CN104820051B - 一种虫草菌粉(Cs-4)及其制剂金水宝胶囊的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种虫草菌粉(Cs‑4)及其制剂金水宝胶囊的质量检测方法，所述质量检测方法，包括马索亚内酯的提取及含量测定，含量测定方法为高效液相色谱法。

Description

一种虫草菌粉(Cs-4)及其制剂金水宝胶囊的检测方法

技术领域：

本发明属于医药领域，涉及一种中药制剂的检测方法，特别涉及一种虫草菌粉(Cs-4)及其制剂金水宝胶囊的含量测定方法。

背景技术：

金水宝制剂(如金水宝胶囊)为已经上市的产品，由发酵虫草菌粉(Cs-4)填充而得，具有补益肺肾，秘精益气功能。用于肺肾两虚，精气不足，久咳虚喘，神疲乏力，不寐健忘，腰膝痠软，月经不调，阳痿早泄；慢性支气管炎、慢性肾功能不全、高脂血症、肝硬化见上述证候者。

甘露醇、核苷类、麦角甾醇、虫草多糖、氨基酸等被认为是发酵虫草菌粉的活性成分，因此，收载入中国药典的金水宝片、胶囊和百令胶囊，以及收载入卫生部药品标准的至灵胶囊、宁心宝胶囊和心肝宝胶囊，均以腺苷或腺苷和甘露醇为含量测定的指标，缺乏各产品专属的指标成分。

最近，我们从Cs-4发酵菌丝体中发现了一种含量高、特征性强的化合物—马索亚内酯。有文献报道，马索亚内酯有良好的抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤等药理活性，因此可能是金水宝胶囊中重要的活性成分，且该化合物在其他菌种的发酵虫草产品中未被检出或含量极低，作为定量测定的指标成分具有很强的专属性。

本发明建立了虫草菌粉(Cs-4)及其制剂金水宝胶囊中马索亚内酯的高效液相色谱测定法，该方法精确度高，操作简单，精密度，稳定性，重复性良好。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的虫草菌粉(Cs-4)及其制剂金水宝胶囊的检测方法。为此，本发明提供一种测定虫草菌粉(Cs-4)及其制剂金水宝胶囊中马索亚内酯的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明为采用高效液相色谱法对虫草菌粉(Cs-4)及其制剂金水宝胶囊中含有的马索亚内酯进行含量测定。所述方法包括以下步骤：

供试品溶液的制备:取装量差异项下的本品内容物，置于离心管中，加入甲醇溶液，密塞，超声提取，离心，将上清液转移至量瓶。残渣重复上述提取过程，合并上清液，以甲醇溶液定容。取适量，过0.45um微孔滤膜，取滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备:精密称取马索亚内酯对照品，置于量瓶中，以甲醇溶解并定容，得对照品溶液。

测定法:分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算马索亚内酯的含量。

其中色谱条件如下:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-磷酸水溶液为流动相，等度洗脱。

优选的，本发明的含量测定方法。包括以下步骤：

供试品溶液的制备:取装量差异项下的本品内容物，混匀，取约0.1-2g，精密称定，置于10-50ml的离心管中，加入2-50ml 20-100％的甲醇溶液，密塞，超声提取5-60min，4500rmp/min下离心2-30min，将上清液转移至10-200ml量瓶。残渣重复上述提取过程两次，合并上清液，以20-100％的甲醇定容。取适量，过0.45um微孔滤膜，取滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备:精密称取0.001-0.1g马索亚内酯对照品，置于2-100ml量瓶中，以80％甲醇溶解并定容，得对照品储备液。分别吸取适量的对照品储备液，以20-100％甲醇稀释得到不同浓度的系列对照溶液，备用。

测定法:分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算马索亚内酯的含量。

其中色谱条件如下:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为10-50cm，内径为2-8mm，粒径为2-10μm；以乙腈：0.01-0.5％磷酸水溶液(50:50)为流动相，等度洗脱；检测波长为200-260nm；流速为0.5-1.0ml/min；进样量为2-50ul；柱温为10-30℃。理论板数按马索亚内酯峰计算应不低于2000-6000。

最优选的，本发明的含量测定方法。包括以下步骤：

供试品溶液的制备:取装量差异项下的本品内容物，混匀，取约0.5g，精密称定，置于50ml的离心管中，加入10ml 80％的甲醇溶液，密塞，超声提取10min，4500rmp/min下离心5min，将上清液转移至50ml量瓶。残渣重复上述提取过程两次，合并上清液，以80％的甲醇定容。取适量，过0.45um微孔滤膜，取滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备:精密称取0.01g马索亚内酯对照品，置于10ml量瓶中，以80％甲醇溶解并定容，得浓度为1000μg/mL的对照品储备液。分别吸取适量的对照品储备液，以80％甲醇稀释得到不同浓度的系列对照溶液，备用。

测定法:分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算马索亚内酯的含量。

其中色谱条件如下:照中华人民共和国药典2010年版附录ⅥD高效液相色谱法试验,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈-0.1％磷酸水溶液(50:50)为流动相，等度洗脱；检测波长为206nm；流速为1.0ml/min；进样量为10ul；柱温为30℃。理论板数按马索亚内酯峰计算应不低于2500。

其中，本品内容物是指：金水宝胶囊壳内的物质。

其中，马索亚内酯属于现有产品，可以在上市场购买到。

其中，续滤液是指：先被过滤下来的滤液称为初滤液，此时的滤液纯净度不够，弃去，把初滤液倒掉之后继续采集到的滤液，就是续滤液。

本发明的测定方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

1提取条件的选择

1.1提取方法的选择

由于马索亚内酯的挥发性较强，本发明采用提取温度较低的索氏提取和超声辅助法提取金水宝胶囊中的马索亚内酯。通过比较发现，超声辅助提取法的提取效率略高于索氏提取法，且索氏提取法操作繁琐，提取时间长，因此选用超声辅助提取法。

1.2提取溶剂的选择

考察了正己烷、二氯甲烷、甲醇作为提取溶剂时的提取效果，结果表明，甲醇对马索亚内酯的提取效率最高。又比较了不同浓度的甲醇的提取效率，发现80％甲醇水溶液作为提取溶剂时，提取效果最佳。

1.3提取次数的选择

超声时间对马索亚内酯的提取效率影响不大，从节省时间的角度考虑，选择超声时间为10min。超声提取次数增加，马索亚内酯的提取效率提高，但达3次后，马索亚内酯的提取效率不再提高，因此选择超声提取次数为3次。

2色谱条件的优化

2.1流动相的选择

选用甲醇-水、乙腈-水为流动相，并在流动相中添加磷酸，结果表明，乙腈-0.1％磷酸水溶液(50:50)为流动相时，马索亚内酯峰型对称，峰宽更窄。

2.2检测波长的选择

马索亚内酯仅有紫外末端吸收，因此选择检测波长为206nm。

3线性关系考察

精密吸取系列对照溶液10ul注入液相色谱仪中，按2.1色谱条件测定，以测得峰面积为纵坐标Y轴，对照品进样量为横坐标X轴，绘制标准曲线，计算得回归方程Y＝32945X+63444(r＝0.9999)，表明马索亚内酯在1.26-1260μg/mL范围内线性关系良好。

4精密度实验

4.1日内精密度：精密吸取三个不同浓度的对照溶液10ul注入液相色谱仪中，按2.1色谱条件测定，分别重复进样3次，计算得马索亚内酯峰面积的RSD分别为0.2％、0.1％、0.2％。

4.2日间精密度：精密吸取三个不同浓度的对照溶液10ul注入液相色谱仪中，按2.1色谱条件测定，分别重复进样3次，连续三天重复上述操作，测定峰面积，计算得RSD分别为1.3％、1.0％、0.4％。表明仪器精密度良好。

5稳定性试验

取同一批金水宝胶囊内容物，按2.3供试品溶液制备方法，分别于制备后0、2、4、8、12、24h进样10ul，测定峰面积，结果马索亚内酯的RSD为1.8％，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

6重复性试验

取同一批金水宝胶囊内容物6份，按2.3的方法制备，按2.1色谱条件的测定，结果马索亚内酯的平均含量分别为2.825mg/g，RSD为0.1％。说明该方法的重复性良好。

7回收率试验

取同一批金水宝胶囊9份，各约0.5g，分成三组，精密加入对照品溶液0.768、1.536、3.072mg，待溶剂挥干后，按本发明最优选的供试品溶液制备方法和液相色谱条件进样分析，计算回收率，结果见表1。马索亚内酯在三个加样水平下的回收率分别为102.1％、100.0％、100.6％，RSD分别为0.7％、0.6％、0.5％。说明方法的回收率结果良好。

表1 加标回收试验结果

本发明的检测方法对产品的质量控制更为有效，准确度、灵敏度、稳定性均较高。本发明的方法既可以用于虫草菌粉(Cs-4)及其制剂金水宝胶囊的质量控制，又可以用于以虫草菌粉(Cs-4)为原料的其他制剂，如片剂，颗粒剂、蜜丸、口服液等的质量控制。

附图说明：

图1马索亚内酯的化学结构；

图2其中a为供试品的的液相色谱图、b为对照品的液相色谱图、c为溶剂空白的液相色谱图。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1 金水宝胶囊

处方：发酵虫草菌粉(Cs-4)330g

制法：取发酵虫草菌粉(Cs-4)，粉碎成细粉，装入胶囊，制成1000粒，即得。

质量检测方法：

供试品溶液的制备:取装量差异项下的本品内容物，混匀，取约0.5g，精密称定，置于50ml的离心管中，加入10ml 80％的甲醇溶液，密塞，超声提取10min，4500rmp/min下离心5min，将上清液转移至50ml量瓶。残渣重复上述提取过程两次，合并上清液，以80％的甲醇定容。取适量，过0.45um微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备:精密称取0.0126g马索亚内酯对照品，置于10ml量瓶中，以80％甲醇溶解并定容，得浓度为1260μg/mL的对照品储备液。分别吸取适量的对照品储备液，以80％甲醇稀释得到不同浓度的系列对照溶液，备用。

色谱条件:照中华人民共和国药典2010年版附录Ⅵ D高效液相色谱法试验,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈-0.1％磷酸水溶液(50:50)为流动相，等度洗脱；检测波长为206nm；流速为1.0ml/min；进样量为10ul；柱温为30℃。理论板数按马索亚内酯峰计算应不低于2500。

测定法:分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算马索亚内酯的含量。

样品：为本公司生产的金水宝胶囊，规格为：0.33g/粒，批号为：131004,130913,140208，共三批，其包装均为市售包装。检测结果见表2。

表2 三批样品测定结果

从结果可以看出，本实验建立的金水宝胶囊中指标成分马索亚内酯的HPLC测定方法具有简便、准确的优点，不同批次的金水宝胶囊中马索亚内酯的含量稳定且较高，因此适合作为指标成分用于虫草菌粉(Cs-4)及其制剂金水宝胶囊的质量控制。

Claims (4)

1.一种虫草菌粉Cs-4及其制剂金水宝胶囊的检测方法,其特征在于,步骤如下:

供试品溶液的制备:取装量差异项下的本品内容物，置于离心管中，加入甲醇溶液，密塞，超声提取，离心，将上清液转移至量瓶，残渣重复上述提取过程，合并上清液，以甲醇溶液定容，取适量，过0.45μm 微孔滤膜，取滤液作为供试品溶液，

对照品溶液的制备:精密称取马索亚内酯对照品，置于量瓶中，以甲醇溶解并定容，得对照品溶液，

测定法:分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算马索亚内酯的含量，

其中色谱条件如下:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以50:50＝乙腈：0.01-0.5％磷酸水溶液为流动相，等度洗脱。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤如下:

供试品溶液的制备:取装量差异项下的本品内容物，混匀，取0.1-2g，精密称定，置于10-50ml的离心管中，加入2-50ml 20-100％的甲醇溶液，密塞，超声提取5-60min，4500rmp/min下离心2-30min，将上清液转移至10-200ml量瓶，残渣重复上述提取过程两次，合并上清液，以20-100％的甲醇定容，取适量，过0.45μm 微孔滤膜，取滤液作为供试品溶液，

对照品溶液的制备:精密称取0.001-0.1g马索亚内酯对照品，置于2-100ml量瓶中，以80％甲醇溶解并定容，得对照品储备液，分别吸取适量的对照品储备液，以20-100％甲醇稀释得到不同浓度的系列对照溶液，备用，

测定法:分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算马索亚内酯的含量，

其中色谱条件如下:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为10-50cm，内径为2-8mm，粒径为2-10μm；以50:50＝乙腈：0.01-0.5％磷酸水溶液为流动相，等度洗脱；检测波长为200-260nm；流速为0.5-1.0ml/min；进样量为2-50μl ；柱温为10-30℃，理论板数按马索亚内酯峰计算应不低于2000-6000。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤如下:

供试品溶液的制备:取装量差异项下的本品内容物，混匀，取0.5g，精密称定，置于50ml的离心管中，加入10ml 80％的甲醇溶液，密塞，超声提取10min，4500rmp/min下离心5min，将上清液转移至50ml量瓶，残渣重复上述提取过程两次，合并上清液，以80％的甲醇定容，取适量，过0.45μm 微孔滤膜，取滤液作为供试品溶液，

对照品溶液的制备:精密称取0.01g马索亚内酯对照品，置于10ml量瓶中，以80％甲醇溶解并定容，得浓度为1000μg/mL的对照品储备液，分别吸取适量的对照品储备液，以80％ 甲醇稀释得到不同浓度的系列对照溶液，备用，

测定法:分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算马索亚内酯的含量，

其中色谱条件如下:照中华人民共和国药典2010年版附录ⅥD高效液相色谱法试验,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈-0.1％磷酸水溶液＝50:50为流动相，等度洗脱；检测波长为206nm；流速为1.0ml/min；进样量为10μl ；柱温为30℃，理论板数按马索亚内酯峰计算应不低于2500。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤如下:

供试品溶液的制备:取装量差异项下的本品内容物，混匀，取0.5g，精密称定，置于50ml的离心管中，加入10ml 80％的甲醇溶液，密塞，超声提取10min，4500rmp/min下离心5min，将上清液转移至50ml量瓶，残渣重复上述提取过程两次，合并上清液，以80％的甲醇定容，取适量，过0.45μm 微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液，

对照品溶液的制备:精密称取0.0126g马索亚内酯对照品，置于10ml量瓶中，以80％甲醇溶解并定容，得浓度为1260μg/mL的对照品储备液，分别吸取适量的对照品储备液，以80％甲醇稀释得到不同浓度的系列对照溶液，备用，

色谱条件:照中华人民共和国药典2010年版附录ⅥD高效液相色谱法试验,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈-0.1％磷酸水溶液＝50:50为流动相，等度洗脱；检测波长为206nm；流速为1.0ml/min；进样量为10μl ；柱温为30℃，理论板数按马索亚内酯峰计算应不低于2500，

测定法:分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算马索亚内酯的含量。