全。

Claims (12)

1.一种检测替格瑞洛中(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、取(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(R)-扁桃酸，制备对照品溶液，用高效液相色谱方法进行检测，得到标准曲线；
b、取待检的替格瑞洛样品，制备供试品溶液，用高效液相色谱方法进行检测；
c、计算替格瑞洛样品中的(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺含量；
步骤a和b所用高效液相色谱方法的色谱条件为：
C18色谱柱；流动相A为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈；
梯度洗脱条件如下：
检测波长为200nm～242nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，制备对照品溶液的溶剂为乙腈-水；步骤b中，制备供试品溶液的溶剂为乙腈-水。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的乙腈-水中，乙腈与水的体积比为35:65。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述标准曲线是对照品色谱峰的峰面积与对照品浓度之间的线性关系方程。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，C18色谱柱为WatersXselect CSH C18柱，长度为150mm，内径为4.6mm，填料的粒径为3.5μm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，柱温为30℃～40℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，流动相A的pH值为3.0～4.0。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，流动相A的pH值为3.5。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，流速为0.8ml/min～1.1ml/min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，进样体积为10μl～50μl。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，进样体积为20μl。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件中，检测波长为210nm。
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