CN105021751A

CN105021751A - 玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法

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Publication number: CN105021751A
Application number: CN201510377388.1A
Authority: CN
Inventors: 周劲松; 张洪坤; 黄玉瑶; 王永辉; 连林生; 张健
Original assignee: GUANGZHOU XIANGXUE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU XIANGXUE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2035-06-30
Also published as: CN105021751B

Abstract

本发明涉及一种玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法，包括如下步骤：(1)取玉屏风制剂，粉碎或不粉碎后精密称定，加入甲醇回流提取1-3h，过滤，浓缩后加甲醇定容，即得供试品溶液；(2)分别精密称取对照品升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ，加入甲醇溶解定容，即得混合对照品溶液；(3)测定：分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，以一定流动相条件梯度洗脱，采用多波长同时监测，即得。该方法可同时准确测定玉屏风制剂中10中成分的含量，能够客观、全面、灵敏地反映玉屏风制剂质量情况。

Description

玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法

技术领域

本发明涉及药材检测领域，特别是涉及一种玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法。

背景技术

经典方剂玉屏风制剂是扶正祛邪的代表方，来源自南宋嘉定六年(1213年)张松《究原方》，由黄芪、白术和防风组成。其中黄芪甘温，内补脾肺之气，外可固表止汗，为君药；白术健脾益气，助黄芪以加强益气固表之功，为臣药；佐以防风走表而散风邪。该方对人体犹如抵御外邪的屏障，故称玉屏风。具有益气固表、健脾止汗的作用。主治气虚自汗、易感风寒之证，临床疗效确切，被称为中成药中的丙种球蛋白。

然而就目前而言，玉屏风制剂的质量控制方法还存在较大缺陷，如《中国药典》仅通过经氨转化所得黄芪甲苷的含量来表征其质量(药材中黄芪甲苷含量较低)，其它文献主要的控制方向为制剂中的黄芪和防风的成分，而对臣药白术的控制较为鲜少，而含量测定作为中药质量标准中的关键内容之一，对于复方制剂而言，仅针对制剂中的某单一成分或较少的几种成分进行含量测定，是难以客观、全面及灵敏地反映玉屏风制剂质量情况的，即难以全面控制中药制剂的质量。

发明内容

基于此，有必要提供一种玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法。

一种玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液制备：取玉屏风制剂，粉碎或不粉碎后精密称定，加入甲醇回流提取1-3h(优选为2h)，过滤，浓缩后加甲醇定容，即得供试品溶液；

(2)混合对照品溶液制备：分别精密称取对照品升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ，加入甲醇溶解后混合定容，即得混合对照品溶液；

(3)测定：分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，采用多波长同时监测，即得，其中，

所述高效液相色谱仪的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度0.02-0.1％磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。

在所述测定过程中，优选为采用标准曲线法进行成分含量的计算测定。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0-60min，流动相A的体积百分数由15％变化至35％；60-80min，流动相A的体积百分数由35％变化至47％；80-95min，流动相A的体积百分数由47％变化至70％；95-110min，流动相A的体积百分数由70％变化至90％。

在其中一个实施例中，所述流动相B为体积浓度0.05％磷酸水溶液。

在其中一个实施例中，所述多波长同时检测的方法为：升麻素苷的检测波长为300nm、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的检测波长为257nm、升麻素的检测波长为246nm、5-O-甲基维斯阿米醇苷的检测波长为294nm、亥茅酚苷的检测波长为256nm、毛蕊异黄酮的检测波长为248nm、芒柄花素的检测波长为249nm、白术内酯Ⅲ的检测波长为221nm、白术内酯Ⅰ的检测波长为220nm、白术内酯Ⅱ的检测波长为278nm。

在其中一个实施例中，所述加甲醇定容的方法为：每克玉屏风制剂，加入甲醇定容至10mL。

在其中一个实施例中，所述混合对照品溶液中包括升麻素苷35μg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷20μg/mL、升麻素10μg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷30μg/mL、亥茅酚苷25μg/mL、毛蕊异黄酮20μg/mL、芒柄花素40μg/mL、白术内酯Ⅲ5μg/mL、白术内酯Ⅰ5μg/mL、白术内酯Ⅱ5μg/mL。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱(优选为YMC Hydrosphere C₁₈，4.6×250mm，5μm)；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测器为二极管阵列检测器。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

从中药质量标准的技术要求方面，多成分的含量测定是一个较优的方法，而多波长的含量测定方法能提高多成分含量的准确度和灵敏度。基于此，本发明所述玉屏风制剂中10种成分(升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ)的含量测定方法，通过了大量的实验对供试品溶液的制备以及高效液相色谱的测定条件进行研究，能够更为全面控制玉屏风制剂的质量：

采用甲醇对玉屏风制剂进行回流提取，并合理控制提取时间为1-3h，可有效增加玉屏风制剂中各成分(如毛蕊异黄酮葡萄糖苷)的稳定性，提高含量测定结果的准确性；

通过对流动相系统进行考察，发现采用乙腈-体积浓度(0.02-0.1)％磷酸水溶液(优选体积浓度为0.05％)系统按照本发明所述的梯度洗脱方式进行洗脱，可使各成分的色谱峰之间的分离度好，干扰小，峰形好，基线平稳，且较低浓度的酸溶液有利于保护色谱柱；

由于各个成分的最大吸收波长差别很大，很难在同一波长较好的表现出来，因此本申请采用多波长同时检测的方式进行测定，并在此基础上对各成分的检测波长进行优选，在保证各成分分别具有较大吸收的同时，减小杂质的干扰，提高各成分色谱峰的专属性；

采用C18色谱柱(优选为YMC Hydrosphere C₁₈)分析所得的指纹图谱中，色谱峰尖锐对称，可获得较为丰富的峰信息。

综上，本发明所建立的含量测定方法，各成分的专属性良好，无干扰峰；线性关系良好，均在0.9998以上；仪器精密度(n＝6)的RSD均小于2％；方法重复性(n＝6)的RSD均小于2％；48h内稳定，RSD均小于2％；回收率在98％-100％，RSD均小于2％，回收率较佳。由此，可准确的同时测定玉屏风制剂中升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ的含量，以此客观、全面、灵敏地反映玉屏风制剂质量情况。

附图说明

图1为230nm波长下的混合对照品溶液的高效液相色谱图；

图2为278nm波长下的混合对照品溶液的高效液相色谱图；

图3为230nm波长下的供试品溶液的高效液相色谱图；

图4为278nm波长下的供试品溶液的高效液相色谱图；

图5为玉屏风制剂中12个成分的专属性考察图，其中，

1-升麻素苷，2-毛蕊异黄酮葡萄糖苷，3-升麻素，4-5-O-甲基维斯阿米醇苷，5-芒柄花苷，6-亥茅酚苷，7-毛蕊异黄酮，8-槲皮素，9-芒柄花素，10-白术内酯III，11-白术内酯I，12-白术内酯II。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法作进一步详细的说明。

1、材料

1.1药物与试剂

黄芪、防风、麸炒白术为香雪制药股份有限公司研发生产；玉屏风散样品为香雪制药股份有限公司自生产，将黄芪、防风、麸炒白术，分别粉碎，按3:1:1比例混合均匀即得。

对照品升麻素苷(中国食品药品检定研究院，111522-201209)毛蕊异黄酮葡萄糖苷(中国食品药品检定研究院，111920-201203)、升麻素(成都瑞芬思生物科技有限公司，S-007-130908)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(中国食品药品检定研究院，111523-201208)、亥茅酚苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，H-027-130912)、毛蕊异黄酮(成都瑞芬思生物科技有限公司，M-021-130525)、芒柄花素(成都瑞芬思生物科技有限公司，C-018-130428)、白术内酯Ⅲ(成都瑞芬思生物科技有限公司，B-035-130428)、白术内酯Ⅰ(成都瑞芬思生物科技有限公司，B-033-130428)、白术内酯Ⅱ(成都瑞芬思生物科技有限公司，B-035-130428)、芒柄花苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，M-013-130516)和槲皮素(中国食品药品检定研究院，100081-200907)。

甲醇、乙腈为色谱纯(德国默克)，水为超纯水。其他试剂均为分析纯。

1.2仪器

电子天平(Mettler Toledo XS204(d＝0.1mg)、Mettler Toledo XP205(d＝0.01mg))、HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、Simplicity UV纯水机(Millipore)、高效液相色谱仪(DIONEX Ultimate 3000、DAD-3000检测器)

2、方法与结果

2.1色谱条件

色谱条件：色谱柱(YMC Hydrosphere C₁₈，4.6×250mm，5μm)；流动相乙腈(A)-体积浓度0.05％的磷酸水溶液(B)，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测器为DAD检测器；供试品溶液的进样量为10μL；波长与洗脱梯度见表1、2。

表1测定波长

表2梯度条件

2.2混合对照品溶液的制备

分别精密称取升麻素苷3.5mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷2.0mg、升麻素2.0mg、5-O-甲基维斯阿米醇苷3.0mg、亥茅酚苷2.5mg、毛蕊异黄酮2.0mg、芒柄花素4.0mg、白术内酯Ⅲ4.0mg、白术内酯Ⅰ4.0mg、白术内酯Ⅱ4.0mg、芒柄花苷2.0mg、槲皮素2.0mg，用甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，得各对照品储备液，储存于4℃的冰箱中，备用。

分别精密量取各对照品储备液适量，用甲醇定容，配制成含升麻素苷35μg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷20μg/mL、升麻素10μg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷30μg/mL、亥茅酚苷25μg/mL、毛蕊异黄酮20μg/mL、芒柄花素40μg/mL、白术内酯Ⅲ5μg/mL、白术内酯Ⅰ5μg/mL、白术内酯Ⅱ5μg/mL、芒柄花苷20μg/mL、槲皮素20μg/mL的混合标准品溶液。

由于各个成分的最大吸收波长差别很大，很难在同一波长较好的表现出来，所本发明仅选定了能较好表现色谱分离的波长230nm和278nm(白术内酯II)来表现色谱图，以便确认各个成分的分离效果以及出峰位置进行检测，结果见图1、2。其具体测定时，应在选定的测定波长下完成。

结果，虽然12个成分的混合对照品分离的效果很好，但是样品中芒柄花苷与槲皮素的专属性差，因此最后并没有作为含量的指标，但是我们还是选择将其在色谱图中标示出来，按出峰顺序为5号峰和8号峰。

2.3供试品溶液的制备

取玉屏风散粉末1g，精密称定，加50mL甲醇回流提取2h，过滤，滤液浓缩至干后，加甲醇定容至10mL，即得。

供试品溶液在波长230nm和278nm条件下的色谱图结果见图3、4。

2.4专属性

以不加入该味药材的全方制剂作为阴性样品，在各化学成分的最大吸收波长下，进行专属性考察，研究结果表明升麻素苷(1)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(2)、升麻素(3)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(4)、亥茅酚苷(6)、毛蕊异黄酮(7)、芒柄花素(9)、白术内酯Ⅲ(10)、白术内酯Ⅰ(11)、白术内酯Ⅱ(12)的专属性较强，可进行准确定量。而芒柄花苷(5)和槲皮素(8)较差，存在干扰，不作为含量测定成分，结果见图5。

2.5线性关系考察

将2.2项下的混合对照品溶液，分别进样不同体积，取其峰面积(Y)平均值为纵坐标，进样的质量(X)为横坐标，进行回归分析，所得回归方程见表3。

表3 10种成分的线性回归方程

2.6稳定性

取同一供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、24、48h注入液相色谱仪，记录各组分峰面积。结果升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ峰面积的RSD(n＝6)分别为0.86％、1.94％、0.26％、0.39％、1.05％、0.66％、0.32％、0.23％、0.59％、0.95％，表明供试品溶液在48h内稳定。

2.7精密度试验

取同一混合对照品溶液，按2.1项色谱条件进样测定，分别在同一天连续进样6次进行日内精密度试验和连续5d每天6次测定进行日间精密度试验，计算各待测物峰面积的RSD，结果升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ的日内RSD分别为0.35％、0.32％、0.18％、0.50％、0.95％、0.25％、0.48％、0.31％、0.13％、0.26％，日间精密度分别为0.84％、1.78％、0.44％、0.48％、0.45％、0.51％、0.22％、0.41％、0.50％、0.77％，表明仪器精密度良好。

2.8重现性试验

精密称取同一批玉屏风散粉末1g，共6份，按照2.3项方法制备供试品溶液，按照2.1项色谱条件进样分析，测定峰面积，计算含量，测得升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ的含量平均值分别为0.031％、0.023％、0.011％、0.039％、0.0039％、0.0094％、0.0058％、0.0076％、0.0065％、0.0054％，RSD分别为1.04％、1.91％、0.50％、0.40％、1.58％、0.77％、0.53％、0.40％、0.59％、0.88％，表明该方法重复性良好。

2.9加样回收率

精密称取玉屏风散粉末9份，每份0.5g，分成3组，每组3份，分别精密添加升麻素苷1.4mg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.05mg/mL、升麻素0.5mg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷1.8mg/mL、亥茅酚苷0.18mg/mL、毛蕊异黄酮0.43mg/mL、芒柄花素0.27mg/mL、白术内酯Ⅲ0.35mg/mL、白术内酯Ⅰ0.30mg/mL、白术内酯Ⅱ0.25mg/mL的混合对照品溶液0.6mL、1mL、1.4mL，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表4。

表4 10种成分的加样回收率

综上知，在本发明所建立的方法条件下，玉屏风散中各成分的专属性良好，无干扰峰；线性关系良好，均在0.9998以上；仪器精密度(n＝6)的RSD均小于2％；方法重复性(n＝6)的RSD均小于2％；48h内稳定，RSD均小于2％；回收率在98％-100％，RSD均小于2％，回收率较佳，由此可同时准确测定玉屏风制剂中升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ的含量，客观、全面、灵敏地反映玉屏风制剂质量情况。

2.10样品测定

取自生产的玉屏风散样品16批，每批2份各1g，精密称定，按照2.3项下方法制备供试品溶液，2.2项下方法制备混合对照品溶液，按照2.1项色谱条件，分别精密吸取不同体积的混合对照品溶液以及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，采用多波长同时监测，建立标准曲线，计算供试品溶液中各成分含量，结果取平均值，见表5。

表5样品含量测定结果(％，n＝3)

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)供试品溶液制备：取玉屏风制剂，粉碎或不粉碎后精密称定，加入甲醇回流提取1-3h，过滤，浓缩后加甲醇定容，即得供试品溶液；

2.根据权利要求1所述的玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱方式为：0-60min，流动相A的体积百分数由15％变化至35％；60-80min，流动相A的体积百分数由35％变化至47％；80-95min，流动相A的体积百分数由47％变化至70％；95-110min，流动相A的体积百分数由70％变化至90％。

3.根据权利要求1所述的玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法，其特征在于，所述流动相B为体积浓度0.05％磷酸水溶液。

4.根据权利要求1所述的玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法，其特征在于，所述多波长同时检测的方法为：升麻素苷的检测波长为300nm、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的检测波长为257nm、升麻素的检测波长为246nm、5-O-甲基维斯阿米醇苷的检测波长为294nm、亥茅酚苷的检测波长为256nm、毛蕊异黄酮的检测波长为248nm、芒柄花素的检测波长为249nm、白术内酯Ⅲ的检测波长为221nm、白术内酯Ⅰ的检测波长为220nm、白术内酯Ⅱ的检测波长为278nm。

5.根据权利要求1所述的玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法，其特征在于，所述加甲醇定容的方法为：每克玉屏风制剂，加入甲醇定容至10mL。

6.根据权利要求1所述的玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法，其特征在于，所述混合对照品溶液中包括升麻素苷35μg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷20μg/mL、升麻素10μg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷30μg/mL、亥茅酚苷25μg/mL、毛蕊异黄酮20μg/mL、芒柄花素40μg/mL、白术内酯Ⅲ5μg/mL、白术内酯Ⅰ5μg/mL、白术内酯Ⅱ5μg/mL。

7.根据权利要求1-6任一项所述的玉屏风制剂中多种成分的含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测器为二极管阵列检测器。