CN115634252B - 一种利尿剂及其质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利尿剂及其质量控制方法。本发明首先提供了一种利尿剂，包括泽泻、香加皮、茯苓、大腹皮、冬瓜皮、益母草、关黄柏水提取物部分及桂枝、陈皮、苍术、姜皮、椒目的醇提取物部分。经验证，上述利尿剂具有良好的利尿效果，并且对碳酸酐酶活性没有明显影响。另外，本发明还提供了上述药物制剂利尿剂的指纹图谱建立方法，具有操作简便、准确性高的特点，用于上述药物制剂利尿剂的质量控制具有重要意义。

Description

一种利尿剂及其质量控制方法

技术领域

本发明属于药物制剂及质量控制技术领域，具体涉及一种具有利水渗湿功效的利尿剂、所述利尿剂的指纹图谱建立方法及质量控制方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

肾炎消肿片为用于急、慢性肾炎脾虚湿肿证侯的治疗药物，具有健脾渗湿、通阳利水的功效。其主要药味组成为桂枝、泽泻、陈皮、香加皮、苍术、茯苓、姜皮、大腹皮、关黄柏、椒目、冬瓜皮、益母草；上述药方中，桂枝与泽泻同用，可用于膀胱气化不行，水肿、小便不利；陈皮与苍术同用并佐以姜皮，可用于中焦寒湿脾胃气滞；香加皮、大腹皮、椒目、关黄柏、冬瓜皮、益母草也均具有利水消肿之功，可用于浮肿胀满、小便不利。全方十二味共同发挥健脾渗湿，通阳利水的作用。

现有肾炎消肿片生产采用上述药味的水煎提取物作为主要活性，在中药制剂研发生产中，生产工艺的研究对于保障药品质量至关重要，为了进一步提高药物活性，增加企业效益，本领域常需要进行制药工艺优化。另外，针对中药制剂的改进建立稳定的质量控制标准是保证药物疗效的生产工艺的重要环节。特别是复方中药的质量控制方法应当能够合理体现发挥药效活性的全成分。

发明内容

基于上述研究背景，本发明提供了一种利尿剂，所述利尿剂基于该肾炎消肿片的药味组合进行提取加工，相比现有利尿药物有效减弱钙离子的流失，且不影响碳酸酐酶的活性。另外，本发明还提供了上述利尿剂的质量控制方法。

为了实现上述技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种利尿剂，所述利尿剂中包括水提取物及醇提取物，所述水提取物的原料为以下重量份的药味：3～7份泽泻、3～7份香加皮、3～7份茯苓、3～7份大腹皮、3～7份冬瓜皮、3～7份益母草、3～7份关黄柏；所述醇提取物的原料为以下重量份的药味：3～7份桂枝、3～7份陈皮、3～7份苍术、3～7份姜皮、1～5份椒目。

优选的，上述利尿剂中，所述水提取物及醇提取物按照上述生药的药味比例进行混合。各药味的重量份数基于同样的重量单位进行调整，如g、10g、20g或50g等，具体药味用量可根据实际生产需求进行调整。本发明一种具体的实施方式中，所述利尿剂日服剂量为2.27g，对应生药量为18g。

优选的，上述水提取物的制备方法如下：称取上述重量份的药味混合后加水保持微沸状态进行煎煮，煎煮后过滤得到滤液，将所述滤液进行浓缩得到比重为1.05-1.08(60℃测)的浸膏。

进一步的，上述水提取过程中，煎煮的次数可依据药物提取效果进行调整，本发明效果较好的实施方式中，所述水提取过程包括两次煎煮，第一次加水量为为药材体积的8-10倍，煎煮时间为2-3h，第二次加水量为药材体积的6-8倍，煎煮时间为1-2h。

优选的，上述醇提取物的制备方法如下：称取上述重量份的药味混合后加入醇溶液进行回流提取，所述回流提取温度为100-130℃；过滤得滤液进行减压浓缩至无醇味，干燥得到所述醇提取物浸膏。

进一步的，所述醇溶液优选采用乙醇的水溶液，浓度为60-80％。

进一步的，所述回流提取的次数为2～3次，更进一步优选的，为两次，第一次提取加入醇溶液的量为药材体积的6-8倍，提取时间为1-2h，第二次提取加入醇溶液的量为药材体积的4-6倍，提取时间为0.5-1h。

本发明另外一个技术目的旨在建立上述利尿剂的指纹图谱检测方法，并通过该方法对该利尿剂进行质量控制，确保批与批之间的稳定性，降低批间差异。经验证，以下指纹图谱构建方法操作简单，精密度高、稳定性好、重复性好、准确度高，应用于利尿剂的质量控制可有效保障生产工艺稳定。

本发明第二方面，提供第一方面所述利尿剂的指纹图谱建立方法，以木兰花碱、盐酸益母草碱、橙皮苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、4-甲氧基水杨醛、桂皮醛、6-姜辣素、2-3-乙酰泽泻醇C、苍术素作为指标成分，基于高效液相-紫外检测法进行检测，液相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为0.05-0.15％磷酸水，采用梯度洗脱程序进行分离。

优选的，所述高效液相检测的色谱柱为PhenomenexXB-C₁₈/>色谱柱。

优选的，所述高效液相色谱检测参数中，检测柱温为28～32℃。

优选的，所述紫外检测的波长为200m～360nm nm；进一步的，为208nm、246nm、280nm、340nm中的一种；更进一步的，所述检测波长为246nm。

本发明效果较好的一种实施方式中，所述梯度洗脱程序如下表所示：

优选的，上述指纹图谱建立方法中，还包括对供试品及对照品的配制；所述供试品的配制方式如下：将待测利尿剂研细，加入甲醇超声混匀后定量；所述对照品的配置方式如下：称取木兰花碱、盐酸益母草碱、橙皮苷、盐酸小檗碱、6-姜辣素对照品加入甲醇溶解得到所述对照品溶液，其中，木兰花碱、盐酸益母草碱、橙皮苷、盐酸小檗碱、6-姜辣素的质量比为8～12：0.02～0.07：75～85：6～9:12～16。

上述供试品及对照品的浓度可依据仪器的检测限等因素进行常规调整，本发明提供的一种实施方式中，所述对照品的浓度为0.1mg/mL，所述供试品的浓度为0.08mg/mL；所述供试品及对照品超声的时间为20～40min，进一步的，为30min。

本发明第三方面，提供一种第一方面所述利尿剂的质量控制方法，包括如下步骤：将待测样品配置成供试品，按照第二方面所述指纹图谱构建方法构建供试品指纹图谱并与对照指纹图谱进行比对，两者相似度在0.90及以上视为质量合格。

优选的，上述质量控制方法中，所述供试品中上述指标成分的色谱峰应当与对照质谱图谱中的保留时间一致，所述相似度的比对可通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，采用Mark峰匹配方式进行。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为对照指纹图谱；

其中，各色谱峰归属如下：1号峰为木兰花碱，2号峰为盐酸益母草碱，3号峰为橙皮苷，4号峰为盐酸巴马汀，5号峰为盐酸小檗碱，6号峰为4-甲氧基水杨醛，7号峰为桂皮醛，8号峰为.6-姜辣素，9号峰为2-3-乙酰泽泻醇C，10号峰为苍术素；

图2为供试品在190～800nm波长下进行扫描的HPLC 3D图；

图3为波长208nm、246nm、280nm、340nm检测的HPLC对比图；

图4为乙腈-水梯度系统和乙腈-0.1％磷酸水梯度系统的考察结果图；

图5为震荡、超声和回流提取法色谱图；

图6为甲醇、80％甲醇、乙醇、水溶液作为提取溶剂的考察色谱图；

图7为提取时间：15min、30min、60min的考察色谱图；

图8为取样量1.0g、2.0g、4.0g的考察色谱图；

图9为Agilent、Phenomenex、Thermo三种品牌色谱柱的考察色谱图；

图10为25℃、30℃、35℃分离柱温的考察色谱图；

图11为流速0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min的考察色谱图；

图12为Waters及安捷伦高效液相色谱仪的考察色谱图；

图13为精密度验证的原始图谱；

图14为精密度验证匹配后图谱；

图15为稳定性验证的原始图谱；

图16为稳定性验证的匹配后图谱；

图17为重复性验证的原始图谱；

图18为重复性验证的匹配后图谱；

图19为利水渗湿制剂的液相色谱图；

图20为利水渗湿制剂的总离子流图(TIC)；

图21为利水渗湿制剂的总离子流图(BPC)；

图22为中剂量及高剂量组尿量变化直方图；

图23为钠离子、氯离子、钾离子、钙离子排泄图；

图24为空白对照组(Ctrl)、呋塞米组(Furo)、中剂量组(M)、高剂量组(H)和乙酰唑胺组(Acet)组的碳酸酐酶活性。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1.利尿剂的制备

1.1水提取物

取泽泻、香加皮、茯苓、大腹皮、冬瓜皮、益母草、关黄柏各50g，加3500ml纯化水，回流提取2.5h，过滤；药渣加2800ml纯化水，回流提取1.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩后，浸膏比重1.06(60℃测)。

1.2醇提取物

取桂枝50g、陈皮50g、苍术50g、姜皮50g、椒目30g，加70％乙醇1840ml，回流提取1h，过滤，药渣加70％乙醇1380提取0.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩回收乙醇，至无醇味。

合并上述浸膏，减压干燥，得利尿剂73g。

2.质量控制方法建立

在本实施例中，基于高效液相色谱仪建立指纹图谱检测方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，对处方中指标成分进行指认，共指认10个色谱峰，分别为木兰花碱、盐酸益母草碱、橙皮苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、4-甲氧基水杨醛、桂皮醛、6-姜辣素、2-3-乙酰泽泻醇C、苍术素。

3.色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速1ml/min；柱温30℃；检测波长246nm。

3.1对照品溶液的制备

精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

3.2供试品溶液的制备

取上述利尿剂约2.0g，研细，精密称定，精密加入甲醇溶液25mL，称定重量，超声30分钟，取出放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

3.3测定法

分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录100分钟的色谱图，即得。供试品指纹图谱与对照指纹图谱应在相应保留时间处出现相同色谱峰，两者相似度应不低于0.90。对照指纹图谱见下图1。

4.实验材料与条件

4.1实验材料

仪器：LC-20AT高效液相色谱仪(SPD-M20A光电二极管阵列紫外可见光检测器、LabSolutions色谱工作站，岛津中国有限公司)；BS124S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

试剂：乙腈(色谱纯，山东禹王和天下新材料有限公司，批号：2021041078)；磷酸(色谱纯，批号：)；甲醇(色谱纯，山东禹王和天下新材料有限公司，批号20210412166)；水为娃哈哈水。

4.2色谱条件与系统适用性实验

4.2.1检测波长的选择

采用光电二极管阵列紫外可见光检测器，供试品在190～800nm波长下进行扫描，通过3D视图(图2)和等吸收图谱进行分析，结果色谱峰在200m～360nm波长范围内，信息量较大。选择波长208nm、246nm、280nm、340nm进行分析，结果显示246nm测定得到色谱峰较多，分布均匀，分离度较好，因此暂定检测波长为246nm(图3)。

4.2.2流动相比例的考察

选择两种流动相系统：乙腈-水梯度系统和乙腈-0.1％磷酸水梯度系统(图4)，结果以乙腈-0.1％磷酸水梯度系统为佳，各色谱峰分离度好，保留时间适中，故选择乙腈-0.1％磷酸水梯度系统为流动相。

4.3对照品溶液的制备

精密称取木兰花碱、盐酸益母草碱、橙皮苷、盐酸小檗碱、6-姜辣素对照品适量，加甲醇制成每1mL含木兰花碱50ug、盐酸益母草碱0.25mg、橙皮苷0.4mg、盐酸小檗碱40ug、6-姜辣素60ug的溶液，即得。

4.4.供试品溶液的制备

取上述利尿剂约2.0g，研细，精密称定，精密加入甲醇溶液25mL，称定重量，超声30分钟，取出放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

4.4.1提取方式的考察

选择了震荡、超声和回流提取法三种提取方法。结果，震荡和超声两种方法提取的有效成分相近，且峰面积相差不大(图5)，故选择超声法提取。

4.4.2提取溶剂的考察

选择四种溶剂：甲醇、80％甲醇、乙醇、水溶液。结果，甲醇溶液提取的有效成分最多，且峰面积较大(图6)，故选甲醇溶液作为提取溶剂。

4.4.3提取时间的考察

选择三个不同的超声时间：15min、30min、60min，结果以超声30min提取的大多数有效成分峰面积最大(图7)，故选择超声时间为30min。

4.4.4取样量的考察

选择三个不同的取样量：1.0g、2.0g、4.0g，结果以2.0g提取较完全且色谱图整体分布均匀(图8)，故选择取样量为2.0g。

4.5.色谱柱考察

选择了Agilent、Phenomenex、Thermo三种品牌进行了考察，结果PhenomenexXB-C₁₈/>色谱柱分离效果及峰形较好(图9)，故选用Phenomenex/>XB-C₁₈ 色谱柱。

4.6.柱温的考察

柱温对分离的有一定的影响，以30℃柱温较为合适(图10)。

4.7.流速的考察

流速对分离的有一定的影响，以1.0mL/min流速较为合适(图11)。

4.8.仪器的考察

选择不同品牌的高效液相色谱仪进行测定，经测定，特征峰数量无明显差异(图12)。

4.9.方法学验证

4.9.1精密度试验

取上述利尿剂样品，按供试品溶液的制备方法制备，连续进样6次，检测指纹图谱，相似度计算结果见图13、图14。结果表明各色谱峰的相似度均符合指纹图谱的要求。

时间窗宽度：0.10对照图谱生成方法：平均数

4.9.2稳定性试验

取该利尿剂样品，按3.2部分供试品溶液的制备方法制备，分别在0、4、8、12、18、24小时检测指纹图谱，相似度计算结果见图15、图16。结果表明各色谱峰的相似度均符合指纹图谱的要求。

时间窗宽度：0.10对照图谱生成方法：平均数

4.9.3重复性试验

取六批利尿剂样品，按3.2部分供试品溶液的制备方法制备供试品6份，检测指纹图谱，相似度计算结果见图17及图18。结果表明各色谱峰的相对保留时间和色谱峰的相似度均符合指纹图谱的要求。

时间窗宽度：0.10 对照图谱生成方法：平均数

4.10色谱峰指认

取该利尿剂进行UHPLC-Q-TOF-MS分析。采用四极杆飞行质谱Agilent 6546 LC/Q-TOF和Agilent 1290 Infinity II UHPLC联用技术的正负电喷雾(ESI)模式下对样品进行定性分析。

使用Agilent Poroshell 120 EC-C18,2.1*100mm,2.7um色谱柱，流动相由水-磷酸(100:0.1,v/v)(A)和乙腈(B)组成。用于质谱分析的仪器参数如下：在35psig、325℃和8.0L/min的流速下，使用氮气作为雾化器气体。进样体积为2μL，流速为0.1mL/min，柱温保持在30℃。所有数据均使用mass hunter数据分析采集和处理。色谱条件如下：

利尿剂主要成分HPLC-Q/TOF-MS分析结果

5.利水渗湿作用研究

通过研究该利尿剂对盐水负荷模型大鼠的利尿及对钠、钾、氯、钙等的排泄作用，验证该利尿剂的在利水渗湿的功效。

5.1仪器、试药与动物

仪器:TgL-18型高速冷冻离心机(四川蜀科仪器有限公司)；AC9801型电解质分析仪(江苏奥迪康医学科技股份有限公司)；

试药:0.9％氯化钠注射液

动物:SPF级SD大鼠，雄性，6周龄，体质量180～200g。购自辽宁长生生物技术股份有限公司。所有大鼠置代谢笼中适应性喂养48h后，禁食不禁水18h，每只大鼠均按2.5mL/100g灌胃0.9％氯化钠注射液，使大鼠体内水平衡，排尽膀胱内余尿，收集2h内尿液。尿量为给水量的40％以上者为合格。

5.2方法

取模型大鼠60只，随机分为模型组，呋塞米组(0.01g/kg)以及该利尿剂中、高剂量组(9.45，28.35g/kg)，各12只。排空膀胱内残余尿后，每组均以0.9％氯化钠溶液50mL/kg灌胃，复制盐水负荷大鼠模型。灌胃15min后，各给药组均按10mL/kg灌胃，模型组给予等体积生理盐水，收集6h内尿液。每周1次，持续4周。

5.3观察指标

累积尿量：灌胃结束后，用拇指挤压大鼠小腹以排空膀胱内残余尿，再分别放入各自的代谢笼中，留取6小时尿液。期间，各组大鼠均为禁食禁水。

实验室指标：各组大鼠给药后，立即放入代谢笼中，每1h、2h、3h、4h、6h收集1次尿液，共计5次，测量各时间点的尿量，检测各组大鼠各时间点尿液的钠氯钾钙的量，计算离子浓度。实验完成后，以3％的戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠，留取血液，收集上层血清，测定各组大鼠血清样本中碳酸肝酶活性等的含量。

5.4统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件分析。计量资料以X±s表示，两样本均数比较采用t检验，多组均数比较进行方差齐性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

5.5结果

5.5.1尿量的变化

第1、2周中剂量及高剂量组与空白对照组无显著差异。第3、4周开始，高剂量组的尿量显著高于空白对组。说明长期给予该组合物口服，能够发挥利尿效果。(*与空白对照组相比，p<0.05)，如图22所示。

5.5.2促离子排泄作用

分别对第1、2、4周的尿离子排泄量进行检测。如图23所示，在钠离子的排泄方面，高剂量与呋塞米组间差异始终不存在统计学意义。在钾离子排泄方面，高剂量组显著高于呋塞米组。在氯离子的排泄方面，中剂量与高剂量组于第4周与呋塞米组的氯排泄量间不存在统计学意义。在钙离子排泄方面，药用组合物钙排泄量显著低于呋塞米组。这表明该组合物在钠氯的排泄作用上与呋塞米之类的袢利尿剂相近，在钾的排泄作用上要强于呋塞米。同时，该组合物在钙的排泄方面要显著弱于呋塞米。

5.5.3对碳酸酐酶活性的影响

当高剂量组大鼠与呋塞米组大鼠6小时尿量间差异不具有统计学意义后，本实施例对空白对照组、呋塞米组、中剂量组、高剂量组和乙酰唑胺组(Acet)大鼠外周血红蛋白碳酸酐酶活性进行了检测，发现各组与空白对照组相比，碳酸酐酶活性均有不同程度的抑制(图24)，但仅乙酰唑胺组与其存在显著差异。说明该组合物发挥利尿作用的机制并非通过抑制碳酸酐酶活性产生的(*与空白对照组相比，p<0.05)。

5.6讨论

实验表明该组合物利尿作用显著，促离子排泄方面，该组合物在钠氯的排泄作用上与呋塞米之类的袢利尿剂相近，在钾的排泄作用上要强于呋塞米，而在钙的排泄方面要显著弱于呋塞米。而其发挥利尿作用的机制并非通过抑制碳酸酐酶活性产生的。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种利尿剂的质量检测方法，所述利尿剂中包括水提取物及醇提取物，所述水提取物的原料为以下重量份的药味：3~7份泽泻、3~7份香加皮、3~7份茯苓、3~7份大腹皮、3~7份冬瓜皮、3~7份益母草、3~7份关黄柏；所述醇提取物的原料为以下重量份的药味：3~7份桂枝、3~7份陈皮、3~7份苍术、3~7份姜皮、1~5份椒目；

所述检测方法基于高效液相-紫外检测法进行检测，液相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为0.05-0.15%磷酸水，采用梯度洗脱程序进行分离；

所述高效液相检测的色谱柱为Phenomenex Kinetex^® XB-C₁₈ 100Å色谱柱；

所述高效液相色谱检测参数中，检测柱温为28~32℃；

所述紫外检测的波长为200 ~360nm；

所述检测方法中，还包括对供试品及对照品的配制；

所述供试品的配制方式如下：将待测利尿剂研细，加入甲醇超声混匀后定量；

所述对照品的配置方式如下：称取木兰花碱、盐酸益母草碱、橙皮苷、盐酸小檗碱、6-姜辣素对照品加入甲醇溶解得到所述对照品溶液，其中，木兰花碱、盐酸益母草碱、橙皮苷、盐酸小檗碱、6-姜辣素的质量比为8~12：0.02~0.07：75~85：6~9:12~16；

将供试品指纹图谱与对照指纹图谱进行比对，两者相似度在0.90及以上视为质量合格；

所述供试品中上述指标成分的色谱峰与对照指纹图谱中的保留时间一致，所述相似度的比对通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算。

2.权利要求1所述利尿剂的质量检测方法，其特征在于，所述紫外检测的波长为208nm、246nm、280nm、340nm中的一种。

3.权利要求2所述利尿剂的质量检测方法，其特征在于，所述检测波长为246nm。

4.权利要求1所述利尿剂的质量检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序如下所示：

时间0～20min，流动相A为5→12%，流动相B为95→84%；

时间20～70min，流动相A为12→30%，流动相B为82→70%；

时间70～80min，流动相A为30→60%，流动相B为70→40%；

时间80～100min，流动相A为60→85%，流动相B为40→15%。