CN104713956A - 一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法，包括：(1)取黄芪川芎提取物细粉，精密称定，加入甲醇，超声提取，过滤，滤液挥干，残渣用乙醇溶解并定容，滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；(2)取阿魏酸对照品、洋川芎内酯I对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、芒柄花苷对照品、毛蕊异黄酮对照品、芒柄花素对照品，精密称定，分别加入甲醇制成对照品溶液；(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，即得黄芪川芎提取物指纹图谱。本发明对于指导在临床用药及生产过程中对于原料药有效的投料指导、确保质量的可靠具有积极作用；操作方便、快捷，对中药材黄芪川芎提取物质量进行评价，结论较为客观、准确。
Description
技术领域
本发明属于中药指纹图谱领域，特别涉及一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法。
背景技术
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。川芎为伞形科植物川芎(Ligusticum chuanxiong)的干燥根茎。黄芪和川芎分别被收载于中国药典2010年版一部，是常用中药，在复方中药中出现频率较高。如防己黄芪汤、大川芎丸、芪麝丸等。
芪麝丸是近年来研究开发的中药复方制剂，用于治疗颈椎病。全方由黄芪、川芎、人工麝香、青风藤、防己和人工牛黄六味药组成，具有益气化瘀、祛风通络、舒筋止痛之功效，主要适用于神经根型颈椎病表现出的颈部疼痛不适、上肢麻木、上肢放射性疼痛、神疲乏力等气虚血瘀证症状。黄芪和川芎在处方中是君药，也是该制剂制备过程中的重要中间产物。目前，对该制剂的质量控制仅仅是对成方制剂中的两种化学成分进行含量分析，对4味药进行薄层鉴别。但是制剂的质量是与原料、中间体的质量相互关联，从源头即原料方面进行质量控制很重要，但是中间体受生产环节中环境、设备及条件的影响，对成品的质量也会产生一定的影响。
黄芪中含有多种成分如皂苷类、黄酮类、多糖等成分；川芎中主要含有生物碱类、挥发油类，有机酸类及内酯类化合物。所含有的多种成分决定了其在液相色谱分离与检测中会以多个特征与专属的色谱峰形式出现，这些特征峰的数量及面积的大小对于监控中间体的质量可发挥重要的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法，该方法可有效地监控黄芪川芎药材的质量，保证其在临床或生产应用时的有效、安全和稳定。
本发明的一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法，包括：
(1)取黄芪川芎提取物细粉，精密称定，加入甲醇，35KHz～60KHz、280W超声提取30min，过滤，滤液挥干，残渣用乙醇溶解并定容，滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)取阿魏酸对照品、洋川芎内酯I对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、芒柄花苷对照品、毛蕊异黄酮对照品、芒柄花素对照品，精密称定，分别加入甲醇制成对照品溶液；
(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，即得黄芪川芎提取物指纹图谱；其中，色谱条件为：色谱柱：Athena C18-WP色谱柱；柱温：25℃～40℃；检测波长：205nm～280nm；进样体积：10μl；流速：1ml·min-1；流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～15min：5％B→8％B，15～35min：8％B→14％B，35～70min：14％B→30％B，70～90min：30％B→50％B，90～105min：50％B→100％B。
所述步骤(1)中的黄芪川芎提取物的获取方式为：黄芪、川芎经过水提取后减压浓缩和干燥后制得；或黄芪和川芎经过70％乙醇回流提取后，经回收乙醇，加压浓缩干燥后制得；或川芎提取挥发油后，其药渣与黄芪加水提取后减压浓缩干燥后制得；或黄芪、川芎经过水提取后减压浓缩至相对密度达1.08～1.16(80℃)，加入乙醇使含醇量达70％静置过夜，回收乙醇，减压浓缩干燥后制得；或川芎提取挥发油后，其药渣与黄芪加水提取后减压浓缩至相对密度达1.08～1.16(80℃)，加入乙醇使含醇量达70％静置过夜，回收乙醇，减压浓缩干燥后制得。
所述步骤(1)中的黄芪川芎提取物与甲醇的比例为1g:60ml；黄芪川芎提取物中川芎和黄芪的质量比为1:1～5。
所述步骤(1)中的微孔滤膜的孔径为0.22μm。
所述步骤(1)和(2)中的甲醇的体积百分数为90％～100％；步骤(1)中的乙醇的体积百分数为70％。
所述步骤(2)中的对照品溶液具体为：每1ml中各含阿魏酸、洋川芎内酯、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素30～40ng的混合溶液。
所述步骤(3)中的Athena C18-WP色谱柱规格为4.6mm×250mm，填料粒度大小为5μm。
所述步骤(3)中的黄芪川芎提取物指纹图谱中12个色谱峰被确定为共有色谱峰，通过与对照品保留时间的比较，确定峰6为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰7为阿魏酸，峰8为洋川芎内酯I，峰10为芒柄花苷，峰11为毛蕊异黄酮，峰12为芒柄花素。
有益效果
本发明特对药材指纹图谱进行了研究，建立了液相指纹图谱测定条件，并进行了方法学考察，根据多批大生产样品，制订了黄芪川芎提取物液相指纹图谱标准，在生产过程中可有效的指导投料、规范生产操作，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠，对所测得的指纹图谱的辨认，采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对药材指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。
附图说明
图1为对照品指纹图谱；其中，1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷；2为阿魏酸；3为洋川芎内酯I；4为芒柄花苷；5为毛蕊异黄酮；6为芒柄花素；
图2为10个批次黄芪川芎提取物指纹图谱；
图3为黄芪川芎提取物标准指纹图谱；其中，6为毛蕊异黄酮葡萄糖苷；7为阿魏酸；8为洋川芎内酯I；10为芒柄花苷；11为毛蕊异黄酮；12为芒柄花素。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.检测波长的选择
所建立的测试波长是通过以下实验确定的，比较208nm、254nm和280nm下的指纹谱图，发现280nm下基线平稳，色谱峰数量多，吸收强度大，最终选择280nm作为检测波长。
2.色谱柱的选择和流动相洗脱梯度程序的优化
①Kromasil 100-5C18色谱柱
供试品溶液的制备：取黄芪川芎提取物约0.7g，精密称定，加70％乙醇20ml超声(35KHz，280W)提取30min，放冷，补足减失的溶剂重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱为Kromasil 100-5C18色谱柱；柱温为30℃；流动相为水(A)-甲醇(B)；洗脱条件为：0～15min：5％B，15～120min：5％B→70％B，120～125min：70％B→100％B，流速为1ml·min-1，进样体积为10μl；检测波长为280nm。发现使用该色谱柱谱图基线漂移，不适合本样品应用。
②Waters Xselect CSH C18色谱柱
供试品溶液的制备：取黄芪川芎提取物1.0g，精密称定，加20ml 70％乙醇超声(35KHz，280W)提取30min，放冷，补足减失的溶剂重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱为Waters Xselect CSHC18色谱柱；柱温为30℃；流动相为0.2％甲酸水(A)-甲醇(B)；洗脱条件为：0～25min：5％B→10％B，25～90min：10％B→35％B，90～120min：35％B→60％B，120～140min：60％B→100％B，流速为1ml·min-1，进样体积为10μl；检测波长为280nm。发现使用waters的色谱柱，在上述色谱条件下基线漂移严重。
③Athena C18-WP色谱柱
供试品溶液的制备：取黄芪川芎提取物0.5g，精密称定，加70％乙醇30ml超声(35KHz，280W)提取30min，过滤，滤液挥干，残渣用70％乙醇溶解并定容至5ml，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱为Athena C18-WP色谱柱；柱温为30℃；流动相为水(A)-乙腈(B)；洗脱条件为：0～15min：5％B→8％B，15～35min：8％B→14％B，35～70min：14％B→30％B，70～90min：30％B→50％B，90～105min：50％B→100％B，流速为1ml·min-1，进样体积为10μl；检测波长为280nm。
优化得到的该方法下的指纹谱图效果较好。故最终选用Athena C18-WP色谱柱和上述洗脱梯度。
3.柱温的筛选
供试品溶液的制备：取黄芪川芎提取物约0.5g，精密称定，加甲醇30ml超声(35KHz，280W)提取15min，过滤，滤液挥干，用70％乙醇溶解并定容至5ml，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱为Athena C18-WP色谱柱；流动相为水(A)-乙腈(B)；洗脱条件为：0～15min：5％B→8％B，15～50min：8％B→20％B，50～80min：30％B→50％B，80～105min：30％B→50％B，105～135min：50％B→100％B；流速为1ml·min-1，进样体积为10μl；检测波长为280nm。柱温分别为25℃、30℃、35℃，通过比较不同柱温条件，发现虽然3个温度均可用于测试，但以30℃较好。
4.供试品制备提取溶剂的选择
在研究过程中发现黄芪川芎提取物采用水溶解进样所得谱图基线漂移，故比较供试品溶液采用下列3种方法制备，以期选择较佳制备条件。
供试品溶液1的制备：取黄芪川芎提取物约0.5g，精密称定，加70％乙醇30ml超声(35KHz，280W)提取30min，过滤，滤液挥干，用70％乙醇溶解并定容至5ml，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
供试品溶液2的制备：取黄芪川芎提取物约2g，精密称定，加70％甲醇20ml超声(35KHz，280W)提取30min，静置至室温并补足减重，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
供试品溶液3的制备：取黄芪川芎提取物约0.5g，精密称定，加甲醇30ml超声(35KHz，280W)提取30min，过滤，滤液挥干，残渣用70％乙醇溶解溶解并定容至5ml，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱为Athena C18-WP色谱柱；柱温为30℃；流动相为水(A)-乙腈(B)；洗脱条件为：0～15min：5％B→8％B，15～50min：8％B→20％B，50～80min：30％B→50％B，80～105min：30％B→50％B，105～135min：50％B→100％B，流速为1ml·min-1，进样体积为10μl；检测波长为280nm。
三种溶剂制备得到的供试品溶液中，供试品溶液1和3谱图效果较佳，但第3种方法更省时间，故选用甲醇超声提取样品并滤过挥干，用70％乙醇溶解并定容的方法制备供试品溶液。
5.供试品制备提取时间的选择
供试品溶液的制备方法：取黄芪川芎提取物约0.5g三份，精密称定，分别加甲醇30ml超声(35KHz，280W)提取15min、30min和45min等不同时间，提取液滤过，滤液挥干，用70％乙醇溶解并定容至5ml，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱为Athena C18-WP色谱柱；柱温为30℃；流动相为水(A)-乙腈(B)；洗脱条件为：0～15min：5％B→8％B，15～50min：8％B→18％B，50～85min：18％B→30％B，85～105min：30％B→50％B，105～120min：50％B→100％B；流速为1ml·min-1，进样体积为10μl；检测波长为280nm。
提取15min，提取稍有不完全，30min、45min制得的供试品溶液各峰峰面积相差很小，为节省时间故选择30min作为超声提取时间。
6.所建立黄芪川芎提取物指纹图谱测定方法，该方法包括以下步骤；
(1)供试品溶液制备：供试品溶液的制备方法：取黄芪川芎提取物细粉，精密称定，加30ml甲醇超声(35KHz，280W)提取30min，过滤，滤液挥干，残渣用70％乙醇溶解并定容至5ml，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
(2)用甲醇制得每1ml中各含阿魏酸、洋川芎内酯、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素30～40ng的混合溶液，即得对照品溶液；
(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，即得黄芪川芎提取物指纹图谱；其中，色谱条件为：色谱柱：Athena C18-WP色谱柱；柱温：25℃～40℃；检测波长：205nm～280nm；进样体积：10μl；流速：1ml·min-1；流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～15min：5％B→8％B，15～35min：8％B→14％B，35～70min：14％B→30％B，70～90min：30％B→50％B，90～105min：50％B→100％B。
通过对10个不同批次提取物的HPLC色谱图谱进行系统考察，发现各谱图峰8色谱峰的分离度好、含量高且稳定，理论塔板数不低于200000，因此选取峰8作为参照色谱峰(S)。通过计算、比对10个不同批次提取物的指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间，其中12个色谱峰确定为共有色谱峰。通过与对照品对照，确定了6个共有色谱峰的成分：峰6为阿魏酸，峰7为洋川芎内酯I，峰8为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰9为芒柄花苷，峰11为毛蕊异黄酮，峰12为芒柄花素。
7.精密度试验
取提取物供试品溶液，连续进样6次，考察色谱峰的相对保留时间、相对峰面积比值的一致性，从而考察仪器的精密度，试验结果如表1.2所示。结果表明，各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD值均在2％以内，表明仪器的精密度良好。
表1黄芪川芎提取物指纹图谱方法学考察精密度试验结果(相对保留时间)
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) |
| 峰1 | 0.1417 | 0.1411 | 0.1407 | 0.1414 | 0.1409 | 0.1404 | 0.329 |
| 峰2 | 0.1955 | 0.1951 | 0.1952 | 0.1959 | 0.1954 | 0.1952 | 0.160 |
| 峰3 | 0.2631 | 0.2626 | 0.2628 | 0.2641 | 0.2631 | 0.2625 | 0.219 |
| 峰4 | 0.3313 | 0.3306 | 0.3310 | 0.3324 | 0.3315 | 0.3309 | 0.186 |
| 峰5 | 0.5544 | 0.5542 | 0.5543 | 0.5557 | 0.5548 | 0.5545 | 0.102 |
| 峰6 | 0.8324 | 0.8329 | 0.8326 | 0.8332 | 0.8326 | 0.8325 | 0.037 |
| 峰7 | 0.9434 | 0.9436 | 0.9434 | 0.9438 | 0.9435 | 0.9434 | 0.015 |
| 峰8 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.000 |
| 峰9 | 1.0499 | 1.0498 | 1.0503 | 1.0496 | 1.0499 | 1.0500 | 0.023 |
| 峰10 | 1.0649 | 1.0646 | 1.0658 | 1.0644 | 1.0650 | 1.0651 | 0.047 |
| 峰11 | 1.2039 | 1.2039 | 1.2054 | 1.2031 | 1.2043 | 1.2047 | 0.065 |
| 峰12 | 1.4226 | 1.4226 | 1.4220 | 1.4215 | 1.4234 | 1.4237 | 0.059 |
表2黄芪川芎提取物指纹图谱方法学考察精密度试验结果(相对峰面积)
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) |
| 峰1 | 2.5784 | 2.5791 | 2.5521 | 2.5688 | 2.5522 | 2.5490 | 0.541 |
| 峰2 | 0.8114 | 0.8380 | 0.8368 | 0.8332 | 0.8403 | 0.8454 | 1.422 |
| 峰3 | 0.2095 | 0.2128 | 0.2143 | 0.2209 | 0.2168 | 0.2176 | 1.858 |
| 峰4 | 0.1804 | 0.1767 | 0.1752 | 0.1827 | 0.1763 | 0.1726 | 2.059 |
| 峰5 | 0.1184 | 0.1135 | 0.1155 | 0.1157 | 0.1163 | 0.1176 | 1.493 |
| 峰6 | 0.1638 | 0.1618 | 0.1641 | 0.1565 | 0.1661 | 0.1575 | 2.390 |
| 峰7 | 0.0464 | 0.0456 | 0.0458 | 0.0459 | 0.0472 | 0.0477 | 1.773 |
| 峰8 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.000 |
| 峰9 | 0.1898 | 0.1882 | 0.1934 | 0.1899 | 0.1895 | 0.1900 | 0.904 |
| 峰10 | 0.0404 | 0.0398 | 0.0393 | 0.0378 | 0.0402 | 0.0399 | 2.389 |
| 峰11 | 0.2881 | 0.2875 | 0.2850 | 0.2867 | 0.2861 | 0.2865 | 0.373 |
| 峰12 | 0.1012 | 0.0963 | 0.0957 | 0.0966 | 0.0965 | 0.0968 | 2.074 |
8.稳定性试验
取提取物供试品溶液，分别在0h、4h、8h、12h、16h、24h进行检测，以考察样品的稳定性，结果如表3、表4所示，。结果表明，各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD值均小于3％，说明样品溶液在24h内基本稳定。
表3黄芪川芎提取物指纹图谱方法学考察稳定性试验结果(相对保留时间)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) | |
| 峰1 | 0.1417 | 0.1394 | 0.1414 | 0.1417 | 0.1415 | 0.1409 | 0.626 |
| 峰2 | 0.1951 | 0.1949 | 0.1958 | 0.1948 | 0.1947 | 0.1954 | 0.223 |
| 峰3 | 0.2626 | 0.2617 | 0.2628 | 0.2629 | 0.2629 | 0.2633 | 0.197 |
| 峰4 | 0.3310 | 0.3296 | 0.3311 | 0.3309 | 0.3308 | 0.3316 | 0.206 |
| 峰5 | 0.5538 | 0.5532 | 0.5544 | 0.5540 | 0.5538 | 0.5554 | 0.132 |
| 峰6 | 0.8325 | 0.8323 | 0.8325 | 0.8326 | 0.8326 | 0.8332 | 0.035 |
| 峰7 | 0.9434 | 0.9433 | 0.9435 | 0.9434 | 0.9434 | 0.9435 | 0.008 |
| 峰8 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.000 |
| 峰9 | 1.0501 | 1.0502 | 1.0500 | 1.0499 | 1.0499 | 1.0499 | 0.012 |
| 峰10 | 1.0652 | 1.0652 | 1.0650 | 1.0649 | 1.0649 | 1.0653 | 0.017 |
| 峰11 | 1.2041 | 1.2046 | 1.2038 | 1.2032 | 1.2030 | 1.2073 | 0.129 |
| 峰12 | 1.4224 | 1.4236 | 1.4233 | 1.4221 | 1.4222 | 1.4254 | 0.088 |
表4黄芪川芎提取物指纹图谱方法学考察稳定性试验结果(相对峰面积)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) | |
| 峰1 | 2.8389 | 2.8396 | 2.7984 | 2.7790 | 2.7666 | 2.8909 | 1.645 |
| 峰2 | 0.8098 | 0.8403 | 0.8507 | 0.8398 | 0.8539 | 0.8168 | 2.154 |
| 峰3 | 0.2256 | 0.2347 | 0.2353 | 0.2306 | 0.2330 | 0.2377 | 1.829 |
| 峰4 | 0.1888 | 0.1827 | 0.1849 | 0.1850 | 0.1876 | 0.1960 | 2.486 |
| 峰5 | 0.1420 | 0.1406 | 0.1310 | 0.1389 | 0.1372 | 0.1378 | 2.787 |
| 峰6 | 0.1606 | 0.1584 | 0.1503 | 0.1507 | 0.1577 | 0.1570 | 2.745 |
| 峰7 | 0.0443 | 0.0435 | 0.0446 | 0.0460 | 0.0436 | 0.0428 | 2.476 |
| 峰8 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.000 |
| 峰9 | 0.1903 | 0.1916 | 0.1885 | 0.1894 | 0.1902 | 0.1851 | 1.192 |
| 峰10 | 0.0365 | 0.0376 | 0.0364 | 0.0359 | 0.0364 | 0.0385 | 2.634 |
| 峰11 | 0.2911 | 0.2910 | 0.2904 | 0.2905 | 0.2918 | 0.2950 | 0.587 |
| 峰12 | 0.0957 | 0.0959 | 0.1004 | 0.1017 | 0.1019 | 0.0998 | 2.792 |
9.重现性试验
取提取物供试品6份，分别制备供试品溶液并按照选定的色谱条件进行检测，结果见表5、表6所示。各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3％，表明重复性良好。
表5黄芪川芎提取物指纹图谱方法学考察重现性试验结果(相对保留时间)
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) |
| 峰1 | 0.1391 | 0.1413 | 0.1413 | 0.1413 | 0.1395 | 0.1408 | 0.721 |
| 峰2 | 0.1948 | 0.1956 | 0.1957 | 0.1952 | 0.1944 | 0.1954 | 0.258 |
| 峰3 | 0.2616 | 0.2627 | 0.2630 | 0.2622 | 0.2615 | 0.2624 | 0.220 |
| 峰4 | 0.3294 | 0.3311 | 0.3312 | 0.3303 | 0.3295 | 0.3305 | 0.236 |
| 峰5 | 0.5531 | 0.5544 | 0.5544 | 0.5536 | 0.5533 | 0.5541 | 0.103 |
| 峰6 | 0.8322 | 0.8324 | 0.8324 | 0.8324 | 0.8323 | 0.8322 | 0.013 |
| 峰7 | 0.9433 | 0.9434 | 0.9433 | 0.9434 | 0.9432 | 0.9431 | 0.012 |
| 峰8 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.000 |
| 峰9 | 1.0501 | 1.0500 | 1.0499 | 1.0500 | 1.0500 | 1.0499 | 0.008 |
| 峰10 | 1.0650 | 1.0650 | 1.0648 | 1.0650 | 1.0651 | 1.0659 | 0.038 |
| 峰11 | 1.2042 | 1.2035 | 1.2034 | 1.2033 | 1.2035 | 1.2089 | 0.182 |
| 峰12 | 1.4234 | 1.4229 | 1.4231 | 1.4228 | 1.4241 | 1.4255 | 0.073 |
表6黄芪川芎提取物指纹图谱方法学考察稳定性试验结果(相对峰面积)
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) |
| 峰1 | 2.9175 | 2.8814 | 2.8488 | 2.7707 | 2.8629 | 2.8731 | 1.716 |
| 峰2 | 0.8279 | 0.8434 | 0.8252 | 0.8860 | 0.8735 | 0.8425 | 2.910 |
| 峰3 | 0.2309 | 0.2210 | 0.2264 | 0.2195 | 0.2328 | 0.2307 | 2.450 |
| 峰4 | 0.1814 | 0.1836 | 0.1845 | 0.1816 | 0.1852 | 0.1952 | 2.746 |
| 峰5 | 0.1300 | 0.1214 | 0.1242 | 0.1279 | 0.1295 | 0.1294 | 2.758 |
| 峰6 | 0.1448 | 0.1480 | 0.1524 | 0.1472 | 0.1559 | 0.1495 | 2.662 |
| 峰7 | 0.0457 | 0.0449 | 0.0433 | 0.0432 | 0.0430 | 0.0453 | 2.730 |
| 峰8 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0220 | 1.0220 | 1.129 |
| 峰9 | 0.1882 | 0.1876 | 0.1886 | 0.1889 | 0.1961 | 0.1977 | 2.339 |
| 峰10 | 0.0368 | 0.0367 | 0.0367 | 0.0370 | 0.0389 | 0.0381 | 2.440 |
| 峰11 | 0.2897 | 0.2904 | 0.2911 | 0.2906 | 0.2990 | 0.3063 | 2.291 |
| 峰12 | 0.0998 | 0.1019 | 0.1010 | 0.1019 | 0.1033 | 0.1009 | 1.176 |
10.多个批次黄芪川芎提取物指纹图谱的相似度评价
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)对10个批次黄芪川芎提取物指纹图谱进行相似度计算，结果见表7。
表7黄芪川芎提取物指纹图谱相似度计算结果
Claims (8)
1.一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法，包括：
(1)取黄芪川芎提取物细粉，精密称定，加入甲醇，35KHz～60KHz超声提取30min，过滤，滤液挥干，残渣用乙醇溶解并定容，滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)取阿魏酸对照品、洋川芎内酯I对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、芒柄花苷对照品、毛蕊异黄酮对照品、芒柄花素对照品，精密称定，分别加入甲醇制成对照品溶液；
(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，即得黄芪川芎提取物指纹图谱；其中，色谱条件为：色谱柱：Athena C18-WP色谱柱；柱温：25℃～40℃；检测波长：205nm～280nm；进样体积：10μl；流速：1ml·min-1；流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～15min：5％B→8％B，15～35min：8％B→14％B，35～70min：14％B→30％B，70～90min：30％B→50％B，90～105min：50％B→100％B。
2.根据权利要求1所述的一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中的黄芪川芎提取物的获取方式为：黄芪、川芎经过水提取后减压浓缩和干燥后制得；或黄芪和川芎经过70％乙醇回流提取后，经回收乙醇，加压浓缩干燥后制得；或川芎提取挥发油后，其药渣与黄芪加水提取后减压浓缩干燥后制得；或黄芪、川芎经过水提取后减压浓缩至相对密度达1.08～1.16，加入乙醇使含醇量达70％静置过夜，回收乙醇，减压浓缩干燥后制得；或川芎提取挥发油后，其药渣与黄芪加水提取后减压浓缩至相对密度达1.08～1.16，加入乙醇使含醇量达70％静置过夜，回收乙醇，减压浓缩干燥后制得。
3.根据权利要求1所述的一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中的黄芪川芎提取物与甲醇的比例为1g:60ml；黄芪川芎提取物中川芎和黄芪的质量比为1:1～5。
4.根据权利要求1所述的一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中的微孔滤膜的孔径为0.22μm。
5.根据权利要求1所述的一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中的甲醇的体积百分数为90％～100％；步骤(1)中的乙醇的体积百分数为70％。
6.根据权利要求1所述的一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(2)中的对照品溶液具体为：每1ml中各含阿魏酸、洋川芎内酯、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素30～40ng的混合溶液。
7.根据权利要求1所述的一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(3)中的Athena C18-WP色谱柱规格为4.6mm×250mm，填料粒度大小为5μm。
8.根据权利要求1所述的一种黄芪川芎提取物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(3)中的黄芪川芎提取物指纹图谱中12个色谱峰被确定为共有色谱峰，通过与对照品保留时间的比较，确定峰6为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰7为阿魏酸，峰8为洋川芎内酯I，峰10为芒柄花苷，峰11为毛蕊异黄酮，峰12为芒柄花素。
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