CN108459129B - 一种防己茯苓汤组合物的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了防己茯苓汤组合物的质量控制方法，属于中药分析领域。本发明方法采用高效液相色谱法建立指纹图谱，色谱条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流速：0.8ml/min～1.2ml/min；柱温：20℃～35℃；检测仪器采用紫外检测器，指纹图谱的检测波长237nm；理论塔板数以甘草酸峰计算不低于5000；参照物溶液为甘草酸溶液；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸+0.2％三乙胺溶液为流动相B，按如下顺序进行梯度洗脱：

Description

一种防己茯苓汤组合物的质量控制方法

技术领域

本发明属于中药分析领域，涉及一种中药复方颗粒质量标准检测方法，特别涉及一种防己茯苓汤组合物的质量控制方法。

背景技术

中药汤剂是临床用药的主流，但因起煎煮、携带不方便，煎煮制备的汤剂质量往往因人、因煎煮器具而存在较大差异，而经典名方临床疗效确切，因简、便、验、廉而深受广大消费者喜爱，运用现代科学技术将经典名方开发成携带方便、便于服用的中药制剂，不仅是对中医药的传承，也是更好地促进经典名方的临床应用。颗粒剂制备工艺相对简单、易于赋形，服用、携带方便，在服用形式上与传统汤剂最为一致，能较大限度的保持传统汤剂的特点，因此以汤剂形式服用的经典名方选择颗粒剂最为适宜。颗粒剂的开发应遵循“原汁原味”的原则，在现有技术条件下，首先通过研究制备明确煎煮参数的标准(基准)汤剂，对基准汤剂的关键质量属性进行研究，主要以单处方基准汤剂的固含量(干膏率)、指纹图谱、多指标成分作为质量参比，指导颗粒的研制。研究中为减少不同来源的饮片存在的质量差异对一致性研究带来影响，选择随行对照的方式，采用同一批次的饮片，煎煮至少10份基准汤剂，以其关键质量的均值作为颗粒剂制备工艺参数研制的“基准”。

防己茯苓汤出自《金匮要略》，该方由防己、茯苓、黄芪、桂枝、甘草组成。具有利水消肿、益气通阳的功效，主治脾气虚弱、阳气不足、水溢肌肤之皮水、水肿较甚。防己茯苓汤目前临床效果较好，应用于治疗各种水肿，均收到满意效果。作为中药复方，防己茯苓汤由五味药味组成，有相对规定性的加工方法和使用方法，其所含化学成分相对复杂、药理作用具有多靶点多层次的特点，且干扰因素众多，因此研究难度颇大，生产上难以做到精确稳定可控。而目前中药复方制剂领域在含量控制上基本只有一个或两个指标性成分，质量控制单一，指标少，难以全面反映防己茯苓汤产品的质量状况，且现有技术中并未见任何相关防己茯苓汤全面质量控制方法的报道，因此目前本领域亟需一种防己茯苓汤组合物的质量控制的方法。本发明采用指纹图谱技术，结合含量指标及薄层鉴别对防己茯苓汤组合物质量进行全面控制。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的中药复方制剂在含量控制上基本只有一个或两个指标性成分，质量控制单一，指标少，存在难以全面反映药味多、组分多、靶标多的防己茯苓汤组合物的质量状况的缺陷，从而提供防己茯苓汤组合物的质量控制方法。

为此，本发明提供如下技术方案：

防己茯苓汤组合物的质量控制方法，包括采用高效液相色谱法建立防己茯苓汤组合物指纹图谱，色谱条件为：

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流速0.8ml/min～1.2ml/min；柱温：20℃～35℃；

检测仪器采用紫外检测器，指纹图谱的检测波长237nm；

理论塔板数以甘草酸峰计算不低于5000；

参照物溶液为甘草酸溶液；

流动相以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸+0.2％三乙胺溶液为流动相B，按如下顺序进行梯度洗脱：

所述指纹图谱包括10个共有峰，各峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：1号峰相对保留时间RRT为0.345，2号峰相对保留时间RRT为0.431，3号峰相对保留时间RRT为0.478，4号峰相对保留时间RRT为0.489，5号峰相对保留时间RRT为0.514，6号峰相对保留时间RRT为0.585，7号峰相对保留时间RRT为0.786，8号峰相对保留时间RRT为0.808，9号峰相对保留时间RRT为0.840，10号S峰是参照物的色谱峰。

所述防己茯苓汤组合物是通过如下方法制备得到：

防己3份，黄芪3份，桂枝3份g，茯苓6份，甘草2份，以上五味，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(40℃)的清膏，加麦芽糊精适量，混匀，干燥，制粒，即得防己茯苓汤组合物。

测定防己茯苓汤组合物指纹图谱时的供试品溶液与参照物溶液按如下方法制备：

(1)供试品溶液的制备：防己茯苓汤组合物，研细，精密称取0.5g～2.0g，加10ml～40ml稀乙醇，称定重量，超声10min～30min，放冷，以稀乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

(2)参照物溶液的制备：取甘草酸对照品适量，加甲醇制成1体积份含0.001重量份的对照品储备液，再加20％流动相A-80％流动相B稀释至1体积份含0.0003重量份。

进样量为10μl～20μl，所述指纹图谱的检测波长为237nm。

还包括用高效液相色谱法测定防己茯苓汤组合物中防己诺林碱、粉防己碱、甘草酸、甘草苷、肉桂酸的含量，其中色谱条件为：

(1)防己诺林碱、粉防己碱、甘草酸、甘草苷含量测定的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：25℃～30℃；流速：0.8ml/min～1.0ml/min；检测波长为237nm。理论板数按甘草酸峰计算应不低于5000。以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸+0.4％三乙胺溶液为流动相B，按如下顺序梯度洗脱。

(2)测定防己茯苓汤组合物中肉桂酸的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸(30:70)为流动相；流速：0.8ml/min～1.2ml/min；柱温：25℃～35℃；检测波长为280nm；理论板数按肉桂酸峰计算不低于5000。

采用高效液相色谱法测定防己茯苓汤组合物中防己诺林碱、粉防己碱、甘草酸、甘草苷、肉桂酸含量时的供试品溶液制备方法如下：

防己茯苓汤组合物，研细，精密称取0.5g～2.0g，加10ml～40ml稀乙醇，称定重量，超声10min～30min，放冷，以稀乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

测定防己诺林碱、粉防己碱、甘草酸、甘草苷、肉桂酸含量时的进样量均为10μl～20μl。

还包括采用薄层色谱法鉴别防己茯苓汤组合物中的防己、甘草、黄芪、桂枝。

(1)防己鉴别：取待鉴别的组合物适量，研细，称取2g～4g，加氨试液30ml～60ml，超声10min～30min，滤过，滤液加60ml～120ml水饱和正丁醇萃取，分取正丁醇层，减压蒸干，以甲醇1ml～5ml溶解，滤过，即得供试品溶液。另取防己对照药材0.2g～1g，同法制得对照药材溶液。再取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg～2mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各4μl～8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮-甲醇-5％浓氨试液为展开剂，于湿度低于70％环境下展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)甘草、黄芪鉴别：取待鉴别的组合物适量，研细，称取1g～5g，加甲醇25ml～75ml超声20min～40min，滤过，滤液减压蒸干，残渣加氨试液10ml～30ml超声助溶，放置30分钟后，减压蒸干，残渣再以10ml～20ml水超声助溶，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为15cm)，以水50ml～150ml洗脱，弃去水液，再用30％～50％乙醇60ml～100ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％～90％乙醇50ml-100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml-5ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材0.2g～0.8g、黄芪对照药材1g～4g，同法制备对照药材溶液。再取黄芪甲苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加甲醇制成每1ml各含0.3mg～0.8mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述供试品、对照药材溶液及对照品溶液各5μl～9μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，使呈条带状；以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm下检视，供试品中在与甘草对照药材及甘草苷、甘草酸色谱相应的位置上，显相同的暗斑；再喷以5％～10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与黄芪对照药材及黄芪甲苷色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，在与甘草对照药材及甘草苷色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点。

(3)桂枝鉴别：取待鉴别的组合物适量，研细，称取1g～5g，加乙醇10ml～30ml超声20min～50min，滤过，作为供试品溶液。另取桂枝对照药材0.2g～1g，同法制备对照药材溶液。再取肉桂酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg～0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述供试品溶液5μl～12μl，分别点于同硅胶GF₂₅₄薄层板上；以环己烷-乙酸乙酯-冰乙酸为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm下检视，供试品色谱中在与对照药材色谱及肉桂酸色谱相应的位置上，显相同的暗斑。

防己茯苓汤组合物中防己、甘草、黄芪、桂枝鉴别时的点样量为4μl～12μl。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的质量控制方法中的指纹图谱全面反映出防己茯苓汤组合物质量信息，从而能够达到更加全面、有效地控制防己茯苓汤组合物制剂产品质量的目的。

2.本发明提供的防己茯苓汤组合物的质量控制方法采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所测指纹图谱的辨认，操作方便、快捷；而且，以此得出的相以度结果对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。

3.本发明提供的防己茯苓汤组合物的质量控制方法经过对供试品制备方法的考察及测定指纹图谱的仪器、色谱柱、流动相、检测波长等条件进行系统的优选，建立了指纹图谱测定条件并进行了方法学考察，在对多批本中药组合物指纹图谱检测结果的基础上，逐渐积累数据，提出了标准指纹图谱，作为本品指纹图谱标准，从而达到能够更全面、有效地控制制剂质量的目的。

4.本发明提供的防己茯苓汤组合物的质量控制方法采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统作为本中药组合物指纹图谱相似度计算软件，经多次试验研究，通过与计算相对保留时间及相对峰面积的方法相比较，所得出的评价结论基本一致，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。

5.本发明提供的防己茯苓汤组合物的质量控制方法采用指纹图谱较全面的表征组合物的质量信息，从整体上反映产品质量；同时针对处方三味药材，建立含量控制指标，供试品溶液的制备方法简单、便捷，且测定结果准确、可靠；建立处方中四味药材的薄层鉴别方法，方法专属性良好，重现性高。本发明考虑目前现有技术在控制复方中成药上往往只有一个或两个指标性成分，且缺乏指纹图谱整体表征产品质量信息，因此提出以指纹图谱结合多指标成分含量控制及薄层鉴别等方法全面的控制防己茯苓汤组合物质量。

6.本发明提供的防己茯苓汤组合物的质量控制方法通过综合薄层色谱法、含量测定法、指纹图谱等方法对防己茯苓汤组合物进行全方位多维度质量控制，做到在研究、生产的过程中更简便、快捷、全面的对防己茯苓汤组合物进行多方位质量控制。

7.本发明提供的防己茯苓汤组合物的质量控制方法-含量测定法中，对于多指标成分，如甘草酸、甘草苷、防己诺林碱、粉防己碱等成分，可做到单次进样即可得到多个成分的含量信息，更快捷，更简便，减少溶剂等成本及时间上的浪费。

8.本发明提供的防己茯苓汤组合物的质量控制方法-薄层色谱法中，本专利可采用一种方法同时鉴别多种成分，如对于防己茯苓汤组合物中的黄芪、甘草的鉴别，都可实现一次鉴别操作直接得出结果。

9.本发明提供的防己茯苓汤组合物的质量控制方法可以为防己茯苓汤组合物提供一种较全面的质量控制方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为防己茯苓汤组合物供试品指纹图谱精密度考察叠加图；

图2为防己茯苓汤组合物供试品指纹图谱稳定性考察叠加图；

图3为防己茯苓汤组合物供试品指纹图谱重复性考察叠加图；

图4为防己茯苓汤组合物指纹图谱三维图谱；

图5为防己茯苓汤组合物对照指纹图谱；

图6为三批防己茯苓汤组合物供试品指纹图谱叠加图；

图7为防己茯苓汤组合物中防己诺林碱、粉防己碱、甘草苷、甘草酸含量测定专属性色谱图；

图8为防己茯苓汤组合物中肉桂酸含量测定专属性色谱图；

图9为防己茯苓汤组合物中防己薄层鉴别图；

图10为防己茯苓汤组合物中甘草、黄芪薄层鉴别图；

图11为防己茯苓汤组合物中桂枝薄层鉴别图；

附图标识如下：图5中的4号峰为甘草苷，5号峰为防己诺林碱，6号峰为粉防己碱，8号峰为毛蕊异黄酮，9号峰为肉桂酸，10(S)号峰为甘草酸。积分参数：斜率灵敏度10，峰宽0.01，最小峰面积1，最小峰高1.7，数据剪切为4～64min。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1.防己茯苓汤组合物的制备

按比例称取如下饮片：防己857g，黄芪857g，桂枝857g，茯苓1714.3g，甘草571.4g，以上五味，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(40℃)的清膏，加麦芽糊精适量，混匀，干燥，制粒，制成1000g，即得防己茯苓汤组合物。

实施例2.防己茯苓汤组合物指纹图谱研究

仪器与试药

色谱仪：美国Agilent 1100系列(G1322A在线真空脱气机，G1311A四元梯度泵，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G1315B二极管阵列检测器)；

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C₁₈ 5μm.4.6mm×250mm；

试剂：甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯

对照品：甘草酸购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-14081812，纯度98.23％。

药品：防己茯苓汤组合物，批号：160401、160402、160403。

(1)色谱条件

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流速1.0ml/min；柱温：30℃；检测仪器采用紫外检测器，指纹图谱的检测波长237nm；理论塔板数以甘草酸峰计算不低于5000；参照物溶液为甘草酸溶液；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸+0.2％三乙胺溶液为流动相B，按如下顺序进行梯度洗脱：

(2)参照物溶液的制备

取甘草酸对照品适量，加甲醇制成1.0mg/ml的对照品储备液，再加20％流动相A-80％流动相B稀释为浓度300μg/ml。

(3)供试品溶液的制备

精密称取防己茯苓汤组合物1.0g，加20ml稀乙醇，称定重量，超声15min，放冷，以稀乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

(4)测定法

精密量取参照物溶液和供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

(5)方法学考察

该测定方法经过方法学验证，主要内容包括稳定性、重复性、精密度等。具体的实验结果见下。

①精密度考察

按本实施例方法制备供试品溶液1份，连续进样6次，测定指纹图谱，叠加图见附图1。计算部分色谱峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差，见表1。

表1精密度考察部分色谱峰保留时间和峰面积相对标准偏差

②稳定性考察

按本实施例方法制备供试品溶液1份，分别在近0h、3h、6h、8h、14h、19h、24h进样，测定指纹图谱，叠加图见附图。计算部分色谱峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差，见表2。

表2稳定性考察部分色谱峰保留时间和峰面积相对标准偏差

③重复性考察

按本实施例方法平行制备6份供试品溶液，测定指纹图谱，叠加图见附图3。计算部分色谱峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差，见表3。

表3重复性部分色谱峰保留时间和峰面积相对标准偏差

(5)防己茯苓汤组合物对照指纹图谱的确定及相似度分析

按照实施例1的步骤制备防己茯苓汤组合物，再以实施例2的步骤(3)制备供试品溶液，按指纹图谱测定法测定，记录图谱。通过分析，确定其共有特征峰为10个(见附图2)。各峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：1号峰相对保留时间RRT为0.345，2号峰相对保留时间RRT为0.431，3号峰相对保留时间RRT为0.478，4号峰相对保留时间RRT为0.489，5号峰相对保留时间RRT为0.514，6号峰相对保留时间RRT为0.585，7号峰相对保留时间RRT为0.786，8号峰相对保留时间RRT为0.808，9号峰相对保留时间RRT为0.840，10号S峰是参照物的色谱峰。

连续制备三批防己茯苓汤组合物，依照上述指纹图谱供试品的制备方法制备供试品溶液，进行测定，记录色谱图，叠加图见附图6。与对照指纹图谱作对比，计算防己茯苓汤组合物相似度达0.990以上。

表4三批防己茯苓汤组合物指纹图谱相似度

依照中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，以MARK峰计，暂定供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。

实施例3.采用高效液相色谱法测定防己茯苓汤组合物中的防己诺林碱、粉防己碱、甘草酸、甘草苷及肉桂酸含量

(一)防己诺林碱、粉防己碱、甘草酸、甘草苷的含量测定

主要仪器与试药

高效液相色谱仪：Agilent 1100；数据处理机：Agilent 1100化学工作站；紫外检测器：VWD G1314A。

色谱柱：Agilent ZORBEX SB-C₁₈ 5μm 4.6*250mm

对照品：甘草苷购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-15082511，纯度98.50％。甘草酸购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-14081812，纯度98.23％。防己诺林碱购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-15043017，纯度99.41％。粉防己碱购自中国食品药品检定研究院，批号110711-201609，纯度99.2％。

试剂：密理博超纯水，乙腈及甲醇为色谱纯，其余为分析纯等。

药品：防己茯苓汤组合物，批号：160401、160402、160403。

(1)色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBEX SB-C₁₈ 5μm 4.6*250mm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：237nm。理论板数按甘草酸峰计算应不低于5000。流动相：乙腈(A)-0.5％磷酸+0.4％三乙胺的水溶液(B)以下表进行梯度洗脱。

(2)供试品的制备

防己茯苓汤组合物1.0g，精密称定，加20ml稀乙醇，称定重量，超声15min，放冷，以稀乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

(3)对照品溶液的制备

分别取甘草苷对照品、甘草酸对照品、防己诺林碱对照品、粉防己碱对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含甘草苷、甘草酸、防己诺林碱、粉防己碱1.0mg的对照品储备液，备用。

分别取甘草苷、甘草酸对照品储备液适量，加20％流动相A-80％流动相B混合溶液制成每1ml含甘草苷80μg，甘草酸300μg的混合溶液，即得。

(4)测定法

精密吸取对照品溶液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

(5)方法学考察

①专属性

取防己茯苓汤组合物、甘草阴性、防己阴性及辅料，制备相应溶液，注入色谱仪。该测定方法经过方法学验证，阴性样品对测定结果无干扰，见附图7。

②稳定性

取防己茯苓汤组合物研细，精密称取，按照供试品溶液的制备方法制备样品，取供试品溶液分别于0h、2h、4h、8h、12h、16h、22h进样10μl，测定，记录色谱峰面积，分别计算各指标成分的相对标准偏差(RSD％)。

表5稳定性试验结果

③仪器精密度

依照供试品溶液的制备方法制备样品，连续进样6次，测定，记录色谱图，测定峰面积并计算相对标准偏差(RSD％)。结果表明仪器精密度良好。

表6精密度试验结果

④重复性

取防己茯苓汤组合物研细，取约1.0g，共计6份，精密称定，按照供试品溶液的制备方法制备样品，测定，记录色谱图，并计算含量和相对标准偏差(RSD％)。

表7重复性试验结果(mg/g)

⑤准确度实验

甘草苷：精密称取样品0.25g共6份，分置锥形瓶中，分别精密加入甘草苷(含量为0.039798mg/ml)对照品溶液10ml，制备供试品溶液。另同时称取三份组合物细粉1.0g，置具塞三角瓶中，不加对照品溶液，照供试品制备方法制备供试品溶液。依照含量测定方法测定，记录色谱图，并计算回收率(％)及其相对标准偏差(RSD％)。

表8甘草苷准确度试验结果

甘草酸：精密称取样品0.25g共计6份，分置锥形瓶中，分别精密加入甘草酸(含量为0.15696mg/ml)对照品溶液10ml，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。另同时称取三份组合物细粉1.0g，置具塞三角瓶中，不加对照品溶液，照供试品制备方法制备供试品溶液。依照含量测定方法测定，记录色谱图，并计算回收率(％)及其相对标准偏差(RSD％)。

表9甘草酸准确度试验结果

防己诺林碱：精密称取样品0.25g，共计6份，分置锥形瓶中，分别精密加入防己诺林碱(含量为0.013104mg/ml)对照品溶液10ml，依照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。另同时称取三份组合物细粉1.0g，置具塞三角瓶中，不加对照品溶液，照供试品制备方法制备供试品溶液。依照含量测定方法测定，记录色谱图，并计算回收率(％)及其相对标准偏差(RSD％)。

表10防己诺林碱准确度试验结果

粉防己碱：精密称取样品0.25g共计6份，分置锥形瓶中，分别精密加入粉防己碱(含量为0.02038mg/ml)对照品溶液10ml，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。另同时称取三份组合物细粉1.0g，置具塞三角瓶中，不加对照品溶液，照供试品制备方法制备供试品溶液。依照含量测定方法测定，记录色谱图，并计算回收率(％)及其相对标准偏差(RSD％)。

表11粉防己碱准确度试验结果

⑥标准曲线及线性范围

A甘草苷：精密移取甘草苷对照品母液(0.513mg/ml)20μl至5ml量瓶，分别移取20μl、50μl、100μl、200μl、400μl、800μl、1600μl至2ml量瓶，以20％流动相A-80％流动相B的混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，分别进样10μl。甘草苷线性回归方程为：y＝1843.6x+16.904，r＝0.9999，线性范围为0.02μg～4.10μg。

B甘草酸：精密量取甘草酸对照品母液(1.230mg/ml)25μl、50μl、100μl、200μl、400μl、800μl至5ml量瓶，640μl至2ml量瓶，以20％流动相A-80％流动相B的混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，上述溶液及母液，分别进样10μl。甘草酸线性回归方程为：y＝566.33x-33.32，r＝0.9996，线性范围为0.06μg～12.30μg。

C防己诺林碱：精密量取防己诺林碱对照品母液(1.008mg/ml)1ml至5ml量瓶，以20％流动相A-80％流动相B的混合溶液稀释至刻度，摇匀，得稀释后的对照品溶液。

精密吸取上述稀释后的对照品溶液50μl至5ml量瓶、再分别精密吸取50μl、100μl、250μl、500μl、1000μl至2ml量瓶，以20％流动相A-80％流动相B的混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，分别进样10μl。防己诺林碱线性方程为y＝2676.9x-21.317，r＝0.9999，线性范围为0.02μg～2.02μg。

D粉防己碱：精密量取粉防己碱对照品母液(1.019mg/ml)1ml至5ml量瓶，以20％流动相A-80％流动相B的混合溶液稀释至刻度，摇匀，得稀释后的对照品溶液。

精密吸取上述稀释后的对照品溶液50μl至5ml量瓶、再分别精密吸取50μl、100μl、250μl、500μl、1000μl至2ml量瓶，以20％流动相A-80％流动相B的混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，分别进样10μl。粉防己碱线性方程为y＝2515.5x-15.23，r＝0.9999，线性范围为0.02μg～2.04μg。

(6)样品测定

用本实施例方法测定连续三批防己茯苓汤组合物中防己诺林碱、粉防己碱、甘草苷、甘草酸含量，结果如下：

表12防己茯苓汤组合物中防己诺林碱、粉防己碱、甘草酸、甘草苷含量测定结果

(二)桂枝的含量测定

仪器与试药

高效液相色谱仪：Agilent 1100；数据处理机：Agilent 1100化学工作站；紫外检测器：VWD G1314A。

色谱柱：Agilent ZORBEX SB-C₁₈ 5μm 4.6*250mm

对照品：肉桂酸购自中国食品药品监定研究院，批号110786-200503

试剂：密理博超纯水，乙腈及甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

(1)色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBEX SB-C₁₈ 5μm 4.6*250mm；以乙腈-0.1％磷酸(30:70)为流动相，检测波长为280nm，流速：1ml/min；柱温：30℃。理论板数按肉桂酸峰计算应不低于5000。

(2)供试品溶液的制备

精密称取防己茯苓汤组合物1.0g，加20ml稀乙醇，称重，超声15min，以稀乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

(3)对照品溶液的制备

取肉桂酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成25μg/ml的溶液，即得。

(4)测定法

精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

(5)方法学考察

①专属性

取防己茯苓汤组合物、桂枝阴性及辅料，按照供试品溶液的制备方法制备相应溶液，注入色谱仪。该测定方法经过方法学验证，阴性样品对测定结果无干扰，见附图8。

②准确度

精密称取防己茯苓汤组合物0.25g6份，分置锥形瓶中，分别精密加入肉桂酸(浓度0.013312mg/ml)对照品溶液10ml，按照供试品制备方法制备供试品溶液，进样10μl，测定，记录色谱图，并计算回收率(％)及其相对标准偏差(RSD％)。结果表明，本方法的准确度良好。

表13肉桂酸准确度试验结果

③重复性

取防己茯苓汤组合物6份，按照供试品溶液的制备方法制备样品，对照品溶液、供试品溶液分别进样10μl，测定，记录色谱图，并计算含量和相对标准偏差(RSD％)。结果表明：本法的重复性较好，符合测试要求。

表14重复性试验结果

④仪器精密度

取防己茯苓汤组合物适量，按照供试品溶液的制备方法制备样品，连续进样6次，测定，记录色谱图，测定峰面积并计算相对标准偏差(RSD％)。结果表明仪器精密度良好。

表15精密度试验结果

⑤稳定性

取防己茯苓汤组合物适量，按照供试品溶液的制备方法制备样品，取供试品溶液分别于0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h进样10μl，测定，记录色谱峰面积，分别计算各指标成分的相对标准偏差(RSD％)。

表16稳定性试验结果

⑥线性曲线及线性范围

精密移取肉桂酸对照品母液(0.512mg/ml)1ml至10ml量瓶加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别取对照品溶液0.5μl、1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、15μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，记录色谱图。肉桂酸线性回归方程为：y＝7419.5x-4.9156，r＝0.9999，线性范围为0.03μg～0.77μg。

(6)样品的测定

用本实施例方法测定连续三批防己茯苓汤组合物中肉桂酸含量，结果如下：

表17防己茯苓汤组合物中肉桂酸含量测定结果

实施例4.薄层色谱法鉴别防己茯苓汤组合物中防己、黄芪、桂枝、甘草

仪器与试药

仪器：卡玛(CAMAG)半自动薄层点样、展开、成像系统。

试剂：均为分析纯。

对照品：防己诺林碱购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-13081501，

粉防己碱购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-15041702，

甘草苷购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST14020911，

甘草酸铵购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-16011310，

黄芪甲苷购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-15072911，

肉桂酸购自中国食品药品检定研究院，批号110789-200503。

对照药材：防己-批号121279-200301，黄芪(蒙古黄芪)-批号120974-201311，甘草(甘草)-批号120904-201318，茯苓-批号121117-201308，桂枝-批号121191-201304，均购自中国食品药品检定研究院。

(1)防己茯苓汤组合物中防己的鉴别

取防己茯苓汤组合物适量，研细，称取3g，加氨试液40ml，超声10min，滤过，滤液加80ml水饱和正丁醇萃取，分取正丁醇层，减压蒸干，以甲醇2ml溶解，滤过，即得供试品溶液。另取防己对照药材0.5g，同法制得对照药材溶液。再取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮-甲醇-5％浓氨试液(6:1:1:0.1)为展开剂，于湿度低于70％环境下展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见附图9。

(2)防己茯苓汤组合物中黄芪甘草的鉴别：

取防己茯苓汤组合物适量，研细，称取2.5g，加甲醇50ml超声30min，滤过，滤液减压蒸干，残渣加氨试液20ml超声助溶，放置30分钟后，减压蒸干，残渣再以10ml水超声助溶，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为15cm)，以水100ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇80ml洗脱，弃去洗脱液，继用80％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材0.4g、黄芪对照药材2.0g，同法制备对照药材溶液。再取黄芪甲苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述供试品、对照药材溶液及对照品溶液各7μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，使呈条带状；以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm下检视，供试品中在与甘草对照药材及甘草苷、甘草酸色谱相应的位置上，显相同的暗斑；再喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与黄芪对照药材及黄芪甲苷色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，在与甘草对照药材及甘草苷色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点。见附图10。

(3)防己茯苓汤组合物中桂枝药材的鉴别：

取防己茯苓汤组合物适量，研细，称取2g，加乙醇10ml超声30min，滤过，作为供试品溶液。另取桂枝对照药材0.5g，同法制备对照药材溶液。再取肉桂酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述供试品溶液7μl、对照品溶液5μl、对照药材溶液10μl，分别点于同硅胶GF₂₅₄薄层板上；以环己烷-乙酸乙酯-冰乙酸(4:1:0.05)为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm下检视，供试品色谱中在与对照药材色谱及肉桂酸色谱相应的位置上，显相同的暗斑。见附图11。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.防己茯苓汤组合物的检测方法，其特征在于，包括采用高效液相色谱法建立防己茯苓汤组合物指纹图谱，色谱条件为：

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流速：0.8ml/min～1.2ml/min；柱温：20℃～35℃；

检测仪器采用紫外检测器，指纹图谱的检测波长237nm；

理论塔板数以甘草酸峰计算不低于5000；

参照物溶液为甘草酸溶液；

以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸+0.2％三乙胺溶液为流动相B，按如下顺序进行梯度洗脱：

还包括采用薄层色谱法鉴别防己茯苓汤组合物中的防己、甘草、黄芪、桂枝，鉴别方法如下：

(1)鉴别防己：取防己茯苓汤组合物2g～4g研细，加氨试液30ml～60ml，超声10min～30min，滤过，滤液加60ml～120ml水饱和正丁醇萃取，分取正丁醇层，减压蒸干，以甲醇1ml～5ml溶解，滤过，即得供试品溶液；

取防己对照药材0.2g～1g研细，加氨试液30ml～60ml，超声10min～30min，滤过，滤液加60ml～120ml水饱和正丁醇萃取，分取正丁醇层，减压蒸干，以甲醇1ml～5ml溶解，滤过，即得防己对照药材溶液；

取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg～2mg的混合溶液，作为对照品溶液；

鉴别方法：吸取供试品溶液，防己对照药材溶液，以及对照品溶液各4μl～8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮-甲醇-5％浓氨试液为展开剂，于湿度低于70％环境下展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，其中，所述二氯甲烷-丙酮-甲醇-5％浓氨试液的体积比为3～12：0.5～2：0.5～2：0.05～0.2；

(2)鉴别甘草、黄芪：取防己茯苓汤组合物研细，称取1g～5g，加甲醇25ml～75ml超声20min～40min，滤过，滤液减压蒸干，残渣先后加氨试液、水并超声助溶，再通过内径为1.5cm柱高为15cm的D101型大孔吸附树脂柱，先后以水，30％～50％乙醇，70％～90％乙醇洗脱，收集70％～90％乙醇洗脱的洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml-5ml使溶解，作为供试品溶液；

取甘草对照药材0.2g～0.8g、黄芪对照药材1g～4g，研细，分别加甲醇超声，滤过，滤液减压蒸干，残渣先后加氨试液、水并超声助溶，再通过D101型大孔吸附树脂柱，先后以水，30％～50％乙醇，70％～90％乙醇洗脱，收集70％～90％乙醇洗脱的洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml-5ml使溶解，分别制得甘草对照药材溶液、黄芪对照药材溶液；

取黄芪甲苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量，加甲醇制成每1ml各含0.3mg～0.8mg的混合溶液，作为对照品溶液；

鉴别方法：吸取供试品溶液、甘草对照药材溶液、黄芪对照药材溶液及对照品溶液各5μl～9μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，使呈条带状；以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm下检视，再喷以5％～10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置于365nm的紫外光灯下检视，其中，所述乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水的体积比为7.5～30：0.5～2：0.5～2：1～4；

(3)桂枝鉴别：取防己茯苓汤组合物研细，称取1g～5g，加乙醇10ml～30ml超声20min～50min，滤过，作为供试品溶液；

取桂枝对照药材0.2g～1g研细，加乙醇10ml～30ml超声20min～50min，滤过，制得对照药材溶液；

取肉桂酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg～0.5mg的溶液，作为对照品溶液；

鉴别方法：分别吸取供试品溶液、对照药材溶液以及对照品溶液5μl～12μl，分别点于同硅胶GF254薄层板上；以环己烷-乙酸乙酯-冰乙酸为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm下检视，其中，所述环己烷-乙酸乙酯-冰乙酸的体积比为2～8：0.5～2：0.025～0.1。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述指纹图谱包括10个共有峰，各峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：1号峰相对保留时间RRT为0.345，2号峰相对保留时间RRT为0.431，3号峰相对保留时间RRT为0.478，4号峰相对保留时间RRT为0.489，5号峰相对保留时间RRT为0.514，6号峰相对保留时间RRT为0.585，7号峰相对保留时间RRT为0.786，8号峰相对保留时间RRT为0.808，9号峰相对保留时间RRT为0.840，10号S峰是参照物的色谱峰。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述防己茯苓汤组合物是通过如下方法制备得到：

防己3份，黄芪3份，桂枝3份g，茯苓6份，甘草2份，以上五味，加水煎煮两次，滤过，40℃下将滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25的清膏，加麦芽糊精，混匀，干燥，制粒，即得防己茯苓汤组合物。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，建立所述防己茯苓汤组合物指纹图谱时的供试品溶液与参照物溶液按如下方法制备：

(1)供试品溶液的制备：取防己茯苓汤组合物研细，称取0.5g～2.0g，加10ml～40ml稀乙醇，称定重量，超声10min～30min，放冷，以稀乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；

(2)参照物溶液的制备：取甘草酸对照品，加甲醇制成1体积份含0.001重量份的对照品储备液，再加20％流动相A-80％流动相B稀释至1体积份含0.0003重量份。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，进样量为10μl-20μl。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，还包括用高效液相色谱法测定防己茯苓汤组合物中防己诺林碱、粉防己碱、甘草酸、甘草苷、肉桂酸的含量，其中防己诺林碱、粉防己碱、甘草酸、甘草苷含量测定的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：25℃～30℃；流速：0.8ml/min～1.0ml/min；检测波长为237nm，理论板数按甘草酸峰计算不低于5000，以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸+0.4％三乙胺溶液为流动相B，按如下顺序梯度洗脱：

测定防己茯苓汤组合物中肉桂酸含量的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为30:70的乙腈-0.1％磷酸为流动相；流速：0.8ml/min～1.2ml/min；柱温：25℃～35℃；检测波长为280nm；理论板数按肉桂酸峰计算不低于5000。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，用高效液相色谱法测定防己茯苓汤组合物中防己诺林碱、粉防己碱、甘草酸、甘草苷、肉桂酸含量时，

供试品溶液按如下方法制得：

取防己茯苓汤组合物研细，称取0.5g～2.0g，加10ml～40ml稀乙醇，称定重量，超声10min～30min，放冷，以稀乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；进样量均为10μl～20μl。

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