CN112083099B - 苓桂术甘汤物质基准的制备工艺及其质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种苓桂术甘汤物质基准的制备工艺及其质量控制方法。本发明经过系统的方剂历史沿革调研,将古法与现代提取方法相结合,采用单因素考察,优选苓桂术甘汤及其物质基准的制备工艺及干燥工艺。进一步,采用薄层色谱法对物质基准中茯苓、桂枝、白术和甘草进行鉴别,采用高效液相色谱法建立分离度、重现性较好的指纹图谱,通过高效液相色谱法对甘草苷、肉桂酸和桂皮醛进行定量研究。本发明建立的苓桂术甘汤物质基准制备工艺及其质量标准研究方法,为该复方制剂的合理开发提供了系统的研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及药品制备及其质量控制领域,具体地说,涉及苓桂术甘汤物质基准的制备工艺及其质量控制方法。
背景技术
苓桂术甘汤在《伤寒论》、《金匮要略》中已有饮片炮制、煎煮、服用方法,但古籍中煎煮条件大多较为笼统,应根据古籍记载,并按照现在煎煮习惯进行例如浸泡时间、提取次数等考察,模拟古代汤剂制备方法;在现代制剂研究中,应考虑制备工艺和制剂中化学成分组成和含量尽量与传统服用汤剂相吻合,确保现代制剂的安全性和有效性,这就带来了制剂过程中挥发性成分的保留等诸多经方开发的问题。苓桂术甘汤被列入国家中医药管理局首批公布的经典名方100首中,具有较高的开发应用价值。但目前对于苓桂术甘汤物质基准的制备工艺及质量研究方法尚无全程控制手段,亦无全面反映该经方各味药所含化学成分种类及物质传递的系统性研究报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供苓桂术甘汤物质基准的制备工艺及其质控方法,为经典名方苓桂术甘汤复方制剂开发提供可靠的制备与质量控制方法。
第一方面,本发明提供了一种苓桂术甘汤物质基准制备工艺,包括以下步骤:按重量份配比称取茯苓55.2份、桂枝41.4份、白术41.4份和甘草27.6份,加水1200份浸泡,武火煮沸后,文武火加热至原水体积的一半,取水提液进行冷冻干燥,即得。
作为一个优选例,具体采用煎药壶,加盖提取一次,具体为武火煮沸后,继续文武火煎煮,所述文武火煎煮为:先武火煎煮5~40min,再文火煎煮5~100min。
作为另一个优选例,所述物质基准其指纹图谱包含以下色谱峰:
所述指纹图谱的建立采用的色谱条件为:0.05%磷酸水(A)-乙腈(B)作为流动相,洗脱程序为:
色谱柱为Welchrom C18,检测波长为220nm,流速为1mL/min,柱温为25℃,进样量为10μL。
第二方面,本发明提供了一种苓桂术甘汤物质基准的干燥方法,将苓桂术甘汤的水提液进行冷冻干燥。
第三方面,本发明提供了一种苓桂术甘汤物质基准的质量控制方法,包括以下步骤:
步骤S1,建立待测苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱,其中色谱条件为:0.05%磷酸水(A)-乙腈(B)作为流动相,洗脱程序为:
色谱柱为Welchrom C18,检测波长为220nm,流速为1mL/min,柱温为25℃,进样量为10μL;
步骤S2,确定待测苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱是否包含以下色谱峰,判断待测苓桂术甘汤质量是否合格:
作为一个优选例,进一步确定待测苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱是否包含以下色谱峰:
作为另一优选例,供试品的制备方法为:取待测苓桂术甘汤的水提液,冷冻干燥,加水溶解后,再加甲醇定容,离心,过膜即得。
作为另一优选例,还包括以下任一步骤中的一个或几个:
测定待测苓桂术甘汤物质基准中桂皮醛含量的步骤,测定的色谱条件为:Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),检测波长为290nm,进样量为10μL,将0.05%-磷酸水-乙腈(38:62,V/V)作为流动相,流速为1.0mL/min,柱温为25℃;供试品的处理方法为:取5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀,过膜,即得;
测定待测苓桂术甘汤物质基准中肉桂酸含量的步骤,测定的色谱条件为:Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),检测波长为285nm,进样量为10μL,将0.05%磷酸水-乙腈(65:35,V/V)作为流动相,流速为1.0mL/min,柱温为25℃;供试品的处理方法为:取5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀,过膜,即得;
测定待测苓桂术甘汤物质基准中甘草苷含量的步骤,测定的色谱条件为:Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),检测波长为237nm,进样量为10μL,梯度洗脱,将0.05%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)作为流动相(0min,A:B=81:19;8min,A:B=81:19;35min,A:B=50:50;36min,A:B=0:100;40min,A:B=81:19),流速为1.0mL/min,柱温为25℃;供试品的处理方法为:取5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀,过膜,即得。
作为另一优选例,还包括以下任一步骤中的一个或几个:
茯苓薄层鉴别的步骤,具体为:
取待测苓桂术甘汤物质基准1g,加乙醚25mL,超声30min,过滤,蒸干滤液,加0.5mL三氯甲烷使残渣溶解,作为苓桂术甘汤物质基准供试品;取茯苓阴性处方,同法处理得到茯苓阴性供试品;另取茯苓对照药材1g,同法制成茯苓对照药材溶液;
照薄层色谱法试验,展开剂为石油醚(30~60℃)-丙酮(95:5),吸取上述溶液各20μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,置紫外灯(365nm)下检视;
如供试品与茯苓对照药材在Rf值相等处有相同颜色的斑点,茯苓阴性供试品无斑点,则质量合格;
桂枝薄层鉴别的步骤,具体为:
取待测苓桂术甘汤物质基准1g,加75%乙醇4mL,密塞,超声处理30min,过滤,取续滤液作为苓桂术甘汤物质基准供试品;取桂枝阴性处方,同法处理得到桂枝阴性供试品;另将桂皮醛对照品加乙醇溶解得到浓度为1μL/mL的溶液,作为桂皮醛对照品溶液;
照薄层色谱法试验,展开剂为石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(17:3),吸取上述溶液各10μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,喷以二硝基苯肼乙醇试液;
如供试品与桂皮醛对照品在Rf值相等处有橙黄色斑点,桂枝阴性供试品无斑点,则质量合格;
白术薄层鉴别的步骤,具体为:
取待测苓桂术甘汤物质基准1g,加甲醇5mL,超声提取50min,冷却至室温,过滤,取续滤液,作为苓桂术甘汤物质基准供试品;取白术阴性处方,同法制成白术阴性对照溶液;另取白术对照药材0.5g,同法制成白术对照药材溶液;
照薄层色谱法试验,展开剂为环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2:1:1:0.1),吸取上述溶液各10μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,置紫外灯(365nm)下检视;
如供试品与白术对照药材在Rf值相等处有相同颜色斑点,白术阴性供试品无斑点,则质量合格;
甘草薄层鉴别的步骤,具体为:
取待测苓桂术甘汤物质基准1g,加40mL乙醚,回流提取1h,过滤,药渣加30mL甲醇,回流提取1h,过滤,蒸干滤液,加40mL水使残渣溶解,用20mL正丁醇萃取,重复操作2次,将正丁醇液合并,加水洗涤3次,蒸干正丁醇液,加5mL甲醇使残渣溶解,作为苓桂术甘汤物质基准供试品;取甘草阴性处方,同法处理得到甘草阴性对照溶液;另取甘草对照药材lg,同法制成甘草对照药材溶液;另将甘草酸单铵盐加甲醇溶解得到浓度为2mg/mL的溶液,作为甘草酸单铵盐对照品溶液;
照薄层色谱法试验,展开剂为乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2),吸取上述溶液各10μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,于105℃加热约40min至显色淸晰,置紫外光灯(365nm)下检视;
如供试品,甘草对照药材和甘草酸单铵盐对照品在Rf值相等处有相同颜色斑点,甘草阴性供试品无斑点,则质量合格。
本发明优点在于:
1、本发明对苓桂术甘汤物质基准的制备工艺进行优选,将现代提取方法与古法进行对比,以确保苓桂术甘汤的物质基准与传统汤剂的一致性。
2、确定的本发明对苓桂术甘汤物质基准制备工艺采用煎药壶加盖煎煮、文武火加热、煎煮前浸泡,并以冷冻干燥方式进行物质基准实物的制备,既能保证三个主要成分桂皮醛、肉桂酸和甘草苷的转移率,也能最大化保留挥发性成分桂皮醛,充分保证了该物质基准中的各味药材成分的更多保留及制备工艺的稳定性。
3、本发明提供了苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱,从整体上评价苓桂术甘汤物质基准的内在化学物质的种类、传递规律及其含量。
4、从药材、饮片、苓桂术甘汤、物质基准的一系列薄层色谱鉴别中,发现均有对应的特征斑点,为物质基准中的特征成分溯源到药材提供了依据,通过含量测定证实了药材、饮片、苓桂术甘汤、物质基准之间具有一定的相关性。
5、本发明所建立的三个主要成分桂皮醛、肉桂酸和甘草苷的含量测定方法精密度、稳定性及重复性均良好。
6、本发明可保证临床用药的安全、有效和稳定,也为苓桂术甘汤复方制剂后续的制备工艺研究、质量标准建立及稳定性考察提供了详实可靠的研究基础。
附图说明
图1.苓桂术甘汤物质基准中茯苓的TLC图。
图2.苓桂术甘汤物质基准中桂枝的TLC图。
图3.苓桂术甘汤物质基准中白术的TLC图。
图4.苓桂术甘汤物质基准中甘草的TLC图。
图5.不同检测波长对苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱的影响。
图6.不同流动相种类对苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱的影响。
图7.不同流动相中酸水浓度对苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱的影响。
图8.不同流动相的洗脱条件对苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱的影响。
图9.不同进样量对苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱的影响。
图10.不同柱温对苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱的影响。
图11.苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱中茯苓的特征峰归属。
图12.苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱中桂枝的特征峰归属。
图13.苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱中白术的特征峰归属。
图14.苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱中甘草的特征峰归属。
图15.15批苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱。
图16.15批苓桂术甘汤物质基准的共有模式图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。其中,所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1
1.苓桂术甘汤物质基准的制备工艺研究
1.1处方组成及煎煮体积的确定
本发明经考证所采用的苓桂术甘汤的处方量、用法用量信息,与国家中医药管理局发布的《古代经典名方关键信息表(7首方剂)(征求意见稿)》中所列该方信息吻合,即处方组成为:茯苓55.2g、桂枝41.4g、白术41.4g和甘草27.6g,加水1200mL,煎煮至600mL。
1.2提取工艺的指标选择
在《中国药典》(2015版)的茯苓与白术项下均无定量指标,桂枝项下定量指标为桂皮醛,甘草项下定量指标为甘草苷和甘草酸。由于茯苓三萜类成分水溶性差,而本方用水作为媒介进行提取,前期实验通过对水提液中三萜类成分进行富集,通过HPLC的方法测得茯苓酸和猪苓酸C含量极低,目标峰低于定量限,5-羟甲基茯苓有阴性干扰,该干扰主要来源于甘草与白术,故不对茯苓设定量指标。桂枝中的桂皮醛具有显著的抗炎作用,肉桂酸具有抗菌、抗炎、抑制癌细胞生长等活性,故选择桂皮醛和肉桂酸作为定量指标。由于白术中白术内酯I、II和III在水提液中含量较低,仅作指纹图谱的定性鉴别,不作定量指标。在本方中甘草作为使药,主要成分甘草苷具有抗炎、祛痰、抗抑郁、神经保护等多重药理活性,故在本发明中仅选用甘草苷作为甘草的指标成分。
本发明模拟古法制备苓桂术甘汤,根据实验的可操作性和方便性,最终选择复方水煎液中水溶性较好的桂皮醛、肉桂酸、甘草苷作为定量指标,HPLC法定量分析。
1.3提取方法的考察
(1)加盖与不加盖考察
称取茯苓55.2g、桂枝41.4g、白术41.4g和甘草27.6g,加水1200mL,分别采取直火(燃气灶)加盖和不加盖的方式进行提取,武火煮沸,转文火煎煮至600mL,其中武火、文火均为中药领域习用术语,文火火力小而缓,武火火力大而急。取水提液1mL,加甲醇定容到5mL,摇匀,过微孔滤膜,测桂皮醛、肉桂酸、甘草苷指标成分含量,计算转移率,结果见表1。
表1.不同提取方法各指标成分转移率(n=6)
实验结果表明:加盖与否对肉桂酸成分的保留影响不大,加盖有利于甘草苷的保留,而不加盖有利于桂皮醛的保留,推测其与煎煮时间有关。实际的研究过程中,发现直火无盖煎煮时间过短,沸腾后约20min即完成。本研究对加盖与不加盖对三个指标成分的影响进行综合评价,并结合现在煎煮中药的习惯,宜采用加盖煎煮。
(2)提取方法考察
由(1)加盖与不加盖考察的实验结果可知:挥发性成分桂皮醛的保留与煎煮时间有密切关系,而本方要求1200mL煎至600mL,则与煎煮用火力密切相关。实验研究中,武火煮沸后,转文火煎煮,不同程度火力均可保持沸腾状态,故在后续实验中采用燃气灶不同火力文火煎煮,并增加了煎药壶组,考察不同提取方法对挥发性指标成分桂皮醛的提取是否有影响。称取上述处方饮片,加水1200mL,分别采用直火加盖煮沸后,文火1、文火2、文火3,及煎药壶文武火(电煎药壶自带模式,先武火煎煮一段时间,再文火煎煮一段时间)加盖四种煎煮方式,沸腾后文武火加热煎煮至600mL。取水提液1mL,加甲醇定容到5mL,摇匀,过微孔滤膜,测桂皮醛成分含量,计算转移率,结果见表2。
表2.不同提取方法各指标成分转移率(n=3)
实验结果表明,直火加热沸腾后,转不同火力煎煮至指定体积,所需时间相差较大,为30min至2h,挥发性成分桂皮醛受煎煮时间影响较大,其转移率为4.23%~11.28%。现代煎药壶可通过控制功率而达到控制火候的作用,其桂皮醛转移率5.16%在直火加盖不同火力煎煮液桂皮醛转移率为4.23%~11.28%范围内,且煎煮时间和火力均可定量控制,解决了不同操作者和不同燃气灶对本方煎煮时间的影响。因此,本研究后续采用煎药壶煎煮的方式作为提取工艺的加热方式。
(3)加热方式的考察
称取茯苓55.2g、桂枝41.4g、白术41.4g和甘草27.6g,加水1200mL,采用煎药壶煎煮至600mL。煎药壶加热方式有单纯武火(500W)、单纯文火(250W)和文武火(即武火(500W)煮沸之后,先武火(500W)煎煮5~40min,再文火(250W)煎煮5~100min)三种加热方式,分别对其进行比较。取水提液1mL,加甲醇定容到5mL,摇匀,过微孔滤膜,测桂皮醛、肉桂酸、甘草苷指标成分含量,计算转移率,结果见表3。
表3.煎药壶加热古法提取各指标成分转移率(n=4)
实验过程中所需提取时间单纯文火>文武火>单纯武火,而提取时间对于肉桂酸转移率影响较小,甘草苷转移率随提取时间的增加而升高,桂皮醛转移率随提取时间的增加而减少。为了尽可能与古籍提取效果接近,综合考虑,加热方式选择文武火加热。
(4)浸泡时间的考察
由于现代工艺提取前一般需要浸泡,而《金匮要略》中苓桂术甘汤制备工艺未提及浸泡相关事宜,故考察浸泡0、30和90min对于各指标成分转移率的影响,结果见表4。
表4.不同浸泡时间各指标成分转移率(n=4)
由上表可知,浸泡时间越长,各指标成分转移率越高,浸泡30min与浸泡60min各指标成分的转移率差异不大,故浸泡时间选择30min。
(5)提取验证试验
根据单因素实验结果,最佳工艺为:称取茯苓55.2g、桂枝41.4g、白术41.4g和甘草27.6g,加水1200mL浸泡30min,提取1次,武火煮沸后(约25min),文武火(武火:500W,30min;文火:250W,20min)加热至600mL,验证实验结果见下表5。
表5.提取工艺验证实验结果(n=6)
经验证,该优选的提取工艺提取率高,工艺稳定。
具体的提取工艺为:取茯苓55.2g、桂枝41.4g、白术41.4g和甘草27.6g,加水1200mL,浸泡30min,采用煎药壶,武火煮沸后(约25min),文武火(武火:500W,30min,文火:250W,20min),加盖提取一次。
1.4物质基准干燥工艺研究
1.4.1不同干燥方式的比较
经实验研究发现,减压浓缩之后,浓缩水提液中无法测得挥发性成分桂皮醛,由于桂皮醛具有强烈的抗炎,抗氧化活性,具有解热镇痛、抗菌、抗炎、降血糖、降血压等多种药理作用,为本方的重要活性成分,因此,有必要对该成分进行保留。故后续实验对水提液不进行浓缩工艺操作,直接对水提液进行干燥工艺研究。
为了考察不同干燥方式对指标成分的影响,分别采用常用的真空干燥(60℃,48h)和冷冻干燥(在低温冰箱-80℃下预冻后,转入冻干机,以仪器自带主冻干程序冻干:预冻时间为12h,冻干时间为48h)对水提液进行干燥,采用HPLC法测各指标成分含量,比较同一份水提液分别采用不同干燥方式干燥后三个指标成分从饮片中转移出的含量。表6中实验结果表明,真空干燥样品中,无法测得桂皮醛成分,故选择冷冻干燥法作为本方的干燥方法。
表6.不同干燥方式对各指标成分的影响(n=3)
1.4.2不同冻干机的影响
为了考察不同冻干机对各指标成分转移率的影响,采用两台冻干机(LABCONCOFree Zone 2.5、CHRIST Alpha 2-4LD plus)进行对比实验,将煎药壶煎煮得到的水提液,分别按照1.4.1项下方法冷冻干燥48h,采用HPLC法测各指标成分含量,比较同一份水提液分别采用不同冻干机干燥后三个指标成分从饮片中转移出的含量。表7中实验结果表明,由于不同厂家的冻干机的冻干曲线略有差异,所以对于各指标成分的转移略有影响,而对于桂皮醛成分均能够保留,说明该成分的保留不受冻干机不同型号影响。
表7.不同冻干机含量测定(n=3)
1.5物质基准的制备
采用分层随机化,以药材为层,复方为组,使用Excel软件产生随机数给药材批号分配随机号及组号,相同组号的组成复方配伍进行实验。将苓桂术甘汤4味药各15批次进行排列组合,按仿最优提取工艺对15批物质基准进行提取,即称取茯苓55.2g、桂枝41.4g、白术41.4g和甘草27.6g,加水1200mL浸泡30min,文武火加热至600mL,取水提液进行冷冻干燥(在低温冰箱-80℃下预冻后,转入冻干机,以仪器自带主冻干程序冻干:预冻时间为12h,冻干时间为48h),即得。
2.物质基准的质量标准研究
2.1物质基准定性研究
2.1.1薄层色谱研究
(1)茯苓的薄层鉴别
取本品粉末1g,加乙醚25mL,超声30min,过滤,蒸干滤液,加0.5mL三氯甲烷使残渣溶解,作为苓桂术甘汤物质基准供试品,15批次物质基准供试品同法处理;取茯苓阴性处方,同法处理得到茯苓阴性供试品;另取茯苓对照药材1g,同法制成茯苓对照药材溶液。
照薄层色谱法(四部通则0502)试验,展开剂为石油醚(30~60℃)-丙酮(95:5),吸取上述溶液各20μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,置紫外灯(365nm)下检视。
15批物质基准供试品与茯苓对照药材在Rf值相等处有相同颜色的斑点,茯苓阴性供试品无斑点。结果见图1(A.茯苓对照药材,B~P.1~15号物质基准供试品,Q.茯苓阴性供试品)。
(2)桂枝的薄层鉴别
取本品粉末1g,加75%乙醇4mL,密塞,超声处理30min,过滤,取续滤液作为苓桂术甘汤物质基准供试品,15批次物质基准供试品同法处理;取桂枝阴性处方,同法处理得到桂枝阴性供试品;另将桂皮醛对照品加乙醇溶解得到浓度为1μL/mL的溶液,作为桂皮醛对照品溶液。
照薄层色谱法(四部通则0502)试验,展开剂为石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(17:3),吸取上述溶液各10μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,喷以二硝基苯肼乙醇试液。
15批物质基准供试品与桂皮醛对照品在Rf值相等处有橙黄色斑点,桂枝阴性供试品无斑点。结果见图2(A.桂皮醛对照品,B~P.1~15号物质基准供试品,Q.桂枝阴性供试品)。
(3)白术的薄层鉴别
取本品粉末1g,加甲醇5mL,超声提取50min,冷却至室温,过滤,取续滤液,作为苓桂术甘汤物质基准供试品,15批次物质基准供试品同法处理;取白术阴性处方,同法制成白术阴性对照溶液;另取白术对照药材0.5g,同法制成白术对照药材溶液。
照薄层色谱法(四部通则0502)试验,展开剂为环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2:1:1:0.1),吸取上述溶液各10μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,置紫外灯(365nm)下检视。
15批物质基准供试品与白术对照药材在Rf值相等处有相同颜色斑点,白术阴性供试品无斑点。结果见图3(A.白术对照药材,B~P.1~15号物质基准供试品,Q.白术阴性供试品)。
(4)甘草的薄层鉴别
取本品粉末1g,加40mL乙醚,回流提取1h,过滤,药渣加30mL甲醇,回流提取1h,过滤,蒸干滤液,加40mL水使残渣溶解,用20mL正丁醇萃取,重复操作2次,将正丁醇液合并,加水洗涤3次,蒸干正丁醇液,加5mL甲醇使残渣溶解,作为苓桂术甘汤物质基准供试品,15批次物质基准供试品同法处理;取甘草阴性处方,同法处理得到甘草阴性对照溶液;另取甘草对照药材l g,同法制成甘草对照药材溶液;另将甘草酸单铵盐加甲醇溶解得到浓度为2mg/mL的溶液,作为甘草酸单铵盐对照品溶液。
照薄层色谱法(四部通则0502)试验,展开剂为乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2),吸取上述溶液各10μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,于105℃加热约40min至显色淸晰,置紫外光灯(365nm)下检视。
15批物质基准供试品,甘草对照药材和甘草酸单铵盐对照品在Rf值相等处有相同颜色斑点,甘草阴性供试品无斑点。结果见图4(A.甘草酸单铵盐对照品,B.甘草对照药材,C~Q.1~15号物质基准供试品,R.甘草阴性供试品)。
2.1.2指纹图谱研究
(1)指纹图谱色谱条件的研究
①供试品的制备
取水提液5mL,放入10mL离心管中,-80℃冷冻过夜后冷冻干燥,加0.5mL水溶解后,再加甲醇定容至1mL,离心,过膜即得。
②色谱条件的优选
a.检测波长的选择
Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),0.1%磷酸(A)-乙腈(B)为流动相,按表8中的比例洗脱,比较不同检测波长(220nm,237nm,260nm,285nm,290nm)下的色谱图,见图5(图上编号A-E依次对应上述波长下的色谱图)。经前期实验研究,桂皮醛和肉桂酸最大吸收波长为分别为290nm和285nm,甘草苷与甘草酸为237nm,白术内酯III为220nm。白术内酯III含量较低,为保留指纹图谱中体现白术的指标,故选择的检测波长为220nm,且在该条件下,特征峰数目多且分离效果好。
表8.流动相洗脱条件
b.流动相种类的考察
Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),检测波长为220nm,0.1%磷酸(A)-甲醇(B),水(A)-甲醇(B),0.1%磷酸(A)-乙腈(B),水(A)-乙腈(B)作为流动相,按表8中的比例洗脱,比较色谱图,见图6(图上编号A-D依次对应上述流动相的色谱图)。比较分析流动相对应图谱,发现0.1%磷酸-乙腈色谱图中特征峰较多,且分离效果较好,故选择0.1%磷酸-乙腈为流动相。
c.酸水浓度的考察
Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),检测波长为220nm,0.1%磷酸水(A)-乙腈(B),0.05%磷酸水(A)-乙腈(B)作为流动相,按表8中的比例洗脱,比较不同酸水浓度对应色谱图,见图7(图上A为0.1%磷酸,B为0.05%磷酸对应的色谱图)。实验结果表明,0.05%磷酸色谱峰的分离效果更好,故选择0.05%磷酸-乙腈为流动相。
d.流动相比例的考察
Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),检测波长为220nm,0.05%磷酸水(A)-乙腈(B)作为流动相,分别按表9-13中的比例洗脱,比较色谱图,见图8(图上A-E依次对应为洗脱条件1-5)。实验结果表明,流动相洗脱条件1中的色谱图较其他色谱图指标性成分具有良好的分离效果,且能够全面反映其主要成分,故以此作为梯度洗脱条件。
表9.流动相洗脱条件1
表10.流动相洗脱条件2
表11.流动相洗脱条件3
表12.流动相洗脱条件4
表13.流动相洗脱条件5
e.进样量的考察
Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),检测波长为220nm,0.05%磷酸水(A)-乙腈(B)作为流动相,按表9的比例洗脱,考察进样量为10μL与20μL对色谱图的影响,见图9(图上A为进样量10μL,B为20μL对应的色谱图)。
实验结果表明,20μL与10μL相比没有出现新的特征峰,峰面积均为10μL的两倍左右,且20μL色谱图飘离基线更多,故进样量选择10μL。
f.柱温的考察
Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),检测波长为220nm,0.05%磷酸水(A)-乙腈(B)作为流动相,按表9中的比例洗脱,进样量为10μL,考察不同柱温对色谱图情况,见图10(图上A-D依次为柱温25℃、30℃、35℃、40℃对应的色谱图)。
实验结果表明,柱温越高色谱峰越少,故选择25℃为柱温条件。
g.液相条件的确定
Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),检测波长为220nm,0.05%磷酸水(A)-乙腈(B)作为流动相,按表9中的比例洗脱;流速为1mL/min;柱温为25℃;进样量为10μL。
③指纹图谱方法学考察
a.精密度实验
精密吸取物质基准指纹图谱供试液10μL,按确立的HPLC分析方法,重复进样6次,记录色谱图。通过指纹图谱相似度评价系统(2.0版)评价相似度,相似度均大于0.95,证明仪器精密度良好。
b.重复性实验
按确定的供试品处理方法,平行处理6份,按优选的HPLC分析方法进样,记录色谱图。通过指纹图谱相似度评价系统(2.0版)评价相似度,相似度均大于0.95,证明方法重复性良好。
c.稳定性实验
按供试品处理方法制备物质基准指纹图谱供试品,按优选的HPLC分析方法进样,记录0、2、4、6、8、10、12、24h的色谱图。通过指纹图谱相似度评价系统(2.0版)评价相似度,相似度均大于0.95,证明供试品24h内稳定性良好。
④指纹图谱特征峰的归属
将苓桂术甘汤物质基准全方、处方中茯苓、桂枝、白术、甘草单独提取液与阴性样品依次比对,色谱图见图11-14(各图横坐标以上均为全方的指纹图谱,横坐标以下依次为:茯苓提取物与茯苓阴性样品、桂枝提取物与桂枝阴性样品、白术提取物与白术阴性样品、甘草提取物与甘草阴性样品)。指纹图谱特征峰的归属结果为:指纹图谱中,无茯苓特征峰;峰5和6来自桂枝,且5为肉桂酸,6为桂皮醛;峰10和13来自白术,且峰10为白术内酯III,峰13为白术内酯II;指纹图谱中,峰1~4、7~9、11、12、14和15,共11个峰均来自甘草,且峰4为甘草苷,峰7为甘草酸。
(2)共有指纹图谱的建立
按供试品处理方法制备15批物质基准供试品,并进行HPLC色谱图分析,通过指纹图谱相似度评价系统(2.0版)评价相似度,相似度均大于0.90,结果见表14。并且建立15批物质基准指纹图谱及其共有模式图,结果见图15、16。苓桂术甘汤物质基准的共有峰信息见表15。
表14. 15批苓桂术甘汤物质基准相似度实验结果
表15.苓桂术甘汤物质基准的共有峰信息
2.2物质基准定量研究
2.2.1指标成分定量方法学考察
(1)供试品的制备
取冻干粉适量,加50%甲醇超声30min,放冷,补足失重,过膜,即得供试品。
(2)桂皮醛的含量测定
①色谱条件
Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),检测波长为290nm,进样量为10μL,将0.05%-磷酸水-乙腈(38:62,V/V),流速为1.0mL/min,柱温为25℃。
②专属性考察
称取处方饮片,按供试品处理项下得全方供试品;称取桂枝阴性处方,同法制得桂枝阴性供试品;吸取上述各供试品及桂皮醛对照品溶液各10μL,采用HPLC进样分析。结果表明,桂皮醛阴性无干扰。
③线性关系考察
取桂皮醛对照品,加乙腈稀释,得到浓度为1.01mg/mL的桂皮醛溶液,以此为母液,用甲醇分别制备浓度为1.01,2.02,5.06,10.12,20.24,50.59μg/mL的标准品溶液。吸取上述六种浓度的对照品溶液10μL,注入HPLC进样系统,以桂皮醛浓度-峰面积为坐标轴,绘制标准曲线Y=119.36X-10.513,r=0.9999,桂皮醛在1.01~50.59μg范围内线性良好。
④供试品前处理方法的考察
a.提取方法的考察
取4份5mL水提液冻干所得冻干品,分别加入甲醇25mL,加热回流提取30min,放冷后补足失重,收集提取液。另取4份5mL水提液冻干所得冻干品,分别加入甲醇25mL,超声提取30min,处理方法同上。另取4份5mL水提液冻干所得冻干品,分别加入甲醇25mL,60℃水浴热浸提取30min,处理方法同上。另取4份5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀。过膜后,采用HPLC进样分析,测定桂皮醛含量,结果见表16。实验结果表明,复溶法提取较为完全,故选择复溶法为提取方法。
表16.桂皮醛提取方法考察结果(n=4)
b.稀释溶剂考察
取4份5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水混匀后,取1mL至5mL容量瓶中,分别用加入甲醇,70%甲醇,50%甲醇至刻度,混匀,过0.45μm微孔滤膜后,注入HPLC进样系统,测定桂皮醛含量,结果见表17。实验结果表明,三种溶剂提取效果相当,为了方便实验操作,选择甲醇作为稀释溶剂。
表17.桂皮醛稀释溶剂考察结果(n=4)
⑤供试品的处理
取5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀,过膜,即得桂皮醛供试品。
⑥精密度实验
分别精密吸取低、中、高浓度的对照品溶液各10μL,按确立的HPLC分析方法测定,重复进样6次。结果表明,仪器精密度良好。
⑦重复性实验
取冻干品,按供试品处理方法制得供试品,平行6份,按确立的HPLC分析方法测定。结果表明,该方法重复性良好,5mL水提液冻干所得冻干品所含桂皮醛0.185mg。
⑧稳定性实验
按供试品处理方法制得供试品,取同一供试品溶液,分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24h,进行HPLC分析测定,实验结果表明,该样品在24h内有良好的稳定性。
⑨加样回收率实验
取已知含量的冻干品,共9份,分别加入相当于供试品中桂皮醛成分含量的50%、100%、150%的对照品,制得供试品,平行处理3份,进行HPLC分析测定,实验结果表明,该方法测定桂皮醛的含量回收率高,准确性好。
(3)肉桂酸的含量测定
①色谱条件
Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),285nm作为检测波长,进样量为10μL,将0.05%磷酸水-乙腈(65:35,V/V)作为流动相,流速为1.0mL/min,柱温为25℃。
②专属性考察
称取处方饮片,按供试品处理项下得全方供试品;称取桂枝阴性处方,同法制得桂枝阴性供试品;吸取上述各供试品及肉桂酸对照品溶液各10μL,采用HPLC进样分析。结果表明,肉桂酸阴性无干扰。
③线性关系考察
取肉桂酸对照品,加甲醇溶解,得到浓度为1.00mg/mL的肉桂酸溶液,以此为母液,制备分别浓度为1.00,2.01,5.02,10.04,20.08,50.20μg/mL的标准品溶液。吸取上述六种浓度的对照品溶液10μL,注入HPLC进样系统,以肉桂酸浓度-峰面积为坐标轴,绘制标准曲线Y=73.684X-37.492,r=0.9999,肉桂酸在1.00~50.20μg范围内线性良好。
④供试品前处理方法的考察
a.提取方法的考察
取4份5mL水提液冻干所得冻干品,分别加入甲醇25mL,加热回流提取30min,放冷后补足失重,收集提取液。另取4份5mL水提液冻干所得冻干品,分别加入甲醇25mL,超声提取30min,处理方法同上。另取4份5mL水提液冻干所得冻干品,分别加入甲醇25mL,60℃水浴热浸提取30min,处理方法同上。另取4份5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀。过膜后,采用HPLC进样分析,测定肉桂酸含量,结果见表18。结果表明,四种提取方法提取效果相当,为方便操作,故选择复溶法作为提取方法。
表18.肉桂酸提取方法考察结果(n=4)
b.稀释溶剂的选择
取4份5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水混匀后,取1mL至5mL容量瓶中,分别用加入甲醇,70%甲醇,50%甲醇至刻度,混匀,过0.45μm微孔滤膜后,注入HPLC进样系统,测定肉桂酸含量,结果见表19。结果表明,三种溶剂提取效果相当,为了方便实验操作,选择甲醇作为稀释溶剂。
表19.肉桂酸稀释溶剂考察结果(n=4)
⑤供试品的处理
取5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀,过膜,即得肉桂酸供试品。
⑥精密度实验
分别精密吸取低、中、高浓度的对照品溶液各10μL,按确立的HPLC分析方法测定,连续进样6次,结果表明,仪器精密度良好。
⑦重复性实验
取冻干品,按供试品处理方法制备供试品,平行6份,按确立的HPLC分析方法测定。结果表明,该方法重复性良好,5mL水提液冻干所得冻干品所含肉桂酸0.086mg。
⑧稳定性实验
按供试品处理方法制备供试品,取同一供试品溶液,分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24h,进行HPLC分析测定。结果表明,该样品在24h内有良好的稳定性。
⑨加样回收率实验
取已知含量的冻干品,共9份,分别加入相当于供试品中肉桂酸成分含量的50%、100%、150%的对照品,按供试品处理方法制得供试品,平行处理3份,进行HPLC分析测定。结果表明,该方法测定肉桂酸的含量回收率高,准确性好。
(4)甘草苷的含量测定
①色谱条件
Welchrom C18色谱柱(250mm×4.6mm),237nm作为检测波长,进样量为10μL,梯度洗脱,将0.05%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)作为流动相(0min,A:B=81:19;8min,A:B=81:19;35min,A:B=50:50;36min,A:B=0:100;40min,A:B=81:19),流速为1.0mL/min,柱温为25℃。
②专属性考察
称取处方饮片,按供试品处理项下得全方供试品;称取甘草阴性处方,同法制得甘草阴性供试品;吸取上述各供试品及甘草苷对照品溶液各10μL,采用HPLC进样分析。结果表明,甘草苷阴性无干扰。
③线性关系考察
取甘草苷对照品,加甲醇溶解,得到浓度为0.94mg/mL甘草苷的溶液,以此为母液,制备分别浓度为2.35,4.69,9.38,18.77,46.92,93.84μg/mL的标准品溶液。吸取上述六种浓度的对照品溶液10μL,注入HPLC进样系统,以甘草苷浓度-峰面积为坐标轴,绘制标准曲线Y=22.941X-9.2398,r=1,甘草苷在2.35~93.84μg范围内线性良好。
④供试品前处理方法的考察
a.提取方法的考察
取4份5mL水提液冻干所得冻干品,分别加入甲醇25mL,加热回流提取30min,放冷后补足失重,收集提取液。另取4份5mL水提液冻干所得冻干品,分别加入甲醇25mL,超声提取30min,处理方法同上。另取4份5mL水提液冻干所得冻干品,分别加入甲醇25mL,60℃水浴热浸提取30min,处理方法同上。另取4份5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀。过膜后,采用HPLC进样分析,测定甘草苷含量,结果见表20。结果表明,四种提取方法提取效果相当,为方便操作,故选择复溶法作为提取方法。
表20.甘草苷提取方法考察结果(n=4)
b.稀释溶剂的选择
取4份5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水混匀后,取1mL至5mL容量瓶中,分别用加入甲醇,70%甲醇,50%甲醇至刻度,混匀,过0.45μm微孔滤膜后,注入HPLC进样系统,测定甘草苷含量,结果见表21。结果表明,三种溶剂提取效果相当,为了方便实验操作,选择甲醇作为稀释溶剂。
表21.甘草苷稀释溶剂考察结果(n=4)
⑤供试品的处理
取5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀,过膜,即得甘草苷供试品。
⑥精密度实验
分别精密吸取低、中、高浓度的对照品溶液各10μL,按确立的HPLC分析方法测定,重复进样6次,结果表明,仪器精密度良好。
⑦重复性实验
取冻干品,按供试品处理方法制备供试品,平行6份,进行HPLC分析测定,结果表明,该方法重复性良好,5mL水提液冻干所得冻干品所含甘草苷0.712mg。
⑧稳定性实验
按供试品处理方法制备供试品,取同一供试品溶液,分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24h,进行HPLC分析测定,结果表明,该样品在24h内有良好的稳定性。
⑨加样回收率实验
取已知含量的冻干品,共9份,分别加入相当于供试品中甘草苷成分含量的50%、100%、150%的对照品,按供试品处理方法制备供试品溶液,平行处理3份,进行HPLC分析测定,结果表明,该方法测定甘草苷的含量回收率高,准确性好。
2.2.2物质基准含量测定
(1)供试品的制备
取15批物质基准水提液各5mL,分别放入10mL离心管中,-80℃冷冻过夜,在冻干机中冷冻干燥,加5mL溶解后,取1mL,用甲醇定容至5mL容量瓶中,过微孔滤膜,即得。
(2)物质基准含量测定
采用HPLC分析方法对15批物质基准进行含量测定,实验结果见表22。甘草苷转移率为49.69%~66.58%,在均值56.80%的70%~130%(39.76%~73.84%)之间;桂皮醛转移率为4.86%~7.54%,在均值5.96%的70%~130%(4.17%~7.75%)之间;肉桂酸转移率为36.01%~57.21%,在均值49.63%的70%~130%(34.74%~64.52%)之间。
表22.物质基准含量测定结果(n=3)
(3)物质基准的干膏得率测定
取水提液25mL,至蒸发皿中,水浴蒸干后105℃烘箱加热5h,取出,放干燥器中冷却30min,称定重量,继续105℃烘箱加热1h,取出,放干燥器中冷却30min,称定重量,重复上述步骤至连续两次测定的质量差不超过5mg。干膏得率的范围为16.15%~17.74%,在均值16.89%的70%~130%(11.82~21.95%)之间。
综上,本发明确定了苓桂术甘汤物质基准制备工艺、定性和定量的质量评价方法,可用于该方的全面质量控制。本发明围绕指标成分建立特征性的指纹图谱,对苓桂术甘汤物质基准的成分概况及其物质传递属性进行控制,既保证了临床用药的安全、有效和稳定,也为经典名方复方制剂的进一步的开发打下坚实的基础。
需要说明的是,本发明在长期大量的实验研究中,进行了大量关于色谱条件的研究实验,但不能在此一一赘述,以上仅以典型的实验作为说明。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种苓桂术甘汤物质基准的质量检测方法,其特征在于,所述苓桂术甘汤物质基准其制备工艺为:按重量份配比称取茯苓55.2份、桂枝41.4份、白术41.4份和甘草27.6份,加水1200份浸泡,采用煎药壶,加盖提取一次,先武火煎煮5~40min,再文火煎煮5~100min,将苓桂术甘汤的水提液进行冷冻干燥;所述质量检测方法包括以下步骤:
步骤一:取待测苓桂术甘汤物质基准,加水溶解后,再加甲醇定容,离心,过膜即得供试品溶液;
步骤二:建立待测苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱,其中色谱条件为:0.05%磷酸水A-乙腈B作为流动相,洗脱程序为:
色谱柱为Welchrom C18,检测波长为220nm,流速为1mL/min,柱温为25℃,进样量为10μL;
步骤三:确定待测苓桂术甘汤物质基准的指纹图谱是否包含以下色谱峰,判断待测苓桂术甘汤质量是否合格:
2.根据权利要求1所述的质量检测方法,其特征在于,还包括:
测定待测苓桂术甘汤物质基准中桂皮醛含量的步骤,测定的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,检测波长为290nm,进样量为10μL,将体积比为38:62的0.05%-磷酸水-乙腈作为流动相,流速为1.0mL/min,柱温为25℃;供试品的处理方法为:取5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀,过膜,即得;
测定待测苓桂术甘汤物质基准中肉桂酸含量的步骤,测定的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,检测波长为285nm,进样量为10μL,将体积比为65:35的0.05%磷酸水-乙腈作为流动相,流速为1.0mL/min,柱温为25℃;供试品的处理方法为:取5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀,过膜,即得;
测定待测苓桂术甘汤物质基准中甘草苷含量的步骤,测定的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,检测波长为237nm,进样量为10μL,梯度洗脱,将0.05%磷酸水溶液A-乙腈B作为流动相,洗脱条件:0min,A:B=81:19;8min,A:B=81:19;35min,A:B=50:50;36min,A:B=0:100;40min,A:B=81:19,流速为1.0mL/min,柱温为25℃;供试品的处理方法为:取5mL水提液冻干所得冻干品,加入5mL水溶解,取1mL,加甲醇定容至5mL,混匀,过膜,即得。
3.根据权利要求1所述的质量检测方法,其特征在于,还包括:
茯苓薄层鉴别的步骤,具体为:
取待测苓桂术甘汤物质基准1g,加乙醚25mL,超声30min,过滤,蒸干滤液,加0.5mL三氯甲烷使残渣溶解,作为苓桂术甘汤物质基准供试品;取茯苓阴性处方,同法处理得到茯苓阴性供试品;另取茯苓对照药材1g,同法制成茯苓对照药材溶液;
照薄层色谱法试验,展开剂为95:5的30~60℃的石油醚-丙酮,吸取上述溶液各20μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,置紫外灯365nm下检视;
如供试品与茯苓对照药材在Rf值相等处有相同颜色的斑点,茯苓阴性供试品无斑点,则质量合格;
桂枝薄层鉴别的步骤,具体为:
取待测苓桂术甘汤物质基准1g,加75%乙醇4mL,密塞,超声处理30min,过滤,取续滤液作为苓桂术甘汤物质基准供试品;取桂枝阴性处方,同法处理得到桂枝阴性供试品;另将桂皮醛对照品加乙醇溶解得到浓度为1μL/mL的溶液,作为桂皮醛对照品溶液;
照薄层色谱法试验,展开剂为17:3的60~90℃的石油醚-乙酸乙酯,吸取上述溶液各10μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,喷以二硝基苯肼乙醇试液;
如供试品与桂皮醛对照品在Rf值相等处有橙黄色斑点,桂枝阴性供试品无斑点,则质量合格;
白术薄层鉴别的步骤,具体为:
取待测苓桂术甘汤物质基准1g,加甲醇5mL,超声提取50min,冷却至室温,过滤,取续滤液,作为苓桂术甘汤物质基准供试品;取白术阴性处方,同法制成白术阴性对照溶液;另取白术对照药材0.5g,同法制成白术对照药材溶液;
照薄层色谱法试验,展开剂为2:1:1:0.1的环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸,吸取上述溶液各10μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,置紫外灯365nm下检视;
如供试品与白术对照药材在Rf值相等处有相同颜色斑点,白术阴性供试品无斑点,则质量合格;
甘草薄层鉴别的步骤,具体为:
取待测苓桂术甘汤物质基准1g,加40mL乙醚,回流提取1h,过滤,药渣加30mL甲醇,回流提取1h,过滤,蒸干滤液,加40mL水使残渣溶解,用20mL正丁醇萃取,重复操作2次,将正丁醇液合并,加水洗涤3次,蒸干正丁醇液,加5mL甲醇使残渣溶解,作为苓桂术甘汤物质基准供试品;取甘草阴性处方,同法处理得到甘草阴性对照溶液;另取甘草对照药材lg,同法制成甘草对照药材溶液;另将甘草酸单铵盐加甲醇溶解得到浓度为2mg/mL的溶液,作为甘草酸单铵盐对照品溶液;
照薄层色谱法试验,展开剂为15:1:1:2的乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水,吸取上述溶液各10μL,点于硅胶G板上,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,于105℃加热约40min至显色淸晰,置紫外光灯365nm下检视;
如供试品,甘草对照药材和甘草酸单铵盐对照品在Rf值相等处有相同颜色斑点,甘草阴性供试品无斑点,则质量合格。
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