CN102590423B - 川芎茶调颗粒制剂指纹图谱的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及川芎茶调颗粒制剂特征指纹图谱的测定方法，包括以下步骤：(a)川芎茶调制剂供试品的制备：精密称取川芎茶调制剂适量，加溶剂回流提取，提取液离心，上清液蒸发干燥，再用水溶解，然后用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70％甲醇溶解，用微孔滤膜滤过，即为供试品；(b)色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈；流动相B为0.01～0.2％甲酸水溶液，检测波长230～280nm；(c)测定：精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到川芎茶调制剂的特征指纹图谱。本发明川芎荼调制剂例如颗粒剂的HPLC特征指纹图谱分析方法操作简单，精密度高，重复性好，适用于川芎茶调制剂例如颗粒剂的质量控制。

Description

川芎茶调颗粒制剂指纹图谱的测定方法

技术领域

本发明属中药技术领域，涉及一种川芎荼调颗粒制剂指纹图谱的测定方法，具体地说是用高效液相色谱(HPLC)指纹图谱鉴别方法来测定川芎茶调颗粒制剂中特征成分的方法。

背景技术

川芎茶调颗粒原方出自于宋《太平惠民和剂局方》，具有疏风止痛作用，用于风邪头痛，或有恶寒、发热、鼻塞。此方主要由川芎、荆芥、防风、细辛、白芷、羌活、薄荷、甘草组成(参见，林晓兰.川芎茶调颗粒临床应用情况分析[J].北京中医，2004，23(3)：190-192)，其疗效确切。据信川芎茶调颗粒具有抗血小板凝聚，缓解小血管痉挛，改善心脑组织供血供氧，从而达到活血化瘀，活络通脉，疏风止痛之功效。可适用于血管性、神经性、紧张性、颈椎病等引起的各种头痛及偏头痛；适用于风寒感冒、恶寒、发热、鼻塞及鼻窦炎等病症。预防脑溢血发作，脑血栓形成以及改善脑血管疾病后遗症。

中国药典2010年版一部第472-274页分别收录了川芎茶调丸和川芎茶调散两种中药成方制剂，其配方为川芎120g、白芷60g、羌活60g、细辛30g、防风45g、荆芥120g、薄荷240g、甘草60g。川芎茶调丸是使各药材粉碎成细粉后混匀，用水泛丸制成；川芎茶调散则是使各药材粉碎成细粉后直接混匀即可。然而药典收载的两个制剂仅做TLC鉴别，并不作进一步的质量控制，例如并不作含量测定。

CN1739612A(中国专利申请号：200510032127.2，公开日：2006-03-01，发明名称：疏风止痛的中药制剂及其制备方法和质量控制方法)公开了用于疏风止痛的主要组成成分为川芎、白芷、羌活、细辛、防风、薄荷、荆芥、甘草的川芎荼调滴丸或微丸或微丸胶囊或胶囊或软胶囊，这些制剂的质量控制方法，包括用TLC法进行鉴别，用HPLC法以阿魏酸为指标进行含量测定。其中TLC法条件包括用硅胶G薄层板，以氯仿-石油醚(60～90℃)(8～9.5∶0.5～2)为展开剂，置紫外光灯(300-400nm)下检视供试品色谱中的荧光斑点。HPLC法的色谱条件是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以冰乙酸-甲醇-水(0.5～5∶30～50∶50～70)为流动相，检测波长为295～355nm，理论板数按阿魏酸峰计不低于2000，并以阿魏酸采用外标法进行定量。

中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance of Industv：BotanicalDrug(Draft).2000August)。随着研究的深入，人们发现，作为中医理论的实践产物，中药，尤其是复方中药，其中所含的任一成分都不能代表其整体疗效。人们逐渐认识到，现行的参照西药(合成药)质量控制模式的质量标准不能恰当地反映中药内在的质量。从现行单一指标性成分的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的质量控制方法的转化，已是发展的趋势。

中药现行的定量评价方法利用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分、活性成分或指标成分，而大多数品种仅有一般的检查项目。显然，这些质量标准的设置是模仿了化学药品的模式。其它国家如英国、印度、美国草药典、日本药局方中的汉药及德国Commission E编辑的德国草药专论等也采用了基本相同的内容。对于化学药品而言，其药效成分为结构清晰的单一化合物，构效关系明确，其有效成分含量和纯度可直接表达其安全及有效性。然而，中医用药的特点是复方配伍，任何单一的有效(活性)成分或指标成分的含量高低均不能表达其整体的疗效。例如，黄芪所含的黄芪甲苷(aastraga loside IV)是当前被选择为质量标准的鉴别和含量测定的最为常见的目标，但并没有依据证明黄芪甲苷与黄芪的功能主治的明确联系。同样，黄连、黄柏、三棵针均含小檗碱，一般都以它作为检测的目标，但是三者的功能主治却截然不同。复方制剂的情况就更加复杂。中医这种不是一对一的非线性的理论和实践说明中药质量应该采用某种宏观的综合的质量评价手段。

川芎荼调颗粒是由川芎等8种药材制成的颗粒剂，具有疏风止痛作用，用于风邪头痛，或有恶寒、发热、鼻塞，其治疗效果已经得到临床的验证，然而是否能够保证川芎茶调颗粒的质量，是决定川芎茶调颗粒疗效的基础。如果仅用一、二种有效成分来说明川芎茶调颗粒的内在质量，存在着中药质量控制的片面性，更不用说以无药效成分为质量控制了。因此，要控制川芎茶调颗粒的质量，只针对其一、二个化学成分进行表征和控制是不够的，必须对它的物质群整体从宏观上予以控制。所以，除了“微观分析”外，还应该用某种“宏观分析”方法，从整体上有效地表征中药质量。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已经得到国际公认。现在，对该品中阿魏酸、甘草酸等的测定方法较多，但如何能够从更宏观的角度采用指纹图谱鉴别方法，对川芎茶调颗粒中的各种化学组分进行控制却未见报道，也是本领域技术人员期待。

发明内容

本发明的目的是提供一种川芎茶调制剂特征指纹图谱的测定方法，通过此测定办法，可控制川芎茶调制剂质量。本发明人发现具有特定测定条件的测定方法可以有效的用于控制川芎茶调制剂质量。

为此，本发明第一方面提供了一种川芎茶调制剂特征指纹图谱的测定方法，其是照高效液相色谱法测定，包括以下步骤：

(a)川芎茶调制剂供试品的制备：精密称取川芎茶调制剂适量，加溶剂回流提取，提取液离心，上清液蒸发干燥，再用水溶解，然后用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70％甲醇溶解，用微孔滤膜滤过，即为供试品；

(b)色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈；流动相B为0.01～0.2％甲酸水溶液，检测波长230～280nm；

(c)测定：精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到川芎茶调制剂的特征指纹图谱。

在本发明中，所述“高效液相色谱法”的一般操作规范可以不作限定。在第一方面方法的一个实施方案中，所述的高效液相色谱法可以是记载于包括但不限于下列文件中的方法：中华人民共和国药典2010年版二部附录VD、中华人民共和国药典2010年版一部附录VID、中华人民共和国药典2005年版二部附录VD、中华人民共和国药典2005年版一部附录VID等。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，回流提取所用溶剂是20～80％乙醇，优选30～70％乙醇，例如40～60％乙醇，例如约50％乙醇。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，回流提取的时间为10～60分钟，例如20～40分钟，例如约30分钟。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述正丁醇是水饱和的正丁醇。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)为：精密称取样品5g，研细，精密加入25ml 50％乙醇溶液，加热回流30分钟，放冷，补重，摇匀，离心(例如10分钟，例如4000转/分钟)，吸取上清液10ml置蒸发皿中，蒸干，用5ml水溶解，分次用水饱和正丁醇萃取三次，每次25ml，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70％甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，用0.45μm微孔滤膜滤过，即为供试品。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，经微孔滤膜滤过后，所得供试品可以任选地根据需要作进一步的稀释。

根据本发明第一方面的方法，其中在进行步骤(a)操作时，还可以另外进行对照品溶液的配制的操作。在一个实施方案中，包括阿魏酸对照品溶液的制备步骤：精密称取阿魏酸对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含0.5mg的对照品溶液，摇匀，即得。在一个实施方案中，包括甘草酸铵对照品溶液的制备步骤：精密称取甘草酸铵对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含0.5mg的对照品溶液，摇匀，即得。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述色谱柱的长度为150mm～250mm，例如约150mm、200mm、250mm。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述色谱柱的柱径为4mm～5mm，例如约4.6mm。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述色谱柱填料的粒度为2～10μm，例如约5μm。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述流动相B为0.02～0.1％甲酸水溶液，优选约0.05％甲酸水溶液。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述检测波长240～270nm，优选250～260nm，优选约254nm。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述梯度洗脱程序为：

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	2-8	98-92
85	25-30	75-70
			100	42-48	58-52
105	48-52	52-48
			135	62-68	38-32

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述梯度洗脱程序为：

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	5	95
85	28	72
			100	45	55
105	50	50
			135	65	35

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，柱长250mm，柱径4.6mm，填料粒度5μm；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈；流动相B为0.05％甲酸水溶液；检测波长254nm；流速：1ml/min；柱温：20℃。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，柱长250mm，柱径4.6mm，填料粒度5μm；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈；流动相B为0.05％甲酸水溶液；

检测波长254nm；流速：1ml/min；柱温：20℃；所述梯度洗脱程序为：

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	5	95
85	28	72
			100	45	55
105	50	50
			135	65	35

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，还包括另外将阿魏酸对照品溶液注入液相色谱仪中的步骤。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，还包括另外将甘草酸铵对照品溶液注入液相色谱仪中的步骤。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，所述注入液相色谱仪中的试药体积为5～50μl，例如5～25μl，例如5～20μl，例如约10μl、约20μl。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，色谱图的记录时间为0min～200min，例如0～150min。

根据本发明第一方面的方法，其中以甘草酸铵的相对峰面积为100％计，相对峰面积大于3％的峰有22个，以甘草酸铵峰的相对保留时间Rt＝1.00计，各峰相对保留时间分别约为：

峰1	Rt＝0.11，	峰12	Rt＝0.65，
				峰2	Rt＝0.17，	峰13	Rt＝0.72，
峰3	Rt＝0.23，	峰14	Rt＝0.74，
				峰4	Rt＝0.26，	峰15	Rt＝0.75，
峰5	Rt＝0.30，	峰16	Rt＝0.79，
				峰6	Rt＝0.38，	峰17	Rt＝0.87，
峰7	Rt＝0.46，	峰18	Rt＝0.94，
				峰8	Rt＝0.47，	峰19	Rt＝0.98，
峰9	Rt＝0.49，	峰20	Rt＝1.00，
				峰10	Rt＝0.52，	峰21	Rt＝1.01，
峰11	Rt＝0.58，	峰22	Rt＝1.04。

根据本发明第一方面的方法，其中以甘草酸铵的相对峰面积为100％计，相对峰面积大于10％的峰至少有15个，以甘草酸铵峰的相对保留时间Rt＝1.00计，各峰相对保留时间分别约为：

峰2	Rt＝0.17，	峰12	Rt＝0.65，
				峰3	Rt＝0.23，	峰13	Rt＝0.72，
峰6	Rt＝0.38，	峰16	Rt＝0.79，
				峰8	Rt＝0.47，	峰18	Rt＝0.94，
峰9	Rt＝0.49，	峰19	Rt＝0.98，
				峰10	Rt＝0.52，	峰20	Rt＝1.00，
峰11	Rt＝0.58，	峰21	Rt＝1.01，
						峰22	Rt＝1.04。

根据本发明第一方面的方法，其中在描述色谱峰的相对保留时间时，用于修饰相对保留时间的修饰语“约”表示允许有±0.01的误差范围；然而本领域技术人员理解，对于短语“以甘草酸铵峰的相对保留时间Rt＝1.00计”则表示以甘草酸铵作为参照，对任一试样而言该对照品的相对保留时间均为Rt＝1.00，不存在上述±0.01的误差范围。

根据本发明第一方面的方法，其中所述川芎茶调制剂的原料药材组成包括：

川芎120重量份，白芷45～75重量份，

羌活45～75重量份，  甘草45～75重量份，

防风33～56重量份，  细辛22～38重量份，

薄荷180～300重量份，荆芥90～150重量份。

根据本发明第一方面的方法，其中所述川芎茶调制剂的原料药材组成包括：

川芎120重量份，     白芷48～72重量份，

羌活48～72重量份，  甘草48～72重量份，

防风36～54重量份，  细辛24～36重量份，

薄荷192～288重量份，荆芥96～144重量份。

根据本发明第一方面的方法，其中所述川芎茶调制剂的原料药材组成包括：

川芎120重量份，     白芷54～66重量份，

羌活54～66重量份，  甘草54～66重量份，

防风33～56重量份，  细辛27～33重量份，

薄荷216～264重量份，荆芥108～132重量份。

根据本发明第一方面的方法，其中所述川芎茶调制剂的原料药材组成包括：

川芎120重量份，  白芷60重量份，

羌活60重量份，   甘草60重量份，

防风45重量份，   细辛30重量份，

薄荷240重量份，  荆芥120重量份。

根据本发明第一方面的方法，其中所述川芎茶调制剂是由包括以下步骤的方法制备的：

(1)取川芎、白芷、羌活、细辛、防风、甘草，加水煎煮，煎液滤过，药液备用；

(2)薄荷、荆芥提取挥发油，备用；其水溶液滤过，滤液与步骤(1)所得药液合并；

(3)将步骤(2)所得合并药液，浓缩，干燥，制成浸膏粉；

(4)将步骤(2)所得挥发油均匀掺入到步骤(3)所得浸膏粉中，再任选地均匀掺入药学可接受的辅料，制成制剂，即得。

在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(1)中，每次煎煮所用水量为所煎药材总重量的5～15倍，优选5～12倍，例如6～10倍。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(1)中，煎煮次数为1～4次，优选1～3次，例如1或2次，优选2次。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(1)中，每次煎煮所用时间为0.5～5小时，优选1～3小时，例如1、1.5、2和/或3小时。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(1)中，煎煮2次，第一次加8倍量水煎煮1.5小时，第二次加6倍量水煎煮1小时，合并煎液。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(2)中，所得合并滤液可以经粗滤后进入下一步工序。粗滤器材可以是普通的滤器，例如、或过滤网等。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(3)所得浓缩液的相对密度为1.05～1.4(80℃)，优选1.1～1.3(80℃)，优选1.15～1.25(80℃)。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，其中步骤(4)中，所述均匀掺入是通过将挥发油喷雾到浸膏粉中并混合均匀来进行的。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(3)中的浓缩是高温减压除溶剂的方式，或者是膜过滤的方式。

根据本发明第一方面的方法，其中所述制剂选自颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、散剂等。

本发明第二方面提供了一种川芎茶调制剂，该制剂的原料药材组成包括：

川芎120重量份，     白芷45～75重量份，

羌活45～75重量份，  甘草45～75重量份，

防风33～56重量份，  细辛22～38重量份，

薄荷180～300重量份，荆芥90～150重量份；

并且该制剂按照本发明第一方面任一实施方案所述的方法测试，具有以下特征的指纹图谱：以甘草酸铵的相对峰面积为100％计，相对峰面积大于3％的峰有22个，以甘草酸铵峰的相对保留时间Rt＝1.00计，各峰相对保留时间分别约为：

峰1	Rt＝0.11，	峰12	Rt＝0.65，
				峰2	Rt＝0.17，	峰13	Rt＝0.72，
峰3	Rt＝0.23，	峰14	Rt＝0.74，
				峰4	Rt＝0.26，	峰15	Rt＝0.75，
峰5	Rt＝0.30，	峰16	Rt＝0.79，
				峰6	Rt＝0.38，	峰17	Rt＝0.87，
峰7	Rt＝0.46，	峰18	Rt＝0.94，
				峰8	Rt＝0.47，	峰19	Rt＝0.98，
峰9	Rt＝0.49，	峰20	Rt＝1.00，
				峰10	Rt＝0.52，	峰21	Rt＝1.01，
峰11	Rt＝0.58，	峰22	Rt＝1.04。

根据本发明第二方面的川芎茶调制剂，其按照本发明第一方面任一实施方案所述的方法测试，具有以下特征的指纹图谱：以甘草酸铵的相对峰面积为100％计，相对峰面积大于10％的峰至少有15个，以甘草酸铵峰的相对保留时间Rt＝1.00计，各峰相对保留时间分别约为：

峰2	Rt＝0.17，	峰12	Rt＝0.65，
				峰3	Rt＝0.23，	峰13	Rt＝0.72，
峰6	Rt＝0.38，	峰16	Rt＝0.79，
				峰8	Rt＝0.47，	峰18	Rt＝0.94，
峰9	Rt＝0.49，	峰19	Rt＝0.98，
				峰10	Rt＝0.52，	峰20	Rt＝1.00，
峰11	Rt＝0.58，	峰21	Rt＝1.01，
						峰22	Rt＝1.04。

根据本发明第二方面的川芎茶调制剂，其中在描述色谱峰的相对保留时间时，用于修饰相对保留时间的修饰语“约”表示允许有±0.01的误差范围；然而本领域技术人员理解，对于短语“以甘草酸铵峰的相对保留时间Rt＝1.00计”则表示以甘草酸铵作为参照，对本色谱图中任一特征指纹峰而言，该对照品的相对保留时间均为Rt＝1.00，不存在上述±0.01的误差范围。

根据本发明第二方面的川芎茶调制剂，其原料药材组成包括：

川芎120重量份，     白芷45～75重量份，

羌活45～75重量份，  甘草45～75重量份，

防风33～56重量份，  细辛22～38重量份，

薄荷180～300重量份，荆芥90～150重量份。

根据本发明第二方面的川芎茶调制剂，其原料药材组成包括：

川芎120重量份，     白芷48～72重量份，

羌活48～72重量份，  甘草48～72重量份，

防风36～54重量份，  细辛24～36重量份，

薄荷192～288重量份，荆芥96～144重量份。

根据本发明第二方面的川芎茶调制剂，其原料药材组成包括：

川芎120重量份，     白芷54～66重量份，

羌活54～66重量份，  甘草54～66重量份，

防风33～56重量份，  细辛27～33重量份，

薄荷216～264重量份，荆芥108～132重量份。

根据本发明第二方面的川芎茶调制剂，其原料药材组成包括：

川芎120重量份，    白芷60重量份，

羌活60重量份，     甘草60重量份，

防风45重量份，     细辛30重量份，

薄荷240重量份，    荆芥120重量份。

根据本发明第二方面的川芎茶调制剂，其是由包括以下步骤的方法制备的：

(1)取川芎、白芷、羌活、细辛、防风、甘草，加水煎煮，煎液滤过，药液备周；

(2)薄荷、荆芥提取挥发油，备用；其水溶液滤过，滤液与步骤(1)所得药液合并；

(3)将步骤(2)所得合并药液，浓缩，干燥，制成浸膏粉；

(4)将步骤(2)所得挥发油均匀掺入到步骤(3)所得浸膏粉中，再任选地均匀掺入药学可接受的辅料，制成制剂，即得。

在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(1)中，每次煎煮所用水量为所煎药材总重量的5～15倍，优选5～12倍，例如6～10倍。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(1)中，煎煮次数为1～4次，优选1～3次，例如1或2次，优选2次。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(1)中，每次煎煮所用时间为0.5～5小时，优选1～3小时，例如1、1.5、2和/或3小时。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(1)中，煎煮2次，第一次加8倍量水煎煮1.5小时，第二次加6倍量水煎煮1小时，合并煎液。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(2)中，所得合并滤液可以经粗滤后进入下一步工序。粗滤器材可以是普通的滤器，例如普通滤纸、或过滤网等。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(3)所得浓缩液的相对密度为1.05～1.4(80℃)，优选1.1～1.3(80℃)，优选1.15～1.25(80℃)。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，其中步骤(4)中，所述均匀掺入是通过将挥发油喷雾到浸膏粉中并混合均匀来进行的。在以上川芎茶调制剂制备方法的一个实施方案中，所述步骤(3)中的浓缩是高温减压除溶剂的方式，或者是膜过滤的方式。

根据本发明第二方面的川芎茶调制剂，其中所述制剂选自颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、散剂等。

本发明任一方面的任一实施方案中的任一技术特征可以与该方面的其它实施方案组合，或者可以与其它方面的任一实施方案组合，只要这种组合不会出现矛盾。本发明引用的全部文献通过引用并入本文。

目前，川芎茶调颗粒未见指纹图谱方面的研究报道，川芎茶调颗粒的质量控制方面的研究文献报道也较匮乏。因中药指纹图谱技术现已成为评价中药质量的有效手段(罗国安，梁琼麟，王义明.中药指纹图谱[M].北京：化学工业出版社，2009：1)，本文通过建立川芎茶调颗粒HPLC特征指纹图谱，以此方法对川芎茶调颗粒进行质量评价，为保证川芎茶调颗粒的质量稳定、均一、可控提供研究依据。

本发明的目的在于建立川芎荼调制剂例如颗粒剂的HPLC特征指纹图谱，提升其质量控制标准，确保川芎荼调颗粒质量稳定、均一、可控。在一个特别的的实施方案中，本发明方法包括如下特征：使用Diamonisil钻石C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，乙腈-0.05％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长254nm。据此方法，本发明建立了川芎茶调颗粒HPLC特征指纹图谱的鉴别方法，得到22个共有峰。根据本发明方法，川芎荼调制剂例如颗粒剂的HPLC特征指纹图谱分析方法操作简单，精密度高，重复性好，适用于川芎荼调颗粒的质量控制。

附图说明

图1显示了川芎茶调颗粒的HPLC指纹图谱。

图2显示了10批次川芎茶调颗粒指纹图谱。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

在本发明中使用到的一些测试仪器与试药包括：Agilent1100高效液相色谱仪(四元梯度泵、自动进样器、DAD检测器、Chemstation色谱工作站)，80-2台式低速离心机，AG135型电子天平(梅特勒-托利多公司)，甘草酸铵(购自中国药品生物制品检定所，批号110731-201116)，阿魏酸(购自中国药品生物制品检定所，批号110773-200611)。以下试验中，涉及重量份时，如未另外说明，每一重量份单位为0.1kg。以下制备例和对照制备例中，如未另外说明，提取物的收率均在18.37～21.71％(以药材总重量为基础)之间。

A、制备川芎茶调制剂的提取物

制备例1：制备提取物

原料药材组成：

川芎120重量份，    白芷60重量份，

羌活60重量份，     甘草60重量份，

防风45重量份，     细辛30重量份，

薄荷240重量份，    荆芥120重量份。

制法：(1)取川芎、白芷、羌活、细辛、防风、甘草，加水煎煮，煎液滤过，药液备用；(2)薄荷、荆芥提取挥发油，备用；其水溶液滤过，滤液与步骤(1)所得药液合并；(3)将步骤(2)所得合并药液，浓缩，干燥，制成浸膏粉；(4)将步骤(2)所得挥发油以喷雾的方式均匀掺入到步骤(3)所得浸膏粉中，得到可用于制剂制备用的提取物(该提取物可以直接作为制剂，亦可均匀掺入药学可接受的辅料后再制成制剂)。

其中：步骤(1)中，水煎煮2次，第一次用药材8倍量水煎1.5小时，第二次用药材6倍量水煎1小时；步骤(3)中在70-80℃下减压浓缩至相对密度为1.22(80℃)。

制备例2：制备不包括挥发油的提取物

原料药材组成：

川芎120重量份，    白芷45重量份，

羌活45重量份，     甘草75重量份，

防风33重量份，     细辛38重量份，

薄荷300重量份，    荆芥90重量份。

制法：基本上与制备例1相同，不同之处是：步骤(1)中，水煎煮2次，第一次用药材6倍量水煎1.5小时，第二次用药材6倍量水煎1.5小时。

制备例3：制备不包括挥发油的提取物

原料药材组成：

川芎120重量份，   白芷75重量份，

羌活75重量份，    甘草45重量份，

防风56重量份，    细辛22重量份，

薄荷180重量份，   荆芥150重量份。

制法：基本上与制备例1相同，不同之处是：步骤(1)中，水煎煮1次，用药材10倍量水煎3小时。

制备例4：制备不包括挥发油的提取物

原料药材组成：

川芎120重量份，   白芷48重量份，

羌活72重量份，    甘草48重量份，

防风36重量份，    细辛36重量份，

薄荷288重量份，   荆芥96重量份。

制法：基本上与制备例1相同，不同之处是：步骤(1)中，水煎煮3次，第一次用药材6倍量水煎1.5小时，第二次用药材6倍量水煎1.5小时，第三次用药材6倍量水煎0.5小时。

制备例5：制备不包括挥发油的提取物

原料药材组成：

川芎120重量份，    白芷72重量份，

羌活48重量份，    甘草72重量份，

防风54重量份，    细辛24重量份，

薄荷192重量份，   荆芥144重量份。

制法：基本上与制备例1相同，不同之处是：步骤(1)中，水煎煮2次，第一次用药材12倍量水煎1.5小时，第二次用药材6倍量水煎1小时；步骤(3)中的浓缩使用有机膜SMN-130A2350054，过滤温度38℃，过滤压力20bar，纳滤浓缩液相对密度为1.36(36℃)，膜清洗剂是1％多聚磷酸钠。

B、制备川芎茶调制剂

制剂例1：制备川芎茶调颗粒

取制备例1所得提取物，加入等量蔗糖粉，混合均匀，用75％乙醇制软材、制粒，干燥，即得川芎茶调颗粒。

制剂例2：制备川芎茶调片剂、胶囊剂

取制备例2所得提取物，加入提取物1/4量的乳糖和提取物1/4量的微晶纤维素，混合均匀，用75％乙醇制软材、制粒，干燥。干颗粒压片，即得川芎茶调片；干颗粒装胶囊，得硬胶囊。

制剂例3：制备川芎茶调软胶囊剂

取制备例3所得提取物，混入到等量的大豆油中，按常规工艺将悬浮药液包裹到软胶囊中，得软胶囊剂。

制剂例4：制备川芎茶调散剂

取制备例4所得提取物，研成细粉，得到散剂。

制剂例5：制备川芎茶调散剂

取制备例5所得提取物，研成细粉，得到散剂。

C、制剂指纹图谱的测试

1、试药：

以制剂例1的方法制备得到的10个生产批次的川芎茶调颗粒，其编号和对应批号如下：

下文试验中，未特别注明是使用哪一批次时，指的是使用S1批次。

2、指纹图谱的测试方法：

色谱条件：Diamonisil(R)钻石C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：A：乙腈，B：0.05％甲酸溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长：254nm；流速：1ml/min；柱温：20C。

表1：洗脱程序表

时间(min)	乙腈(％)	0.05％甲酸(％)
			0	5	95
85	28	72
			100	45	55
105	50	50
			135	65	35

供试品溶液的制备：精密称取供试样品5g，研细，精密加入25ml 50％乙醇溶液，加热加热回流30分钟，放冷，补重，摇匀，离心10分钟(4000转/分钟)，吸取上清液10ml置蒸发皿中，蒸干，用5ml水溶解，分次用水饱和正丁醇萃取三次，每次25ml，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70％甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，用45μm微孔滤膜滤过，即得。

对照品溶液的制备精密称取阿魏酸对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含0.5mg的对照品溶液，摇匀，即得阿魏酸对照品溶液。另同法制备甘草酸铵对照品溶液。

3、方法学考察

精密度试验：精密吸取同一批次(S1)供试品溶液20μL，按照上述色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。结果表明，各特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3％，相似度均大于0.99，说明仪器精密度好。

稳定性试验：精密吸取同一批次(S1)供试品溶液20μL，按照上述色谱条件，分别于0、6、12、18、24、36、48h测定，记录色谱图。不同时间段各特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3％，相似度均大于0.99，结果表明，供试品溶液在48h内样品溶液的成分稳定。

重现性试验：分别精密量取同一样品(S1)6份，按供试品溶液方法制备，分别进样，记录色谱图。结果表明，各特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3％，相似度均大于0.99，表明该方法重现性好。

指纹图谱的建立：分别取10批次的川芎茶调颗粒，按供试品溶液方法制备，精密吸取供试品溶液20μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行检测，记录135min的色谱图。

4、指纹图谱的分析

共有峰的标定：比较10批次样品的色谱图，标定22个色谱峰为共有峰，见图1。其中20号峰为川芎茶调颗粒颗粒参比成分甘草酸铵峰，该峰吸收强，峰面积大，故选此峰作为参考峰。共有峰相对保留时间见表2，共有峰相对峰面积见表3。

表2：10批川芎荼调颗粒共有峰的相对保留时间

表3：10批川芎茶调颗粒共有峰的相对峰面积

相似度评价：应用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件2004版(国家药典委员会编)计算10批样品的相似度，结果，10批次相似度均大于0.9，10批次川芎茶调颗粒指纹图谱见图2，相似度结果见表4。

表4：10批次川芎茶调颗粒相似度

编号	相似度	编号	相似度
				S1	0.982	S6	0.989
S2	0.995	S7	0.993
				S3	0.988	S8	0.991
S4	0.981	S9	0.952
				S5	0.915	S10	0.969

此外，发明人还对制剂例2-5的四种制剂照上文“C、制剂指纹图谱的测试”中记载的方法进行其指纹图谱的测试，结果显示这四种制剂的HPLC特征色谱图与S1样品的特征色谱图在特征峰数量、相对保留时间方面吻合，只是峰面积略有差异。

此外，本发明人考察了50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇、50％甲醇、70％甲醇以及100％甲醇的提取溶剂的提取效率，结果发现50％乙醇提取出峰数量多，吸收较强，故选择作为提取溶剂。本领域技术人员清楚，事实上40～60％乙醇均可作为提取溶剂。回流提取与超声提取的效率基本相同，但回流提取的谱图中某些峰的响应值略高，且实验过程中发现，回流提取的样品较稳定，故选择回流提取为本发明的提取方法。另外，发明人考察不同波长下的指纹图谱，结果显示在254nm处出峰数多，分离度高，故优选用254nm为检测波长。本领域技术人员清楚，事实上230～280nm范围内的任一波长均可作为检测波长。此外，本发明人考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05％甲酸、甲醇-0.02％磷酸、乙腈-0.02％磷酸、乙腈-0.02％磷酸、乙腈-0.02％三乙胺，结果显示在乙腈-0.05％甲酸(梯度洗脱)流动相条件下，各个特征色谱峰分离度较好，且基线平稳，故选择乙腈-0.05％甲酸的洗脱程序为流动相系统。

通过10批次川芎荼调颗粒指纹图谱可以看出，其相似度均大于0.9，证明同一生产方法获得的不同批次的川芎茶调颗粒质量稳定，为川芎茶调颗粒质量控制水平的提升奠定了基础。

Claims (9)

1.川芎茶调制剂特征指纹图谱的测定方法，所述川芎茶调制剂的原料药材组成为：

该方法是照高效液相色谱法测定，包括以下步骤：

(a)川芎茶调制剂供试品的制备：精密称取川芎茶调制剂适量，加溶剂回流提取，提取液离心，离心上清液蒸发干燥，再用水溶解，然后用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70%甲醇溶解，用微孔滤膜滤过，即为供试品；另外，照以下步骤配制甘草酸铵对照品溶液：精密称取甘草酸铵对照品适量，加70%甲醇制成每1ml含0.5mg的对照品溶液，摇匀，即得；

(b)色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈；流动相B为0.05%甲酸水溶液，检测波长230～280nm；所述梯度洗脱的程序为：0～85min，5%～28%A；85～100min，28%～45%A；100～105min，45%～50%A；105～135min，50%～65%A；

(c)测定：精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到川芎茶调制剂的特征指纹图谱；另将甘草酸铵对照品溶液注入液相色谱仪，得到甘草酸铵对照图谱；

在得到的川芎茶调制剂的特征指纹图谱中，以甘草酸铵的相对峰面积为100%计，相对峰面积大于3%的峰有22个，以甘草酸铵峰的相对保留时间Rt=1.00计，各峰相对保留时间分别为：

2.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤(a)中：回流提取所用溶剂是20～80%乙醇。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤(a)中：回流提取的时间为10～60分钟。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤(a)中：正丁醇是水饱和的正丁醇。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)为：精密称取样品5g，研细，精密加入25ml 50%乙醇溶液，加热回流30分钟，放冷，补重，摇匀，离心，吸取上清液10ml置蒸发皿中，蒸干，用5ml水溶解，分次用水饱和正丁醇萃取三次，每次25ml，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70%甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，用0.45μm微孔滤膜滤过，即为供试品。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于步骤(b)中：色谱柱的长度为200mm～300mm、色谱柱的柱径为4mm～5mm、色谱柱填料的粒度为2～10μm、检测波长240～270nm。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)中，所述色谱条件为：色谱柱柱长250mm，柱径4.6mm，填料粒度5μm；检测波长254nm；流速：1ml/min；柱温：20℃。

8.根据权利要求1的方法，其中所述川芎茶调制剂是由包括以下步骤的方法制备的：

(1)取川芎、白芷、羌活、细辛、防风、甘草，加水煎煮，煎液滤过，药液备用；

(2)薄荷、荆芥提取挥发油，备用；其水溶液滤过，滤液与步骤(1)所得药液合并；

(3)将步骤(2)所得合并药液，浓缩，干燥，制成浸膏粉；

(4)将步骤(2)所得挥发油均匀掺入到步骤(3)所得浸膏粉中，再任选地均匀掺入药学可接受的辅料，制成制剂，即得。

9.根据权利要求8的方法，其中所述制剂选自颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、散剂。

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