CN112798701A - 一种当归补血药物组合物的制备方法及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种当归补血药物组合物的制备方法及其检测方法，进一步优化了当归补血药物组合物的工艺，以出膏率、黄芪甲苷和阿魏酸提取总量等为指标，对物质基准对应实物制备工艺中的煎煮时间、滤过、浓缩及干燥等相关参数进行研究，摸索提取时间，浓缩方式等最佳工艺，进一步提高了阿魏酸、黄芪甲苷的含量以及产品的出膏率。通过对当归补血药物组合物检测方法进行摸索，确定了最佳的检测方法，更好的控制了产品的质量。
Description
技术领域
本发明涉及制药及药物检测领域，具体涉及一种当归补血药物组合物的制备方法及其检测方法。
背景技术
当归补血汤由当归和黄芪两味药组成，出自金元·李东垣《内外伤辨惑论》。黄芪一两，当归二钱(酒洗)，上件咀，都作一服。水二盏，煎至一盏，去渣，温服，空心食前。与现代人们的煎煮方法和计量有所差异，现依据《历代度量衡》及《中国历代度、量、衡制演变简表》对当归补血汤中“制法及用法”中的数据单位同现代的数据单位进行换算，根据经典名方目录中记载的方法，结合卫生部、国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药发〔2009〕3号)进行煎煮制备当归补血汤“经典名方物质基准”。《中国历代度、量、衡制演变简表》中记载金元时期一两相当于现今40g，一钱相当于现今4g，一盏相当于现今200～300ml，故该方为黄芪40g、当归8g，加水400～600ml，煎煮至200～300ml。当归补血汤具有补血益气的功效，主治虚阳浮法热证，也可医治妇女经期、产后血虚发热头痛等症状及痔疮溃疡久而不愈的病症。
本发明为了进一步优化当归补血药物组合物的工艺，以出膏率、黄芪甲苷和阿魏酸提取总量等为指标，对物质基准对应实物制备工艺中的煎煮时间、滤过、浓缩及干燥等相关参数进行研究，以摸索提取时间，浓缩方式等最佳工艺，进一步提高阿魏酸、黄芪甲苷的含量以及产品的出膏率。通过对当归补血药物组合物检测方法进行摸索，确定了最佳的检测方法，更好的控制了产品的质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种当归补血药物组合物的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种当归补血药物组合物的检测方法。
本发明所述的当归补血药物组合物的制备方法具体为：取黄芪300～500份、当归70～90份，置于9L电子煎药罐中，加水4000～6000ml，浸泡20～60min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮40～80分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度45～75℃条件下浓缩至100～400ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。
优选的，本发明所述的当归补血药物组合物的制备方法具体为：取黄芪400份、当归80份，置于9电子煎药罐中，加水4000ml，浸泡40min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮60分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度55～65℃条件下浓缩至200ml，浓缩液在温度-50～-70℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的制剂。
本发明所述的药学上可接受的制剂为固体制剂或液体制剂，所述的固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂；所述液体制剂为注射制剂、口服液。
本发明所述的辅料没有限制，药学上能接受就可。
本发明所述真空减压浓缩优选真空度为0.04MPa～0.08MPa的范围内浓缩。
本发明所述的检测方法为：
性状：本品为浅黄色粉末；气微，味微甜；
黄芪薄层鉴别方法为：
取本品1.0～3.0g，加水15～35ml使溶解，超声处理20～40分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2～4次，每次15～35ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2～4次，每次20～40mL，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪饮片1～2g，加水40～60ml，煎煮20～40分钟，滤过，同法制成对照药材溶液；再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为13:7:2的三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
当归薄层鉴别方法为：
取本品1.0～3.0g，加0.5～1.5％碳酸氢钠溶液40～60ml，超声处理5～15分钟，离心，取上淸液用稀盐酸调节pH值至2～3，用乙醚振摇提取2～4次，每次15～25ml合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液；另取当归对照药材1.0～3.0g，加水40～60ml，煎煮20～40分钟，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液各10μl，供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为4：1：1：0.1的环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
检查水份的方法为：照《中国药典》2015年版四部通则0832第二法测定水分不得过12.0％；
检查浸出物的方法为：取本品2g，精密称定，照《中国药典》2015年版四部通则2201醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，醇溶性浸出物的含量应为30.0～55.0％；
指纹图谱检测：照高效液相色谱法《中国药典》2015年版四部通则0512测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱；检测波长为
柱温
理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000；梯度洗脱规定为：
时间(min) 乙腈(A) 0.1％磷酸(B)
0 20 80
60 40 60
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加
甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得；
供试品溶液的制备 精密称定本品
用
甲醇
超声
滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取
次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用
的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水
洗脱，后用95％乙醇
洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得；
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；
供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，供试品色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个共有峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以共有峰计算相似度，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。对照指纹图谱见图1。
含量测定:照高效液相色谱法《中国药典》2015年版四部通则0512测定；
黄芪含量测定：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为35：65的乙腈-水为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.4mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品
精密称定，精密加水
称定重量，以功率720W，频率40kHz超声处理
分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取
次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤
次，每次
弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法 精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注人液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得；
本品按干燥品计算，每g含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，应为0.40～2.3mg；
当归含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为17：83的乙腈-0.085％磷酸溶液为流动相；检测波长为
柱温35℃，理论板数按阿魏酸峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60～80％甲醇制成每1mL含12μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品粉末1.5～3.5g，精密称定，加水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，每g含当归以阿魏酸酸(C10H10O4)计，应为0.001～0.817mg。
优选的，本发明所述黄芪薄层鉴别方法为：取本品1.5g，加水25ml使溶解，超声处理30分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次30mL，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪饮片1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，同法制成对照药材溶液；再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为13:7:2三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
优选的，本发明所述当归薄层鉴别方法为：
取本品1.5g，加1％碳酸氢钠溶液50ml，超声处理10分钟，离心，取上淸液用稀盐酸调节pH值至2～3，用乙醚振摇提取2次，每次20ml合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液；另取当归饮片1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，同法制成对照药材溶液；再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液，照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为4：1：1：0.1的环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同颜色斑点。
优选的，本发明所述指纹图谱检测方法为：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按以下规定进行梯度洗脱；检测波长为208～230nm，柱温22～28℃；理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000；梯度洗脱规定为：
时间(min) 乙腈(A) 0.1％磷酸(B)
0 20 80
60 40 60
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品
精密称定，用
甲醇
超声
滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取
次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用
的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得；
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；
供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，供试品色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个共有峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以共有峰计算相似度，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。对照指纹图谱见图1。
进一步优选的，本发明所述指纹图谱检测方法为：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按以下规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm，柱温25℃；理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000；梯度洗脱规定为：
时间(min) 乙腈(A) 0.1％磷酸(B)
0 20 80
60 40 60
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品约2.5g，精密称定，用50％甲醇50ml超声45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用30ml的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得；
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，供试品色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个共有峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以共有峰计算相似度，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。对照指纹图谱见图1。
优选的，本发明所述黄芪含量测定方法：
照高效液相色谱法《中国药典》2015年版四部通则0512测定；
色谱条件与系统适用性试验 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为35：65的乙腈-水为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.4mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品5.0g，精密称定，精密加水50ml，称定重量，以功率720W，频率40kHz超声处理45分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次30ml，弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法测定法 精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注人液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得；
本品按干燥品计算，每g含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，应为0.40～2.3mg。
优选的，本发明所述当归含量测定方法为：照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为17：83的乙腈-0.085％磷酸溶液为流动相；检测波长为316nm；柱温35℃；理论板数按阿魏酸峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1mL含12μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品粉末2.5g，精密称定，加水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，每g含当归以阿魏酸酸(C10H10O4)计，应为0.001～0.817mg。
有益效果：
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、进一步优化了当归补血药物组合物的工艺，以出膏率、黄芪甲苷和阿魏酸提取总量、含量等为指标，对物质基准对应实物制备工艺中的煎煮时间、滤过、浓缩及干燥等相关参数进行研究，以摸索提取时间，浓缩方式等最佳工艺，进一步提高了阿魏酸、黄芪甲苷的含量以及产品的出膏率。通过对当归补血药物组合物检测方法进行摸索，确定了最佳的检测方法，更好的控制了产品的质量。
2、本发明确定了制备方法中加水量优选为4000～6000ml，最佳加水量为4000ml，提取液含量阿魏酸最高达到了0.018mg/ml，提取液含量黄芪甲苷最高达到了0.035mg/g；转移率含量阿魏酸最高达到了67.17％，转移率含量黄芪甲苷最高达到了11.14％，含固率最高达到了0.053g/mL。
3、本发明采用出膏率、阿魏酸、黄芪甲苷总量为指标，考察明火与电子煎药罐加热方式。改变了古代煎煮方式明火煎煮，确定了以电子煎药罐加热方式，通过功率控制加热效率，其控制火力作用更稳定。
4、本发明按煎煮时间因素表进行煎煮时间考察试验，确定优选煎煮时间为30～60min，最佳煎煮时间为60min，提取液含量阿魏酸最高达到了0.021mg/ml，提取液含量黄芪甲苷最高达到了0.031mg/ml；转移率含量阿魏酸最高达到了71.36％，转移率含量黄芪甲苷最高达到了10.81％，含固率最高达到了0.052g/mL。
5、本发明以黄芪甲苷、阿魏酸的含量及转移率为指标，对浓缩方法进行考察，确定了浓缩方式优先选择真空减压浓缩，真空度优选在0.04MPa～0.08MPa的范围，浓缩液阿魏酸含量最高达到了0.072mg/ml、浓缩液黄芪甲苷含量最高达到了0.272mg/ml；转移率含量阿魏酸最高达到了46.87％，转移率含量黄芪甲苷最高达到了41.31％，含固率最高达到了0.407g/mL。
6、本发明通过考察优选采用45℃～60℃的温度进行浓缩，浓缩液阿魏酸含量最高达到了0.071mg/ml、浓缩液黄芪甲苷含量最高达到了0.272mg/ml；转移率含量阿魏酸最高达到了39.99％，转移率含量黄芪甲苷最高达到了34.90％，含固率最高达到了0.412g/mL。
7、本发明通过取滤过工艺进行考察，将提取液进行冷冻干燥，结果冻干粉不发泡不融化，干膏粉质地疏松。
8、本发明从煎煮体积角度分析，三批工艺验证中间体体积均值为2500ml，与原文考证终点2000ml接近，证明工艺煎煮时间确定合理。
9、本发明从阿魏酸、黄芪甲苷总量上分析，三批验证提取液与干膏粉数据均基本平行，且工艺过程中物质传递损失较小；从浸出物、水分上分析，三批验证干膏粉无明显差异。
10、本发明从指纹图谱上分析，峰1、3、4、5、6、7、8、9、10为黄芪色谱峰，峰2、为当归色谱峰。暂以1号峰为参照峰计算相对保留时间，结果表明，药材、饮片、提取液、浓缩液、干膏粉色谱图中共有峰，其相对保留时间RSD小于2.0％，故所确定的物质基准制备工艺稳定可行。
11、本发明按照确定工艺，采用日处方量进行投料，每组实验得到一批次当归补血汤物质基准，共15批物质基准对应实物，15批次物质基准出膏率，测定范围为10.69％～14.16％，平均值为12.1％，确定物质基准出膏率范围为7.00％～25.00％。
12、本发明对黄芪进行薄层色谱的摸索实验，确定最佳点样点，提取溶剂，展开剂等，通过试验证实在相应位置下的显色斑点均清晰可见，没有出现拖尾现象。通过对低温、高温、常温、低湿、高湿环境及不同的硅胶G薄层板进行耐用性考察，结果不同影响因素下，此黄芪薄层鉴别条件耐用性良好。不同批次物质基准的供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同颜色斑点。
13、本发明通过阿魏酸化学成分对当归进行薄层摸索实验，确定最佳点样量，提取溶剂，展开剂等，通过试验证实在相应位置下的显色斑点均清晰可见，没有出现拖尾现象。通过对低温、高温、常温、低湿、高湿环境及不同的硅胶G薄层板进行耐用性考察，结果不同影响因素下，此黄芪薄层鉴别条件耐用性良好。不同批次物质基准的供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同颜色斑点。
14、本发明通过指纹图研究，确定了指纹图谱的检测方法，图谱分离度好，杂质峰少。通过方法学考察，空白溶剂图谱和供试品溶液色谱峰的比较发现空白无干扰，仪器精密度、稳定性、重复性良好。
15、本发明通过对黄芪含量测定进行方法学考察，线性关系良好，仪器精密度、稳定性、重复性良好。
16、本发明通过对当归含量测定进行方法学考察，线性关系良好，仪器精密度、稳定性、重复性良好。
附图说明
图1对照指纹图谱(10个共有峰中峰1：毛蕊异黄酮葡萄糖苷3：阿魏酸)。
图2当归补血汤物质基准工艺验证指纹图谱对比图(S1：提取液批一；S2：提取液批二；S3：提取液批三；S4：浓缩液批一；S5：浓缩液批二；S6：浓缩液批三；S7：干膏批一；S8：干膏液批二；S9：干膏批三；S10：当归饮片；S11：黄芪饮片；S12：对照品。
图3不同批次对应实物(冻干粉)性状。
图4青岛海洋硅胶G薄层板(规格：10×10cm)；温度：22.8℃湿度：74％；1.供试品溶液5μl(批号：DGBXT-2018051507D)；2.供试品溶液8μl(批号：DGBXT-2018051507D)；3.供试品溶液10μl(批号：DGBXT-2018051507D)；4.膜荚黄芪饮片溶液10μl(批号：HQ-LF-2017110801Y)；5.蒙古黄芪饮片溶液10μl(批号：HQ-GY-2017110801Y)；6.黄芪甲苷对照品10μl(批号：110781-201616)；7.缺黄芪阴性样品溶液10μl(批号：DGBXT–HQ-20180511-D01)。
图5当归薄层鉴别图(1.供试品溶液5μl(批号：DGBXT-2018051507D)；2.供试品溶液8μl(批号：DGBXT-2018051507D)3.供试品溶液10μl(批号：DGBXT-2018051507D)；4.阿魏酸对照品溶液10μl(批号：110773-201313，中国食品药品检定研究院)；5.当归饮片溶液10μl(批号：DG-LT-2017112901Y)；6.缺当归阴性样品(蒙古黄芪)溶液5μl(批号：DGBXT-DG-20180816-D01)；7.缺当归阴性样品(膜荚黄芪)溶液5μl(批号：DGBXT-DG-20180816-D02)。
图6指纹图谱色谱图(色谱条件的摸索方法一)。
图7指纹图谱色谱图(色谱条件的摸索方法二)。
图8指纹图谱色谱图(色谱条件的摸索方法三)。
图9指纹图谱色谱图(色谱条件的摸索方法四)。
图10指纹图谱色谱图(色谱条件的摸索方法五)。
图11指纹图谱色谱图(色谱条件的摸索方法六)。
图12指纹图谱色谱图(色谱条件的摸索方法七)。
图13指纹图谱色谱图(色谱条件的摸索方法八)。
图14指纹图谱饮片归属色谱图(S1：空白；S2：黄芪饮片；S3：当归饮片；S4：物质基准；S5：对照品)。
图15整体性考察色谱图。
图16指纹图谱精密度测定色谱图。
图17指纹图谱稳定性测定色谱图(S1:DGBXT-2018050801D-0h；S2:DGBXT-2018050801D-3h；S3:DGBXT-2018050801D-6h；S4:DGBXT-2018050801D-9h；S5:DGBXT-2018050801D-12h；S6:DGBXT-2018050801D-24h)。
图18指纹图谱重复性测定色谱图(S1:DGBXT-2018050801D-1；S2:DGBXT-2018050801D-2；S3:DGBXT-2018050801D-3；S4:DGBXT-2018050801D-4；S5:DGBXT-2018050801D-5；S6:DGBXT-2018050801D-6)。
图19不同批次物质基准指纹图谱共有模式(R对照图谱；S1.DGBXT-2018050801D；S2.DGBXT-2018050802D；S3.DGBXT-2018050803D；S4.DGBXT-2018051504D；S5.DGBXT-2018051505D；S6.DGBXT-2018051506D；S7.DGBXT-2018051507D；S8.DGBXT-2018051508D；S9.DGBXT-2018051509D；S10.DGBXT-2018052110D；S11.DGBXT-2018052111D；S12.DGBXT-2018052112D；S13.DGBXT-2018052113D；S14.DGBXT-2018052114D；S15.DGBXT-2018052115D。
图20专属性考察色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1 当归补血药物组合物的制备方法
取黄芪400g、当归80g，置于电子煎药罐中，加水4000ml，浸泡40min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮60分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度55～65℃条件下浓缩至200ml，浓缩液在温度-50～-70℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，制成颗粒剂。
实施例2 当归补血药物组合物的制备方法
取黄芪400g、当归80g，置于电子煎药罐中，加水4000ml，浸泡40min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮60分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度55～65℃条件下浓缩至200ml，浓缩液在温度-50～-70℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，装入胶囊，即得胶囊剂。
实施例3 当归补血药物组合物的制备方法
取黄芪400g、当归80g，置于电子煎药罐中，加水4000ml，浸泡40min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮60分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度55～65℃条件下浓缩至200ml，浓缩液在温度-50～-70℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，压片，即得片剂。
实施例4 当归补血药物组合物的制备方法
取黄芪400g、当归80g，置于电子煎药罐中，加水4000ml，浸泡40min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮60分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度55～65℃条件下浓缩至200ml，浓缩液在温度-50～-70℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，干燥，制成丸剂。
实施例5 当归补血药物组合物的制备方法
取黄芪400g、当归80g，置于电子煎药罐中，加水4000ml，浸泡40min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮60分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度55～65℃条件下浓缩至200ml，浓缩液在温度-50～-70℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入30倍量的注射用水，混匀，过滤，灭菌，得注射剂。
实施例6 当归补血药物组合物的制备方法
黄芪300g、当归90g，置于电子煎药罐中，加水3000ml，浸泡20min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮40分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度45℃条件下浓缩至100ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，装入胶囊，即得胶囊剂。
实施例7 当归补血药物组合物的制备方法
黄芪300g、当归90g，置于电子煎药罐中，加水3000ml，浸泡20min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮40分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度45℃条件下浓缩至100ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，压片，即得片剂。
实施例8 当归补血药物组合物的制备方法
黄芪300g、当归90g，置于电子煎药罐中，加水3000ml，浸泡20min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮40分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度45℃条件下浓缩至100ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，制成颗粒，即得颗粒剂。
实施例9 当归补血药物组合物的制备方法
黄芪300g、当归90g，置于电子煎药罐中，加水3000ml，浸泡20min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮40分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度45℃条件下浓缩至100ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，干燥，制成丸剂。
实施例10 当归补血药物组合物的制备方法
黄芪300g、当归90g，置于电子煎药罐中，加水3000ml，浸泡20min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮40分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度45℃条件下浓缩至100ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或加入30倍量的注射用水，混匀，过滤，灭菌，得注射剂。
实施例11 当归补血药物组合物的制备方法
黄芪500g、当归70g，置于电子煎药罐中，加水5000ml，浸泡60min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮80分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度75℃条件下浓缩至400ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，装入胶囊，即得胶囊剂。
实施例12 当归补血药物组合物的制备方法
黄芪500g、当归70g，置于电子煎药罐中，加水5000ml，浸泡60min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮80分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度75℃条件下浓缩至400ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，压片，即得片剂。
实施例13 当归补血药物组合物的制备方法
黄芪500g、当归70g，置于电子煎药罐中，加水5000ml，浸泡60min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮80分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度75℃条件下浓缩至400ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，制成颗粒，即得颗粒剂。
实施例14 当归补血药物组合物的制备方法
黄芪500g、当归70g，置于电子煎药罐中，加水5000ml，浸泡60min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮80分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度75℃条件下浓缩至400ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入可溶性淀粉(可溶性淀粉与干膏比是1:1～1：4)混合均匀，干燥，制成丸剂。
实施例15 当归补血药物组合物的制备方法
黄芪500g、当归70g，置于电子煎药罐中，加水5000ml，浸泡60min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮80分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度75℃条件下浓缩至400ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或加入30倍量的注射用水，混匀，过滤，灭菌，得注射剂。
实施例1-15按以下任一检测方法检测
实施例16
【性状】本品浅黄色粉末；气微，味微甜。
【鉴别】(1)取本品1.5g，加水25ml使溶解，超声处理30分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次30mL，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪饮片1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，同法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液各10μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷_甲醇-水(13:7:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。
(2)取本品1.5g，加1％碳酸氢钠溶液50ml，超声处理10分钟，离心，取上淸液用稀盐酸调节pH值至2～3，用乙醚振摇提取2次，每次20ml合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【检查】水分不得过12.0％(《中国药典》2015年版四部通则0832第二法)。
【浸出物】取本品约2g，精密称定，照醇溶性浸出物测定法(《中国药典》2015年版四部通则2201)项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，应为30.0～55.0％。
【指纹图谱】照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm，柱温25℃。理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约2.5g，精密称定，用50％甲醇50ml超声45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用30ml的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，供试品色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个共有峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以共有峰计算相似度，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。对照指纹图谱见图1。
【含量测定】黄芪照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(35：65)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.4mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品5.0g，精密称定，精密加水50ml，称定重量，超声处理(功率720W，频率40kHz)45分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次30ml，弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法 精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注人液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
本品按干燥品计算，每g含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，应为0.40～2.3mg。
当归照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.085％磷酸溶液(17：83)为流动相；检测波长为316nm；柱温35℃。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1mL含12μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末2.5g，精密称定，加适量水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，每g含当归以阿魏酸酸(C10H10O4)计，应为0.001～0.817mg。
【包装】真空包装袋密封。
【贮存】置阴凉干燥处贮存。
实施例17
【性状】本品浅黄色粉末；气微，味微甜。
【鉴别】(1)取本品1.0g，加水15ml使溶解，超声处理20分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次15mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次20mL，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪饮片1.0g，加水40ml，煎煮20分钟，滤过，同法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液各10μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷_甲醇-水(13:7:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。
(2)取本品1.0g，加0.5％碳酸氢钠溶液40ml，超声处理5分钟，离心，取上淸液用稀盐酸调节pH值至2～3，用乙醚振摇提取2次，每次15ml合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材1.0g，加水40ml，煎煮20分钟，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【检查】水分不得过12.0％(《中国药典》2015年版四部通则0832第二法)。
【浸出物】取本品约2g，精密称定，照醇溶性浸出物测定法(《中国药典》2015年版四部通则2201)项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，应为30.0～55.0％。
【指纹图谱】照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm，柱温20℃。理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约2.0g，精密称定，用40％甲醇40ml超声30min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用20ml的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水40ml洗脱，后用95％乙醇80ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，供试品色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个共有峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以共有峰计算相似度，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。对照指纹图谱见图1。
【含量测定】黄芪照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(35：65)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.4mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品4.0g，精密称定，精密加水40ml，称定重量，超声处理(功率720W，频率40kHz)30分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次20ml，弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法 精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注人液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
本品按干燥品计算，每g含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，应为0.40～2.3mg。
当归照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.085％磷酸溶液(17：83)为流动相；检测波长为280nm；柱温35℃。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1mL含12μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末1.5g，精密称定，加适量水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，每g含当归以阿魏酸酸(C10H10O4)计，应为0.001～0.817mg。
【包装】真空包装袋密封。
【贮存】置阴凉干燥处贮存。
实施例18
【性状】本品浅黄色粉末；气微，味微甜。
【鉴别】(1)取本品3.0g，加水35ml使溶解，超声处理40分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次35mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤4次，每次40mL，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪饮片1.0g，加水40ml，煎煮20分钟，滤过，同法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液各10μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷_甲醇-水(13:7:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。
(2)取本品3.0g，加1.5％碳酸氢钠溶液60ml，超声处理15分钟，离心，取上淸液用稀盐酸调节pH值至2～3，用乙醚振摇提取4次，每次25ml合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材1.0g，加水40ml，煎煮20分钟，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【检查】水分不得过12.0％(《中国药典》2015年版四部通则0832第二法)。
【浸出物】取本品约2g，精密称定，照醇溶性浸出物测定法(《中国药典》2015年版四部通则2201)项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，应为30.0～55.0％。
【指纹图谱】照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm，柱温30℃。理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加90％甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约3.0g，精密称定，用60％甲醇40ml超声60min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用40ml的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水60ml洗脱，后用95％乙醇120ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，供试品色谱图应与对照指纹图谱，基本一致，有相对应的10个共有峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以共有峰计算相似度，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。对照指纹图谱见图1。
【含量测定】黄芪照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(35：65)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.4mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品6.0g，精密称定，精密加水60ml，称定重量，超声处理(功率720W，频率40kHz)30分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤4次，每次40ml，弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法 精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注人液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
本品按干燥品计算，每g含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，应为0.40～2.3mg。
当归照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.085％磷酸溶液(17：83)为流动相；检测波长为280nm；柱温35℃。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加80％甲醇制成每1mL含12μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末3.5g，精密称定，加适量水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，每g含当归以阿魏酸酸(C10H10O4)计，应为0.001～0.817mg。
【包装】真空包装袋密封。【贮存】置阴凉干燥处贮存。
为了验证本发明的可行性及有效性，发明人对工艺及检测方法进行了系列试验，摘录如下：
1.经典名方物质基准研究
1.1工艺描述和流程图
1.1.1物质基准实物的制备工艺及参数
1.1.1.1处方
黄芪40g 当归8g
1.1.1.2制法
取10倍处方量饮片，置于9L电子煎药罐中，加水4000ml，明火加热煎煮，武火煮沸，文火煎煮60分钟，200目滤布趁热常压滤过，减压浓缩至200ml，冷冻干燥，真空包装，即得物质基准对应实物，置阴凉干燥处贮存。
1.1.3操作过程
1.1.3.1煎煮次数及每煎投料量
依据原文记载，煎煮次数为一次，煎煮投料量为日处方量。为保持与古籍记载工艺的一致性，确定煎煮次数为一次；因日处方量药量较少，不便于研究，故将每煎投料量扩大为日处方量10倍，及黄芪400g，当归80g。
1.1.3.2饮片前处理
当归补血汤处方中含有两味药，分别为黄芪、当归，黄芪饮片规格为2～4mm厚片，可直接投料，无需饮片前处理。当归饮片规格为2～4mm厚片，当归放在黄酒中快速洗过，过滤，适合汤剂的煎煮，无需进行前处理。
1.1.3.3煎煮过程
(1)加热方式考察
以提取液中的阿魏酸、黄芪甲苷的提取总量及出膏率为考察指标，对明火和电子煎药罐的两种加热方式进行单因素对比试验研究。从煎煮时间、出膏率、指标成分总量综合分析，两种加热方式差异较小，因电子煎药罐煎煮较为方便，故选择电子煎药罐煎煮方法为当归补血汤的煎煮方法。
(2)煎煮时间考察
由于处方原文中煎煮终点为提取液体积，而以提取液体积作为煎煮终点在煎煮过程中操作不便，同时以固定加热方式，故对煎煮时间代替提取液体积作为煎煮终点进行研究。
1.1.3.4滤过、浓缩与干燥工艺考察
对提取液采用常压滤过工艺考察，以药液澄明度为指标。结果：提取液采用200目尼龙滤布趁热过滤，滤液澄清，无杂质。确定滤过方式为：200目滤布常压趁热过滤。由于提取液体积约为2000ml，不便于冻干，故进行浓缩工艺考察。分别对浓缩方法、浓缩真空度、浓缩温度进行考察，以浓缩液中的阿魏酸、黄芪甲苷的提取总量为考察指标。结果：采用真空浓缩，真空度在0.06～0.08Mpa范围类，浓缩温度在50～65℃时有效成分黄芪甲苷、阿魏酸提取总量较高。浓缩液经过冷冻干燥后，能够收集到疏松的干膏粉，冷冻干燥方式可行。
1.1.3.5包装
内包材真空密封袋，密封；
1.1.3.6贮存
置阴凉库保存。
1.1.4工艺参数确定的依据
根据经典名方目录中记载的方法：黄芪一两，当归二钱(酒洗)，上件咀，都作一服。水二盏，煎至一盏，去渣，温服，空心食前。本研究采用原文煎煮方法，采用电子煎药罐(容量9L)煎煮，以出膏率、阿魏酸、黄芪甲苷提取总量、指纹图谱为指标，研究物质基准饮片前处理、加热方式、煎煮时间、滤过、浓缩及干燥等工艺相关参数，从而确定当归补血汤物质基准工艺。
1.1.4.1前处理
当归补血汤处方中含有两味药，分别为黄芪、当归，均为饮片规格，适合汤剂的煎煮，无需进行前处理。
1.1.4.2煎煮过程
工艺研究考察明火及电子煎药罐两种加热方式，结果从煎煮时间、出膏率、阿魏酸、黄芪甲苷总量综合分析，两种加热方差异较小，电子煎药罐煎煮较方便，故选择加热方式为电子煎药罐。对煎煮时间代替提取液体积作为煎煮终点进行研究，确定当归补血汤物质基准煎煮时间为60分钟。
1.1.4.3滤过、浓缩、干燥过程
确定固液分离采用200目，浓缩采用真空浓缩，真空度在0.06～0.08Mpa范围，浓缩温度在50～65℃时有效成分黄芪甲苷、阿魏酸提取总量较高。浓缩液经过冷冻干燥(冷冻干燥温度-50～-70℃，真空度＜300Pa)后，能够收集到疏松的干膏粉，确定冷冻干燥方式可行。
1.1.4.4工艺验证过程
通过对三批物质基准相应批次的药材、饮片、提取液、干膏粉取样，测定指标成分含量及指纹图谱，从阿魏酸、黄芪甲苷总量上分析，三批验证提取液与干膏粉数据均基本平行，且工艺过程中物质传递损失较小，从指纹图谱上分析，药材、饮片、提取液、干膏粉色谱图中共有峰，其相对保留时间RSD小于2.0％。
1.1.4.5包装
内包材真空密封袋，密封；
1.1.4.6贮存
置阴凉库保存。
确定当归补血汤物质基准工艺为：黄芪400g、当归80g，置于9L电子煎药罐中，加水4000ml，以明火方式加热，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮60分钟，煎煮至2000ml，200目滤布趁热滤过，浓缩后经冷冻干燥(冷冻干燥温度-50～-70℃，真空度＜300Pa)，收集干膏粉，即得。
1.1.5主要设备及型号见表1
表1主要设备及型号
1.2工艺研究
当归补血汤由当归和黄芪两味药组成，出自金元·李东垣《内外伤辨惑论》。黄芪一两，当归二钱(酒洗)，上件咀，都作一服。水二盏，煎至一盏，去渣，温服，空心食前。与现代人们的煎煮方法和计量有所差异，现依据《历代度量衡》及《中国历代度、量、衡制演变简表》对当归补血汤中“制法及用法”中的数据单位同现代的数据单位进行换算，根据经典名方目录中记载的方法，结合卫生部、国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药发〔2009〕3号)进行煎煮制备当归补血汤“经典名方物质基准”。《中国历代度、量、衡制演变简表》中记载金元时期一两相当于现今40g，一钱相当于现今4g，一盏相当于现今200～300ml，故该方为黄芪40g、当归8g，加水400～600ml，煎煮至200～300ml。当归补血汤具有补血益气的功效，主治虚阳浮法热证，也可医治妇女经期、产后血虚发热头痛等症状及痔疮溃疡久而不愈的病症。
根据经典名方目录中记载的方法，结合卫生部、国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药发〔2009〕3号)进行煎煮。采用电子煎药罐煎煮，提取液经浓缩后冷冻干燥制备干膏，以出膏率、黄芪甲苷和阿魏酸提取总量、指纹图谱为指标，对物质基准对应实物制备工艺中的煎煮时间、滤过、浓缩及干燥等相关参数进行研究，从而确定当归补血汤物质基准工艺。
8.2.1前处理
据古籍原文及考证结果，本处方所用饮片由药材按相应的炮制标准制得，黄芪饮片规格为2～4mm厚片，当归饮片规格为2～4mm厚片，黄酒中快速洗过，过滤，直接投料，无需饮片前处理。见表2。
表2研究用饮片信息
1.2.2煎煮
1.2.2.1吸水性实验考察
因黄芪药用部位为根部分，当归药用根部分，极易吸水，故进行饮片吸水性试验。
实验方法：取黄芪饮片40g、当归饮片8g，混合均匀，加400ml的水，定时过滤，称量并记录过滤药材的重量，计算不同时间药材的吸水重量。结果见表3。
表3吸水性试验考察表
结论：从上述试验可知混合药材的浸泡时间在40min后吸水重量趋于稳定，吸水量为药材重量的2.68倍左右，故将当归补血汤药材的提取浸泡时间定为40min。
1.2.2.2加水量考察
归补血汤处方煎煮要求“水二盏，煎至一盏，去滓即得”，处方中“一盏”通过相关文献考证相当于现在用量200ml-300ml，故对加水量进行考察。将处方放大十倍，分别取黄芪饮片(HQ-HX-2017110801Y)400g、当归饮片(DG-MX-2017110801Y)80g，按煎煮体积因素表进行考察试验，见表4
表4提取体积因素表
各因素的取值以阿魏酸、黄芪甲苷的含量、转移率；含固率作为考察指标，详细结果见表5。
表5提取体积因素含量汇总表
结论：由加水量体积考察可知，黄芪甲苷、阿魏酸含量及转移率差异不显著，含固率差异不明显，但实验组加水量为4000ml的煎煮时间要短些，故当归补血汤物质基准煎煮加水量选择为4000ml。
8.2.2.3加热方式考察
古代煎煮方式为明火煎煮，现拟用电火炉作为明火加热方式，同时考虑到电子煎药罐加热方式通过功率控制加热效率，其控制火力作用更稳定，故拟采用出膏率、阿魏酸、黄芪甲苷总量为指标，考察明火与电子煎药罐加热方式。
称取4份十倍日处方量饮片(取黄芪批号HQ-LX-2017110801Y：400g、当归批号DG-MX-2017110801Y：80g)，加水4000ml，分别置于9L电子煎药罐和砂锅中，加盖煎煮，武火煎煮至沸，文火煎煮至2000ml，提取液用200目筛滤过，记录提取液体积；明火和电子煎药罐(武火为2200W，文火为400W)煎煮均制备两份提取液，按照指标成分的测定方法，测定提取液中阿魏酸、黄芪甲苷含量、出膏率，考察明火和电子煎药罐(武火为2200W，文火为400W)加热方式对指标性成分的影响。
中间体(提取液)出膏率测定方法：精密量取提取液20ml，置已干燥至恒重的蒸发皿W1中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥至恒重，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量W2，见表6。
表6加热方式考察结果
试验结果表明，明火及电子煎药罐两种加热方式，含量测定指标测定总量无显著性差异，选择电子煎药罐煎煮方式。
1.2.2.4煎煮时间的确定
经典名方按传统中药煎煮，容器应为砂锅煎药罐或陶瓷药罐为宜，本实验采用电子煎药罐进行煎煮，经典名方中当归补血汤煎煮要求为以“水二盏，煎至一盏，去滓即得”，故当归补血汤煎煮一次，并对“煎至一盏”所需的时间进行考察。分别取黄芪饮片(HQ-LX-2017110801Y)400g、当归饮片(DG-MX-2017110801Y)80g，按煎煮时间因素表进行煎煮时间考察试验，结果见表7。
表7煎煮时间因素表
结论：由上表数据可知，煎煮时间在60min时，较接近加入量的一半，故对当归补血汤“经典名方物质基准”煎煮提取时间定为60min。各因素含量测定及转移率数据如表8：
表8煎煮时间因素含量测定汇总表
结论：由上表数据可知，煎煮时间在60min时，阿魏酸、黄芪甲苷含量相差不大，转移率无显著差异，含固率煎煮60min时较高，故当归补血汤物质基准制备煎煮时间确定为60min。
1.2.2.5煎煮工艺总结
综上，暂定当归补血汤物质基准煎煮工艺为：取黄芪400g、当归80g。加水4000ml，置于9L电子煎药罐中，加盖煎煮，武火煎煮至沸，文火煎煮60min。
1.2.3滤过、浓缩与干燥
1.2.3.1滤过工艺研究
分别取煎煮时间考察项下的煎煮45min、煎煮60min批次提取液分别趁热过200及300目滤布，观察二者滤液差异。
结果表明：两种规格滤材均易过滤，通过观察过滤后药液状态，滤液澄明度差异不大，故选择200目滤布进行滤过。
1.2.3.2浓缩工艺研究
1.2.3.2.1浓缩方法考察
由物质基准制备结果可知，提取液为2000ml左右，需进行浓缩处理，用的浓缩方法有常压浓缩和减压浓缩两种方法，以黄芪甲苷、阿魏酸的含量及转移率为指标，现对浓缩方法进行考察，以确定其浓缩方法。
实验方法：取黄芪饮片(批号HQ-LX-2017110801Y)400g、当归饮片(批号DG-MX-2017110801Y)80g，照煎煮工艺制备当归补血汤，提取液过200目滤布，平均分成2份，每份1000ml，浓缩至约200ml即得，分别进行常压浓缩和减压浓缩，浓缩结果见表9。
表9浓缩方法考察结果
结论：常压浓缩和真空浓缩对黄芪甲苷阿魏酸的含量及转移率率无显著差异，但在浓缩时间上真空减压浓缩时间要短些，故浓缩方法选择真空减压浓缩。
1.2.3.2.2浓缩真空度考察
根据8.2.3.2.1浓缩方法的考察实验，确定浓缩方法为减压浓缩，现对其真空度做进一步考察。
实验方法：取黄芪饮片(批号HQ-LX-2017110801Y)400g、当归饮片(批号DG-MX-2017110801Y)80g，照煎煮工艺制备当归补血汤，药液平均分成3份，固定温度，采用减压旋蒸浓缩法，考察不同真空条件下浓缩的情况，结果见表10。
表10浓缩真空度考察结果
结论：真空度对黄芪甲苷、阿魏酸的含量及转移率无显著影响，但随着真空度的增加，蒸汽压也在增加，结合生产实际及省时降耗综合考虑，故采用真空度在0.04MPa～0.08MPa的范围内浓缩。
1.2.3.2.3浓缩温度的考察
根据1.2.3.2.2与1.2.3.2.3浓缩方法和真空度的考察试验，确定浓缩方法为减压浓缩，现对其浓缩温度做进一步考察。
实验方法：取黄芪饮片(批号HQ-LX-2017110801Y)400g、当归饮片(批号DG-MX-2017110801Y)80g，照煎煮工艺制备当归补血汤，药液平均分成4份，分别在不同的温度条件下进行浓缩，结果见表11。
表11浓缩温度考察结果
结果表明：温度在45℃～60℃之间，对黄芪甲苷、阿魏酸的含量及转移率无显著影响，结合生产实际及省时降耗综合考虑，故采用45℃～60℃的温度进行浓缩。
综上所得：浓缩工艺采用减压浓缩的方法进行浓缩，工艺参数确定为浓缩温度45℃～60℃，真空度0.04MPa～0.06MPa。
1.2.3.2.4浓缩工艺总结
综上，当归补血汤浓缩工艺为真空为0.04-0.08MPa的减压浓缩，浓缩温度为45-66℃。
1.2.3.3干燥工艺研究
取滤过工艺考察提取液进行冷冻干燥(冷冻干燥温度-45～-60℃，真空度＜300Pa)，观察干燥情况。结果见表12。
表12物质基准工艺研究考察结果
综上所述：暂定当归补血汤物质基准制备工艺为：取黄芪400g、当归80g，置于9L砂锅中，以电子煎药罐方式加热，加水4000ml，加盖煎煮，武火煮沸转为文火煎煮保持微沸，煎煮60分钟，200目滤布趁热滤过，提取液浓缩至约200ml，经冷冻干燥，收集干膏粉，即得。
1.2.4关键工艺步骤和中间体
1.2.4.1工艺验证样品制备
称取3份10倍日处方量饮片(黄芪400g批号：HQ-LX-2017110801Y、当归80g批号：DG-LT-2017112901Y)，加水4000ml，置于9L电子煎药罐中，浸泡40min，加盖煎煮，武火煎煮至沸，文火煎煮时间60分钟，煎煮至约2000ml，200目滤布趁热滤过，提取液留样250ml，其余滤液浓缩(真空减压，温度55-65℃浓缩)至约200ml，经冷冻干燥。(冷阱温度：-50～-70℃，真空度：＜300Pa)，收集干膏粉，计算出膏率。取样，测定干膏粉中水分、浸出物、阿魏酸、黄芪甲苷含量，并分别计算工艺过程中含量转移率。另按照上述工艺，进行单味饮片及药材提取液制备，进行指纹图谱测定。
1.2.4.2工艺验证样品测定
结果见表13～14，图2。
表13当归补血汤物质基准工艺验证数据汇总
表14当归补血汤物质基准工艺验证相对保留时间结果
1.2.4.3工艺确定
从煎煮体积角度分析，三批工艺验证中间体体积均值为2500ml，与原文考证终点2000ml接近，证明工艺煎煮时间确定合理。
从阿魏酸、黄芪甲苷总量上分析，三批验证提取液与干膏粉数据均基本平行，且工艺过程中物质传递损失较小；从浸出物、水分上分析，三批验证干膏粉无明显差异。
从指纹图谱上分析，峰1、3、4、5、6、7、8、9、10为黄芪色谱峰，峰2、为当归色谱峰。暂以1号峰为参照峰计算相对保留时间，结果表明、药材、饮片、提取液、浓缩液、干膏粉色谱图中共有峰，其相对保留时间RSD小于2.0％，故所确定的物质基准制备工艺稳定可行。
综上，确定物质基准工艺为：取黄芪400g、当归80g，置于9L电子煎药罐中，加水4000ml，浸泡40min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮60分钟，200目滤布趁热滤过，滤液浓缩(真空减压，真空度0.04-0.08MPa，温度55-65℃)至约200ml，经冷冻干燥(冷冻干燥温度-50～-70℃，真空度＜300Pa)，收集干膏粉，即得。
1.2.4.4多批次物质基准的制备
目前饮片以5个产地，不少于15个批次为原则进行收集；黄芪收集甘肃省陇西县、甘肃省华亭县河西乡、甘肃省渭源县莲峰镇、河北保承市和内蒙古固阳县，每个产地3批，浸出物均符合规定；处方中当归收集甘肃省渭源县、甘肃省岷县、甘肃省武山县、甘肃省通渭县和甘肃省临洮县官亭镇等5个县，每个产地3批，浸出物均符合规定；每个药味15批次饮片随意排序，制备15批次物质基准。15批饮片排序组合结果见表15。
表15不同批次物质基准投料汇总
注：编号1～15，即为15个组合方式
按照确定工艺，采用日处方量进行投料，每组实验得到一批次当归补血汤物质基准，共15批物质基准对应实物，15批次物质基准出膏率测定结果见下表，测定范围为10.69％～14.16％，平均值为12.1％，确定物质基准出膏率范围为7.00％～25.00％。结果见表16。
表16多批次物质基准批次信息
检测方法研究
1.3.3.2分析方法的验证
列入检测方法项目的分析方法学验证，按照现行版《中国药典》中有关的指导原则执行，方法学验证资料如下。
1.3.3.2.1性状
通过对15批对应实物(干膏粉)的实际性状观察，记录，结果见表17，图3。
表17性状
结论：根据15批次对应实物(干膏粉)样品的实际观察情况，暂定本品为浅黄色粉末；气微，味微甜。
1.3.3.2.2鉴别
本品由两味中药制成，系用水煎煮工艺制成的复方制剂，选用了专属性强，快速、简便、重现性好的薄层鉴别方法，对方中当归、黄芪的主要特征成分进行鉴别试验研究。结果概述如下：
①黄芪
黄芪甘草主要化学成分为皂苷类和黄酮类，除此之外还含有多糖等。根据以上化学成分对黄芪进行如下薄层色谱的摸索实验。
a建立薄层色谱方法
方法一：参考《中国药典》2015年版一部“黄芪颗粒”项下薄层鉴别方法进行摸索
取本品及缺黄芪的阴性样品各1.5g，取本品粉末1.5g，加水25mL，超声处理30分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次30mL，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪饮片1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，同法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液各5μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷_甲醇-水(13:7:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。
结果分析：供试品色谱中，在与黄芪甲苷、黄芪药材色谱相应的位置上，有相同的斑点，且阴性无干扰。以黄芪甲苷为对照品，以黄芪饮片溶液作为对照，在紫外光(365nm)下检视，方法可行，斑点较供试品溶液浅，为了让斑点更加的清晰明了，故进一步对对照品及黄芪饮片溶液点样量进行摸索。
方法二：点样量摸索
吸取“方法一”制备的样品溶液(DGBXT-2018051507D)，黄芪甲苷对照品溶液、黄芪饮片溶液、阴性样品的点样量不变10μl，供试品点样量变为5μl，8μl和10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置紫外光灯(365nm)下显检视。见图4。
结果表明，黄芪甲苷对照品溶液与黄芪饮片点样量均为10μl，供试品溶液点样量分别为5μl，8μl和10μl，相应位置下的显色斑点均清晰可见，没有出现拖尾现象，故确定黄芪甲苷对照品浓度为2mg/ml点样量10μl，黄芪饮片溶液1.5g/ml点样量10μl，供试品溶液点样量10μl。综合分析，确认薄层鉴别方法：取本品1.5g，加水25ml使溶解，超声处理30分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次30mL，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪饮片1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，同法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液各5μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷_甲醇-水(13:7:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。
b耐用性考察
按上述确定方法进行耐用性试验，考察自制硅胶G板与机制硅胶G板的薄层板(青岛海洋化工厂)以及不同展开高温高湿(温度42℃、湿度75％)，以及相对低温低湿(温度4℃、湿度45％)等影响因素。
结论：通过对低温、高温、常温、低湿、高湿环境及不同的硅胶G薄层板进行耐用性考察，结果不同影响因素下，此黄芪薄层鉴别条件耐用性良好。故将此薄层方法列入正文。
c方法确定
取本品1.5g，加水25mL，超声处理30分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次30mL，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪对照药材1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每lmL含2mg的溶液，作为对照品溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷_甲醇-水(13:7:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置紫外光灯(365nm)下显检视，显相同颜色的荧光斑点。
d不同批次对应实物(干膏粉)薄层鉴别
分别称取不同批次的对应实物(干膏粉)1.5g，同上述供试品制备方法制成供试品溶液。进行薄层鉴别。
结论：不同批次物质基准的供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同颜色斑点。
②当归
当归中主要含有阿魏酸、藁本内酯等苯化合物。挥发油是当归的主要活性成分，主要含有藁本内酯等酯类成分，藁本内酯经过提取干燥后，在干膏粉中占比不大，故阿魏酸化学成分对当归进行如下薄层摸索实验。
a建立薄层色谱方法
方法一：参照《中国药典》2015版一部“当归”项下薄层鉴别方法进行摸索
取本品及缺当归的阴性样品各1.5g，加1％碳酸氢钠溶液50ml，超声处理10分钟，离心，取上淸液用稀盐酸调节pH值至
用乙醚振摇提取2次，每次20ml合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取当归饮片1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液各10μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。
结果分析：供试品色谱中，在与阿魏酸、当归药材色谱相应的位置上，有相同的斑点，且阴性无干扰。以阿魏酸为对照品，以当归饮片溶液作为对照，在紫外光(365nm)下检视，方法可行，但对照品及当归饮片溶液斑点较供试品溶液斑点浅，故下一步对对照品及当归饮片溶液点样量进行摸索。
方法二：点样量摸索
吸取“方法一”制备的三种样品溶液，将阿魏酸对照品溶液、当归饮片溶液的点样量增加至10μl，阴性样品的点样量为5μl，供试品点样量变为5μl，8μl和10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。见图5。
结果表明，阿魏酸对照品溶液与当归饮片点样量均为10μl，供试品溶液点样量分别为5μl，8μl和10μl，相应位置下的显色斑点均清晰可见，没有出现拖尾现象，故确定阿魏酸对照品浓度为lml含lmg的溶液，点样量10μl，当归片溶液1.5g/ml点样量10μl，供试品溶液点样量10μl。
确认薄层鉴别方法：本品及缺当归的阴性样品各1.5g，加1％碳酸氢钠溶液50ml，超声处理10分钟，离心，取上淸液用稀盐酸调节pH值至
用乙醚振摇提取2次，每次20ml合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取当归饮片1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液各10μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。
b耐用性考察
按上述确定方法进行耐用性试验，考察自制硅胶G板与机制硅胶G板的薄层板(青岛海洋化工厂)以及不同展开高温高湿(温度42℃、湿度75％)，以及相对低温低湿(温度4℃、湿度45％)等影响因素。
结论：通过对低温、高温、常温、低湿、高湿环境及不同的硅胶G薄层板进行耐用性考察，结果不同影响因素下，此当归薄层鉴别条件耐用性良好。故将此薄层方法列入正文。
c方法确定
取本品1.5g，加1％碳酸氢钠溶液50ml，超声处理10分钟，离心，取上淸液用稀盐酸调节pH值至
用乙醚振摇提取2次，每次20ml合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液10μl，供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
d不同批次对应实物(干膏粉)薄层鉴别
分别称取不同批次的对应实物(干膏粉)1.5g，同上述供试品制备方法制成供试品溶液。进行薄层鉴别。
结论：不同批次物质基准的供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同颜色斑点
1.3.3.2.3检查
①水分
照水分测定法(《中国药典》2015年版四部通则0832第二法)，测定15批次物质基准水分，结果见表18。
表18水分检查结果表
结果表明：15批次物质基准水分范围5.56％～14.54％，平均水分9.40％，暂定本品水分不得过12.0％。
(4)浸出物
中药材中的化学成分或大类成分多数可以在水或醇中溶出，进而进行浸出物测定。由于当归补血汤物质基准是水提取，选择水为溶剂建立浸出物测定意义不大，难以反映内在质量，故选溶剂时，要考虑大类成分的溶解度，选择乙醇进行浸出物测定，以控制物质基准的质量。见表19。
表19浸出物查结果表
结果表明：经不同批次饮片制成的15批物质基准浸出物范围27.47～57.33％，平均浸出物42.15％。考虑到实际生产过程中的各种影响因素等，暂定本品醇溶性浸出物的含量为30.0％～55.0％。
1.3.3.2.4指纹图谱
由于单纯的指标成分的定性鉴别和定量分析，难以反映物质基准质量的优劣。作为衡量物质基准对应实物是否与物质基准基本一致的标准参照物，其质量应加强专属性鉴别和多成分、整体质量控制。因而物质基准质量控制要重视以指纹图谱为主的整体质量控制。
①仪器与试药
液相色谱仪：赛默飞UltiMate 3000，安捷伦1260Ⅱ；
色谱柱：GL Sciences Lnc
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)；
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)等。
电子天平：奥豪斯仪器(常州)有限公司ScoutSE(百分之一)
上海越平科学仪器有限公司FA1104(万分之一)
日本岛津科技有限公司AUW1220D(十万分之一)
乙腈为色谱纯：TEDIA生产；甲醇为色谱纯：TEDIA生产；磷酸为色谱纯，Aladdin生产；甲醇为分析纯：常州市鸿盛精细化工有限公司；水为超纯水，成都浩康科技有限公司。
阿魏酸对照品(批号：110773-201313，纯度：99.6％)，毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号：111920-201505，纯度：97.1％)，购自中国食品药品检定研究院。
②色谱条件的摸索
方法一：参照“当归补血汤不同制剂高效液相特征图谱比较”方法，
色谱条件与系统适用性试验 GL Sciences Lnc
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.4％甲酸溶液B，按表20中的规定进行梯度洗脱；流速为1ml/min，柱温为30℃；检测波长为280nm。
表20流动相程序
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约(批号：DGBXT-2018050801D)1.0g，精密称定，称取当归补血汤干膏粉末1g，加甲醇1.2ml于25ml的容量瓶中，加水至刻度，过滤，即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图(见图6)，即得。
结果分析：由图谱可知该方法的分离效果不好。
方法二：参照“当归补血汤HPLC指纹图谱研究(I)”方法
色谱条件与系统适用性试验 GL Sciences Lnc
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.2％冰醋酸溶液B，按表19中的规定进行梯度洗脱；流速为1ml/min，柱温为25℃；检测波长为254nm。
表21流动相程序
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约(批号：DGBXT-2018050801D)2.0g，加入25ml水溶解，用石油醚(60～90℃)提取3次，每次20ml，弃石油醚，水液再用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml，合并正丁醇，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次25ml，收集正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使之溶解，定容至5ml即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，见图7，即得。
结果分析：由图谱可知该方法的分离效果不好。
方法三：参照“当归补血汤汤剂正丁醇部位中黄芪的HPLC指纹初步分析”方法
色谱条件与系统适用性试验 GL Sciences Lnc
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以水溶液B，按表22中的规定进行梯度洗脱；流速为1ml/min，柱温为30℃；检测波长为203nm。
表22流动相程序
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约(批号：DGBXT-2018050801D)2.0g，加水50ml使之溶解，用醋酸乙酯提取3次，每次50ml，水液再用正丁醇提取3次，每次50ml，合并正丁醇液，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至5ml，即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图(见图8)，即得。
结果分析：由图谱可知该方法的分离效果不好。
方法四：参照“当归补血汤皂苷类成分HPLC指纹图谱研究”方法
色谱条件与系统适用性试验 GL Sciences Lnc
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以水溶液B，按表23中的规定进行梯度洗脱；流速为1ml/min，柱温为30℃；检测波长为203nm。
表23流动相程序
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约(批号：DGBXT-2018050801D)2.0g，加水50ml使之溶解，用乙醚提取3次，每次40ml，弃乙醚液，水液再用水饱和的正丁醇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨水洗涤2次，每次40ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml溶解，过中性氧化铝柱(100-200目，5g,内径1.0cm)上用40％的甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水5ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.0cm，长10cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，并定容至5ml即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图(见图9)，即得。
结果分析：由图谱可知该方法的分离效果不好。
方法五：参照“当归补血汤总苷HPLC指纹图谱研究”方法
色谱条件与系统适用性试验 GL Sciences Lnc
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以水溶液B，按表24中的规定进行梯度洗脱；流速为1ml/min，柱温为30℃；检测波长为203nm。
表24流动相程序
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约(批号：DGBXT-2018050801D)2.0g，加无水乙醇50ml，超声30min，用水饱和的正丁醇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.0cm，长10cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，并定容至5ml即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图(见图10)，即得。
结果分析：由图谱可知该方法的分离效果不好。
方法六：参照“当归药材HPLC指纹图谱及其液相色谱-质谱联用分析”方法
色谱条件与系统适用性试验 GL Sciences Lnc
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.05％甲酸溶液B，按表25中的规定进行梯度洗脱；流速为1ml/min，柱温为30℃；检测波长为203nm。
表25流动相程序
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约(批号：DGBXT-2018050801D)2.0g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇-甲酸(95：5)25ml，摇匀，密塞，称定重量，超声提取60min，放冷，再称定重量，用甲醇-甲酸(95:5)补足重量，摇匀，静置，取上清液过滤，取续滤液即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图(见图11)，即得。
结果分析：由图谱可知该方法的分离效果不好。
方法七：参照“黄芪药材的HPLC-UV指纹图谱研究”方法
色谱条件与系统适用性试验 GL Sciences Lnc
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液B，按表26中的规定进行梯度洗脱；流速为1ml/min，柱温为210℃；检测波长为210nm。
表26流动相程序
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约(批号：DGBXT-2018050801D)2.5g，用50％甲醇50ml超声45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图(见图12)，即得。
结果分析：由图谱可知该方法的分离效果较好，故当归补血汤“经典名方物质基准”液采用该方法进行指纹图的进一步考察验证研究。
方法八：参照“黄芪药材的HPLC-UV指纹图谱研究”方法
色谱条件与系统适用性试验 GL Sciences Lnc
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液B，按表27中的规定进行梯度洗脱；流速为1ml/min，柱温为25℃；检测波长为210nm。
表27流动相程序
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备
取本品约(批号：DGBXT-2018050801D)2.5g，精密称定，用50％甲醇50ml超声45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用30ml的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图(见图13)，即得。
结果分析：由图谱可知该方法较方法七的杂质峰少，故当归补血汤“经典名方物质基准”液采用该方法进行指纹图研究。
③峰归属及参照物的选择
a药味归属
按照物质基准制备方法，制备单味药材的冻干粉及缺单味药的阴性样品冻干粉，按照确定的指纹图谱供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照确定的色谱条件进行测定，确定冻干粉指纹图谱中各个色谱峰归属于哪味饮片，见图14和表28。
表28药味归属表
实验结论：物质基准色谱峰主要为当归及黄芪特征峰，流动相空白无干扰。
b参照物的选择
其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷，色谱峰保留时间适中，响应值较高，达到基线分离，故选择毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为对照品参照峰，并将对毛蕊异黄酮葡萄糖苷标记为峰S，同时将毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品作为参照物。
④方法的初步确定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按表29中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm，流速为每分钟1ml，柱温25℃。理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000。
表29梯度洗脱规定
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含20μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约2.5g，精密称定，用50％甲醇50ml超声45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用30ml的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
③方法学考察
a专属性及整体性试验
为考察空白溶剂是否有干扰，结果空白溶剂无干扰。同时也对供试品整体性进行了考察，结果基本满足了信息量最大的原则，见图15。
结果分析：通过空白溶剂图谱和供试品溶液色谱峰的比较发现空白无干扰。
b精密度试验
取本品约(批号：DGBXT-2018050801D)2.5g，精密称定，按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作，连续进样6次，对其相对保留时间及相对峰面积计算，其相对保留时间及相对峰面积具体测定结果见表30～31，图16
表29指纹图谱精密度相对保留时间计算结果
表30指纹图谱精密度相对峰面积汇总结果
结果表明：相对保留时间差异不大，RSD<2.0％，仪器精密度良好。相对峰面积RSD<10.0％，说明仪器精密度良好。
c稳定性试验
取本品约(批号：LGZGT-B-180707-D04)2.5g，精密称定，按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作，分别在制备后放置0、3、6、9、12、24小时进样测定，对其相对保留时间及相对峰面积进行计算，其相对保留时间及相对峰面积具体测定结果如下表31～表32，图17。
表31指纹图谱稳定性相对保留时间计算结果
表32指纹图谱稳定性相对峰面积汇总结果
结果表明，相对保留时间差异不大，RSD<2.0％；相对峰面积RSD<10.0％。说明供试品溶液中在24小时内稳定性良好。
d重复性实验
取本品(批号：LGZGT-B-180707-D04)约2.5g，(共6份)，精密称定，按正文供试品溶液制备和测定法项下进行操作。对其相对保留时间及相对峰面积进行计算，其相对保留时间及相对峰面积具体测定结果如下33～34，图18。
表33指纹图谱重复性相对保留时间计算结果
表34指纹图谱重复性相对峰面积汇总结果
结果表明，相对保留时间差异不大，RSD<2.0％；相对峰面积RSD<10.0％，说明，本方法的重复性良好。
④指纹图谱测定方法确认
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm，柱温25℃。理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000。
表35梯度洗脱表
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含20μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备供试品溶液的制备 取本品约2.5g，精密称定，用50％甲醇50ml超声45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用30ml的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得
⑤指纹图谱的建立
a共有峰的标定
采用正文【指纹图谱】项下的方法对15批供试品色谱峰进行测定，并对所得指纹图谱进行分析，选择15批样品指纹图谱中稳定性较好、响应值适宜的色谱峰为共有峰，共标定了10个共有峰。结果见图19。
b对照图谱的建立
采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2012年版》，根据15批次物质基准指纹图谱测定结果，以标出的10个共有峰进行校正，生成如下对照指纹图谱R。结果见图1。
c相似度的计算
采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统，以共有峰对15批样品与对照指纹图谱的相似度进行计算，结果见表36
表36 15批次相似度评价结果
R对照指纹图谱S1.DGBXT-2018050801D S2.DGBXT-2018050802D S3.DGBXT-2018050803D S4.
DGBXT-2018051504D S5.DGBXT-2018051505D S6.DGBXT-2018051506D S7.
DGBXT-2018051507D S8.DGBXT-2018051508D S9.DGBXT-2018051509D S10.
DGBXT-2018052110D S11.DGBXT-2018052111D S12.DGBXT-2018052112D S13.
DGBXT-2018052113D S14.DGBXT-2018052114D S15.DGBXT-2018052115D。
以上15批次当归补血汤对应实物(冻干粉)指纹图谱生成对照指纹图谱R，以此比较15批次对应实物(冻干粉)相似度均大于0.85，不同批次间对应实物(冻干粉)的相似度良好。暂定供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.850。
1.3.3.2.5含量测定
结合处方功效主治及处方药味在处方中的位置，综合确定含量测定指标。由于工艺研究确定水为溶剂，故当归补血汤物质基准中水溶性成分较多，其中君药黄芪，主要成分为黄酮类、皂苷类等，故可测定黄芪甲苷含量，臣药当归主要成分为有机酸、挥发油等，故可测定阿魏酸含量，以综合评价物质基准质量。
①黄芪
照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
a仪器与试药
液相色谱仪：岛津2040C，赛默飞UltiMate 3000；
色谱柱：GL Sciences Lnc
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)；Welch
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)等。
上海越平科学仪器有限公司FA1104(万分之一)
日本岛津科技有限公司AUW1220D(十万分之一)
乙腈为色谱纯：TEDIA生产；甲醇为色谱纯：TEDIA生产；磷酸为色谱纯，Aladdin生产；甲醇为分析纯：常州市鸿盛精细化工有限公司；水为超纯水，成都浩康科技有限公司。
黄芪甲苷对照品(批号：110781-201616，纯度：97.4％)，购自中国食品药品检定研究院。
含量测定方法的初步确定
参照《中国药典》“黄芪颗粒”含量测定
取本品5.0g，精密称定，精密加水50ml，称定重量，超声处理(功率720W，频率40kHz)45分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次30ml，弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(35：65)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(35：65)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.4mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品5.0g，精密称定，精密加水50ml，称定重量，超声处理(功率720W，频率40kHz)30分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次30ml，弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注人液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
e方法学考
a)线性关系考察
精密称取黄芪甲苷对照品15.33071mg(黄芪甲苷对照品(批号：110781-201616，纯度：97.4％)，置25ml量瓶中，加甲醇适量，使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.5973mg/ml的黄芪甲苷对照品贮备溶液；分别精密吸取浓度为0.5973mg/ml对照品溶液2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果如表37。
回归方程：y＝467084x-340818
相关系数：r＝R＝0.9989
结果表明黄芪甲苷酸在0.02757～0.22055μg范围内线性良好。
表37黄芪甲苷线性关系
b)仪器精密度
取黄芪甲苷对照品溶液，按正文测定法项下操作，连续进样6次，测定结果见表38。
表38仪器精密度试验结果(n＝6)
结果表明：RSD<1％，仪器精密度良好。
c)稳定性试验
取本品(批号：DGBXT-2018050801D)5g密称定，按确定供试品溶液的制备和测定法项下操作，分别在制备后放置0、2、4、8、12、24小时进样测定，测定结果见下表39。
表39稳定性试验结果
d)重复性试验
实验人员(A)操作，取本品(批号：DGBXT-2018050801D)约5g(共6份)，精密称定，按正文供试品溶液制备和测定法项下进行操作。结果见表40。
表40重复性试验结果(n＝6)
结果表明，RSD<3.0％，说明本方法的重复性良好。
e)加样回收试验
精密称取黄芪甲苷对照品15.33071mg(批号：110786-201616，纯度97.4％)，置25ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.5973mg/ml的对照品溶液。取物质基准样品黄芪甲苷含量2.263mg/g)，黄芪甲苷加样回收精密称取2.5g，共6份，精密加入黄芪甲苷对照品溶液(浓度：0.5973mg/ml)8.5ml，按供试品溶液的制备方法制备样品溶液，依法测定，结果见表41。
表41黄芪甲苷准确度试验结果(n＝6)
结果，平均回收率为100.79％，RSD<3.0％，表明本方法准确度良好。
f含量测定方法确认
以上的研究结果试验表明，当归补血汤对应实物(冻干粉)中黄芪甲苷的含量测定方法的专属性强，稳定性、重复性、准确度等均符合规定，且色谱条件的耐用性良好，故此液相色谱条件可以用于当归补血汤对应实物(冻干粉)中的黄芪甲苷的含量测定，具体测定条件如下：
色谱条件与系统适用性试验 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(35：65)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.4mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品5.0g，精密称定，精密加水50ml，称定重量，超声处理(功率720W，频率40kHz)45分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次30ml，弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法测定法 精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注人液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
g多批次对应实物(冻干粉)含量测定
按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作，测定15批次对应实物(冻干粉)中黄芪甲苷的含量，结果见表42。
表42 15批次对应实物(冻干粉)中黄芪甲苷的含量
结果表明：15批对应实物(冻干粉)黄芪甲苷范围1.040～1.903mg/g，平均含量1.359mg/g，同时考虑到实际生产过程中的各种影响因素等，暂定本品按干燥品计算，每1g含含黄芪甲苷(C41H68O14)应为0.40～2.3mg(±3倍SD值)。
②当归
照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。
a仪器与试药
液相色谱仪：赛默飞UltiMate3000，安捷伦1260Ⅱ；
色谱柱：GL Sciences Lnc
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)；Welch
AQ-C18(5μm，250×4.6mm)等。
电子天平：奥豪斯仪器(常州)有限公司ScoutSE(百分之一)
上海越平科学仪器有限公司FA1104(万分之一)
日本岛津科技有限公司AUW1220D(十万分之一)
乙腈为色谱纯：TEDIA生产；甲醇为色谱纯：TEDIA生产；磷酸为色谱纯，Aladdin生产；甲醇为分析纯：常州市鸿盛精细化工有限公司；水为超纯水，成都浩康科技有限公司。
阿魏酸对照品(批号：110773-201313，纯度：99.6％)，购自中国食品药品检定研究院。
b色谱条件的选择
a)检测波长的选择
取阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含12μg的溶液，在190～400nm波长下进行扫描，可见阿魏酸在316nm处有最大吸收峰且无杂质干扰，故选用316nm作为检测波长。
b)流动相的选择
方法一：参照《中国药典》当归含量测定
取本品粉末2.5g，精密称定，加适量水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.085％磷酸溶液(17:83)为流动相；检测波长为316mn；柱温35℃。
方法二：参照《中国药典》妇科调经片含量测定
取本品粉末2.5g，精密称定，加适量水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.3％磷酸溶液(18.5:81.5)为流动相测波长为320nm。
结果：通过比较，方法一阿魏酸的分离度达到要求。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.085％磷酸溶液(17:83)为流动相；检测波长为316mn；柱温35℃。
c供试品溶液制备方法考察
a)提取方式的考察
取本品(批号：DGBXT-2018050801D)约2.5g(共3组)，精密称定，加适量水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，分别超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟、回流提取30分钟、直接溶解，精密量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。结果见表43。
表43提取方式考察的结果
结果表明，不同提取方式提取率差别不大，考虑操作方便，故选择溶解处理。
b)提取溶媒的考察
取本品(批号：DGBXT-2018050801D)约2.5g(共3组)，精密称定，取本品粉末2.5g，精密称定，加适量水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，精密量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，分别加水、甲醇定容至刻度，即得。精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。结果如下表44。
表44提取溶媒考察的结果
结果表明：不同提取溶媒含量差别不大，但甲醇处理含量稍高些，故选择甲醇作为提取溶剂。
d含量测定方法的初步确定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.085％磷酸溶液(17:83)为流动相；检测波长为316nm；柱温35℃。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1mL含12μg的溶液，即得
供试品溶液的制备 取本品粉末2.5g，精密称定，加适量水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
e方法学考
a)专属性试验
阿魏酸为当归补血汤中当归的指标性成分，为考察其它药材是否干扰阿魏酸的测定，按处方比例称取药材同法制成阴性样品(批号：DGBXT-2018050801D)，并按照供试品的处理方法制备缺当归的阴性样品溶液进样，记录色谱图。结果表明，阴性色谱中在与阿魏酸相应的保留时间有色谱峰，样品峰面积为2.941，阴性峰面积为0.200，计算可知阴性峰面积为样品峰面积3.4％，小于5.0％，故忽略黄芪干膏对当归补血汤中阿魏酸阴性干扰酸的测定无干扰，以本法测定本品中阿魏酸的含量具有专属性。(见图20)
结果表明，阴性色谱中在与阿魏酸相应的保留时间的色峰有一定的干扰，但干扰的5％内，符合要求，故测定本品中阿魏酸的含量专属性良好。
b)线性关系考察
精密称取阿魏酸对照品13.84mg(批号：110773-201313，纯度：99.6％)，置100ml量瓶中，加70％甲醇适量，使溶解，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.1378464mg/ml的阿魏酸对照品贮备溶液；精密量取对照品贮备液10ml，置于100ml量瓶中，用70％甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为13.78464μg/ml的对照品溶液。精密吸取浓度为13.78464μg/ml对照品溶液2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、18μl、20μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果如下表45。
回归方程：y＝57.909x+0.0238
相关系数：r＝0.9999
结果表明阿魏酸酸在0.02757～0.27569μg范围内线性良好
表45阿魏酸线性关系
取阿魏酸对照品溶液，按正文测定法项下操作，连续进样6次，测定结果见表46。
表46仪器精密度试验结果(n＝6)
结果表明：RSD<1％，仪器精密度良好。
e)稳定性试验
取本品(批号：DGBXT-2018050801D)约2.5密称定，按确定供试品溶液的制备和测定法项下操作，分别在制备后放置0、2、4、8、12、24小时进样测定，测定结果见下表47。
表47稳定性试验结果
f)重复性试验
实验人员(A)操作，取本品(批号：DGBXT-2018050801D)约2.5g(共6份)，精密称定，按正文供试品溶液制备和测定法项下进行操作。结果见下表48。
表48重复性试验结果(n＝6)
结果表明，RSD<3.0％，说明本方法的重复性良好。
g)加样回收试验
精密称取阿魏酸对照品10.09548mg(批号：110773-201313，纯度99.6％)，置10ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.9833mg/ml的对照品溶液。取物质基准样品阿魏酸含量0.6293mg/g)，阿魏酸加样回收精密称取1.5g，共6份，精密加入黄芪甲苷对照品溶液(浓度：0.9833mg/ml)1ml，按供试品溶液的制备方法制备样品溶液，依法测定，结果见表49。
表49阿魏酸准确度试验结果(n＝6)
结果，平均回收率为99.14％，RSD<3.0％，表明本方法准确度良好。
f含量测定方法确认
以上的研究结果试验表明，当归补血汤对应实物(冻干粉)中阿魏酸酸的含量测定方法的专属性强，稳定性、重复性、准确度等均符合规定，故此液相色谱条件可以用于当归补血汤对应实物(冻干粉)中的阿魏酸的含量测定，具体测定条件如下：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.085％磷酸溶液(17：83)为流动相；检测波长为316nm；柱温35℃。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于7000。
对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1mL含12μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末2.5g，精密称定，加适量水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
g多批次对应实物(冻干粉)含量测定
按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作，测定15批次对应实物(冻干粉)中阿魏酸的含量，结果见表50。
表50 15批次对应实物(冻干粉)中阿魏酸的含量
结果表明：15批对应实物(冻干粉)阿魏酸范围0.296～0.660mg/g，平均含量0.409mg/g，同时考虑到实际生产过程中的各种影响因素等，暂定本品按干燥品计算，每1g当归补血汤物质基准含阿魏酸(C10H10O4)应为0.001～0.817mg(±3SD值)。
1.3.4对应实物的质量分析
1.3.4.1对应实物制备
将处方中药味，按照确定工艺，详见“资料8.2工艺研究”，将处方中各15批合格饮片进行物质基准的制备，每批投料10倍日处方量，约480g，平行制备15批次物质基准，具体制备结果如表51
表51 15批物质基准对应批号
1.3.4.2对应实物测定方法
(1)出膏率测定：按本发明测定方法测定，对不同批次物质基准出膏率进行检测。
(2)水分测定：参照《中国药典》2015年版四部通则0832水分测定第二法，取供试品约2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称定，开启瓶盖在105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，放冷，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量(％)。
(3)浸出物测定：参照2015年版《中国药典》通则2201醇溶性热浸法测定：取本品适量，研细，取约2g，精密称定，置100ml的锥形瓶中，精密加乙醇100ml，密塞，称定重量，静置1小时后，采用热浸法进行浸出物测定，精密量取滤液25ml置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。计算供试品中醇溶性浸出物的含量(％)。
(4)指纹图谱测定：药材、饮片、中间体、对应实物测定方法详见“资料6.3.4.1质量标准正文”，根据15批次物质基准指纹图谱测定结果，标出10个共有峰，并生成对照指纹图谱，计算相似度。药材、饮片、中间体供试品制备方法如下：
a黄芪药材溶液：称取黄芪药材粉末2.5g，精密称定，用50％甲醇50ml精密量取，超声提取45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇液，用30ml氨试液萃取一次，弃氨试液层，正丁醇层蒸干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，弃洗脱液，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，残渣加50％甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过0.45μm滤膜，即得。
b黄芪饮片溶液：称取黄芪饮片粉末2.5g，精密称定，用50％甲醇50ml精密量取，超声提取45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇液，用30ml氨试液萃取一次，弃氨试液层，正丁醇层蒸干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，弃洗脱液，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，残渣加50％甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过0.45μm滤膜，即得。
c当归药材溶液：称取当归药材粉末2.5g，精密称定，用50％甲醇50ml精密量取，超声提取45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇液，用30ml氨试液萃取一次，弃氨试液层，正丁醇层蒸干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，弃洗脱液，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，残渣加50％甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过0.45μm滤膜，即得。
d当归饮片溶液：按称取当归饮片粉末2.5g，精密称定，用50％甲醇50ml精密量取，超声提取45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇液，用30ml氨试液萃取一次，弃氨试液层，正丁醇层蒸干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，弃洗脱液，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，残渣加50％甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过0.45μm滤膜，即得。
e中间体(提取液)：精密量取当归补血汤物质基准提取液25ml，用50％甲醇50ml精密量取，超声提取45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇液，用30ml氨试液萃取一次，弃氨试液层，正丁醇层蒸干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，弃洗脱液，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，残渣加50％甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过0.45μm滤膜，即得。
f中间体(浓缩液)：精密量取当归补血汤物质基准浓缩液5ml，用50％甲醇50ml精密量取，超声提取45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇液，用30ml氨试液萃取一次，弃氨试液层，正丁醇层蒸干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，弃洗脱液，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，残渣加50％甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过0.45μm滤膜，即得。
g干膏粉：精密量取当归补血汤物质基准干膏粉2.5g，用50％甲醇50ml精密量取，超声提取45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和的正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇液，用30ml氨试液萃取一次，弃氨试液层，正丁醇层蒸干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，弃洗脱液，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，残渣加50％甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过0.45μm滤膜，即得。
(5)含量测定：按本发明对应实物阿魏酸黄芪甲苷测定方法测定。中间体供试品制备方法如下：
1)提取液
①阿魏酸含量测定
提取液：精密量取提取液10ml置25ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
②黄芪甲苷含量测定
提取液：精密量取提取液50ml，称定重量，超声处理(功率720W，频率40kHz)30分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次30ml，弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2)缩液
①阿魏酸含量测定
浓缩液：精密量取提取液2ml置25ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
②黄芪甲苷含量测定
浓缩液：精密量取浓缩液10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，称定重量，超声处理(功率720W，频率40kHz)30分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次30ml，弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
1.3.4.3测定结果
结果见汇总表52
表52不同批次物质基准测定结果
1.3.4.4对应实物关键质量属性范围的确定
(1)出膏率
15批次物质基准出膏率范围13.39～22.25％，平均出膏率17.83％，均在3SD浮动范围10.67～25.0％；±30％浮动范围12.48～23.18％。暂定出膏率范围为10.00～25.00％。
(2)水分
15批次物质基准水分范围5.56～11.80％，平均水分9.04％，暂定水分不得过12.0％。
(3)浸出物
15批次物质基准浸出物范围27.47～57.33％，平均浸出物42.15％，暂定浸出物范围为30.0～55.0％。
(4)指纹图谱
15批次当归补血汤物质基准指纹图谱生成对照指纹图谱，以次比较15批次物质基准相似度均大于0.850，不同批次间物质基准的相似度良好，暂定指纹图谱相似度限度为≥0.850。
(5)含量测定
15批物质基准阿魏酸酸范围0.296～0.660mg/g，平均含量0.409mg/g，均在±30％及3SD范围内；参照±30％及3SD浮动范围，同时考虑到实际生产过程中的各种影响因素等，暂定本品按干燥品计算，每1g当归以阿魏酸(C10H10 O4)计，应为0.001～0.817mg。
15批物质基准黄芪甲苷范围1.040～1.903mg/g，平均含量1.359mg/g，均在3SD浮动范围内，考虑到实际生产过程中的各种影响因素等，暂定本品按干燥品计算，每1g含黄芪甲苷(C41H68O14)计，应为0.40～2.3mg。
1.4.1当归补血药物组合物检测方法起草说明
1.4.1.1处方
本方出金元·李东垣《内外伤辨惑论》。原方名当归补血汤，详细研究见“处方考证及历史沿革”资料。
1.4.1.2制法
根据经典名方目录中记载的方法进行煎煮。采用电子煎药罐(容量9L)煎煮，以出膏率、阿魏酸、黄芪甲苷提取总量、指纹图谱为指标，研究物质基准饮片前处理、加热方式、煎煮时间、滤过及干燥工艺等进行研究相关参数，从而确定当归补血汤物质基准工艺。按照确定工艺，采用10倍日处方量进行投料，每组实验设计两个平行样，每个平行样包括10份日处方量，提取液混合，浓缩，再分盘冷冻干燥。得到15批物质基准对应实物，结果显示物质基准制备工艺稳定、可行。当归补血汤物质基准制法为：黄芪400g，当归80g，以上两味，加水4000ml，浸泡40min，电子煎药罐煎煮60分钟，滤过，浓缩冷冻干燥，即得。
1.4.1.3性状
根据多批次样品的实际观察情况，暂定本品为浅黄色粉末；气微，味微甜。
1.4.1.4鉴别
本品由两味中药制成，系用水煎煮工艺制成的复方制剂，选用了专属性强，快速、简便、重现性好的薄层鉴别方法，对方中黄芪、当归的主要特征成分进行鉴别试验研究，确定以黄芪、当归纳入质量标准。
(1)黄芪薄层鉴别
黄芪主要化学成分为皂苷类和黄酮类，除此之外还含有多糖等。根据以上化学成分对黄芪进行如下薄层色谱的摸索实验，确定鉴别方法
取本品1.5g，加水25ml使溶解，超声处理30分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次30mL，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪饮片1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，同法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液各10μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷_甲醇-水(13:7:2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。
通过对低温、常温、高温环境及机制硅胶G薄层板自制硅胶G薄层板进行耐用性考察，结果不同影响因素下，此薄层鉴别条件耐用性良好。不同批次对应实物(冻干粉)的供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。故将此薄层方法列入正文。
(2)当归薄层鉴别
当归中主要含有阿魏酸、藁本内酯等苯化合物。挥发油是当归的主要活性成分，主要含有藁本内酯等酯类成分，藁本内酯经过提取干燥后，在干膏粉中占比不大，故意阿魏酸化学成分对当归进行如下薄层摸索实验，并确定如下方法。
取本品1.5g，加1％碳酸氢钠溶液50ml，超声处理10分钟，离心，取上淸液用稀盐酸调节pH值至
用乙醚振摇提取2次，每次20ml合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取当归饮片1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述四种溶液各10μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。
通过对低温、常温、高温环境及机制硅胶G薄层板自制硅胶G薄层板进行耐用性考察，结果不同影响因素下，此当归薄层鉴别条件耐用性良好。不同批次物质基准的供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同颜色斑点。故将此薄层方法列入正文。
1.4.1.5检查
(1)水分
照水分测定法(《中国药典》2015年版四部通则0832第二法)，测定不同批次物质基准水分，15批次物质基准水分范围5.56％～14.54％，平均水分9.40％，暂定本品水分不得过12.0％。
1.4.1.6浸出物
中药材中的化学成分或大类成分多数可以在水或醇中溶出，进而进行浸出物测定。由于当归补血汤物质基准是水提取，选择水为溶剂建立浸出物测定意义不大，难以反映内在质量，故选溶剂时，要考虑大类成分的溶解度，选择乙醇进行浸出物测定，以控制物质基准的质量。照浸出物测定法(《中国药典》2015年版四部通则2201醇溶性热浸法)测定15批经典名方物质基准中浸出物的含量，浸出物范围27.47～57.33％，平均浸出物42.15％。考虑到实际生产过程中的各种影响因素等，暂定本品醇溶性浸出物的含量为30.0％～55.0％。。
1.4.1.7指纹图谱
由于单纯的指标成分的定性鉴别和定量分析，难以反映物质基准质量的优劣。作为衡量物质基准对应实物是否与物质基准基本一致的标准参照物，其质量应加强专属性鉴别和多成分、整体质量控制。因而物质基准质量控制要重视以指纹图谱为主的整体质量控制。
对方法进行摸索，并对物质基准指纹图谱中各色谱峰进行药味归属及参照物的选择(选择保留时间适中，响应值较高，达到基线分离的毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为参照物)，初步确定指纹图谱测定方法。对初步确定的指纹图谱方法进行方法学验证，方法的专属性良好，空白溶剂无干扰，同时基本满足了信息量最大的原则，且方法精密度、重复性、稳定性(24小时内)均符合规定(各色谱峰相对保留时间RSD小于2％)，且色谱图中各共有峰峰型尖锐，对称，分离度良好，故将此方法确定为指纹图谱测定方法列入标准正文：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm，柱温25℃。理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000。
表53梯度洗脱表
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约2.5g，精密称定，用50％甲醇50ml超声45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用30ml的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
按照上述确定方法对15批物质基准进行测定，并对所得指纹图谱进行分析，选择15批物质基准指纹图谱中稳定性较好、响应值适宜的色谱峰为共有峰，共标定了10个共有峰。采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2012年版》，以1批当归补血汤物质基准对应实物(干膏粉)HPLC图谱色谱峰进行自动匹配，形成共有模式图，并建立对照图谱。以共有峰对15批样品与对照指纹图谱的相似度进行计算，均大于0.90，故选择指纹图谱作为当归补血汤物质基准的评价标准，暂定本品与当归补血汤物质基准对照指纹图谱比较，其相似度不得低于0.90。
1.4.1.8含量测定
结合处方功效主治及处方药味在处方中的位置，综合确定含量测定指标。由于工艺研究确定水为溶剂，故当归补血汤物质基准中水溶性成分较多，其中君药黄芪，主要成分为黄酮类、皂苷类等，故可测定黄芪甲苷含量，臣药当归主要成分为有机酸、挥发油等，故可测定阿魏酸含量，以综合评价物质基准质量。
(1)黄芪
对黄芪甲苷测定方法进行摸索，初步确定含量测定方法。对初步确定的方法进行方法学验证，方法的专属性良好，缺黄芪阴性样品无干扰，目标峰纯度合格，黄芪甲苷在进样量为1.1946μg～11.946μg的范围内线性良好。且方法精密度(RSD＜2.0％)、重复性(RSD＜3.0％)、稳定性(24小时内RSD＜3.0％)、平均回收率为100.79％，RSD为2.09％符合规定，色谱条件的耐用性良好，故此液相色谱条件可以用于当归补血汤对应实物(冻干粉)中的黄芪甲苷的含量测定，具体测定条件如下：
色谱条件与系统适用性试验 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(35：65)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.4mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品5.0g，精密称定，精密加水50ml，称定重量，超声处理(功率720W，频率40kHz)45分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次30ml，弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法测定法 精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注人液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
15批对应实物(冻干粉)黄芪甲苷范围1.040～1.903mg/g，平均含量1.359mg/g，同时考虑到实际生产过程中的各种影响因素等，暂定本品按干燥品计算，每1g含含黄芪甲苷(C41H68O14)应为0.40～2.3mg(±3倍SD值)。
(2)当归
对阿魏酸测定方法进行摸索，初步确定含量测定方法。对初步确定的方法进行方法学验证，方法的专属性良好，缺当归阴性样品干扰不明显，目标峰纯度合格，阿魏酸在进样量为0.02757μg～0.27569μg的范围内线性良好。且方法精密度(RSD＜2.0％)、重复性(RSD＜3.0％)、稳定性(24小时内RSD＜3.0％)、准确度平均回收率为99.71％，RSD为0.86％符合规定，色谱条件的耐用性良好，故此液相色谱条件可以用于当归补血汤对应实物(冻干粉)中的阿魏酸的含量测定，具体测定条件如下：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.085％磷酸溶液(17：83)为流动相；检测波长为316nm；柱温35℃。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于7000。
对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1mL含12μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末2.5g，精密称定，加适量水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
15批对应实物(冻干粉)阿魏酸范围0.296～0.660mg/g，平均含量0.409mg/g，同时考虑到实际生产过程中的各种影响因素等，暂定本品按干燥品计算，每1g当归补血汤物质基准含阿魏酸(C10H10O4)应为0.001～0.817mg(±3SD值)。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种当归补血药物组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体为：取黄芪300～500份、当归70～90份，置于电子煎药罐中，加水4000～6000ml，浸泡20～60min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮40～80分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度45～75℃条件下浓缩至100～400ml，浓缩液在温度-40～-80℃，真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体为：取黄芪400份、当归80份，置于电子煎药罐中，加水4000ml，浸泡40min，加盖煎煮，武火煮沸转为小火煎煮保持微沸，煎煮60分钟，200目滤布趁热滤过，滤液在真空减压、温度55～65℃条件下浓缩至200ml，浓缩液在温度-50～-70℃、真空度＜300Pa的条件下经冷冻干燥，收集干膏粉，即得，或收集干膏粉后加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的制剂。
3.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的药学上可接受的制剂为固体制剂或液体制剂，所述的固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、冻干粉针剂；所述液体制剂为注射制剂、口服液。
4.一种当归补血药物组合物的检测方法，其特征在于，该检测方法用于检测权利要求1-2任一项所述制备方法或权利要求3所述制备方法制出的产品，具体检测方法为：
性状为：本品为浅黄色粉末；气微，味微甜；
黄芪薄层鉴别方法为：
取本品1.0～3.0g，加水15～35ml使溶解，超声处理20～40分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2～4次，每次15～35ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2～4次，每次20～40mL，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪饮片1～2g，加水40～60ml，煎煮20～40分钟，滤过，同法制成对照药材溶液；再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为13:7:2的三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
当归薄层鉴别方法为：
取本品1.0～3.0g，加0.5～1.5％碳酸氢钠溶液40～60ml，超声处理5～15分钟，离心，取上淸液用稀盐酸调节pH值至2～3，用乙醚振摇提取2～4次，每次15～25ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液；另取当归对照药材1.0～3.0g，加水40～60ml，煎煮20～40分钟，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为4：1：1：0.1的环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
检查水份的方法为：照《中国药典》2015年版四部通则0832第二法测定水分不得过12.0％；
检查浸出物的方法为：取本品2g，精密称定，照《中国药典》2015年版四部通则2201醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，醇溶性浸出物的含量应为30.0～55.0％；
指纹图谱检测：照高效液相色谱法《中国药典》2015年版四部通则0512测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱；检测波长为
柱温
理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000；梯度洗脱规定为：
时间(min) 乙腈(A) 0.1％磷酸(B)
0 20 80
60 40 60
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加
甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得；
供试品溶液的制备 精密称定本品
用
甲醇
超声
滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取
次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用
的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水
洗脱，后用95％乙醇
洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得；
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；
供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，供试品色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个共有峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以共有峰计算相似度，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90，对照指纹图谱见图1。
含量测定 照高效液相色谱法《中国药典》2015年版四部通则0512测定；
黄芪含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为35：65的乙腈-水为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.4mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品
精密称定，精密加水
称定重量，以功率720W，频率40kHz超声处理
分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取
次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤
次，每次
弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法 精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注人液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得；
本品按干燥品计算，每g含黄芪以黄芪甲苷计，应为0.40～2.3mg；
当归含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为17：83的乙腈-0.085％磷酸溶液为流动相；检测波长为
柱温35℃，理论板数按阿魏酸峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60～80％甲醇制成每1mL含12μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品粉末1.5～3.5g，精密称定，加水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，每g含当归以阿魏酸酸计，应为0.001～0.817mg。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述黄芪薄层鉴别方法为：取本品1.5g，加水25ml使溶解，超声处理30分钟，滤过，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次30mL，分取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪饮片1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，同法制成对照药材溶液；再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为13:7:2三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，当归薄层鉴别方法为：
取本品1.5g，加1％碳酸氢钠溶液50ml，超声处理10分钟，离心，取上淸液用稀盐酸调节pH值至2～3，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液；另取当归饮片1.5g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，同法制成对照药材溶液；再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液，照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为4：1：1：0.1的环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同颜色斑点。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，指纹图谱检测方法为：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按以下规定进行梯度洗脱；检测波长为208～230nm，柱温22～28℃；理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000；梯度洗脱规定为：
时间(min) 乙腈(A) 0.1％磷酸(B)
0 20 80
60 40 60
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品
精密称定，用
甲醇
超声
滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取
次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用
的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得；
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；
供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，供试品色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个共有峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以共有峰计算相似度，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。对照指纹图谱见图1。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，指纹图谱检测方法为：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按以下规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm，柱温25℃；理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于5000；梯度洗脱规定为：
时间(min) 乙腈(A) 0.1％磷酸(B)
0 20 80
60 40 60
参照物溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量、阿魏酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含200μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、含100μg阿魏酸混合溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品约2.5g，精密称定，用50％甲醇50ml超声45min，滤过，滤液减压回收溶剂至近干，残渣加20ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇溶液，用30ml的氨试液萃取1次，弃氨试液，正丁醇层溶液挥干，残渣用2ml水溶解，经装有10mlD101大孔吸附树脂的柱色谱，先用水50ml洗脱，后用95％乙醇100ml洗脱，将95％乙醇洗脱液减压回收溶剂至近干，50％甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得；
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，供试品色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个共有峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以共有峰计算相似度，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90，对照指纹图谱见图1。
9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述黄芪含量测定方法：
照高效液相色谱法《中国药典》2015年版四部通则0512测定；
色谱条件与系统适用性试验 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为35：65的乙腈-水为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.4mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品5.0g，精密称定，精密加水50ml，称定重量，以功率720W，频率40kHz超声处理45分钟，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次30ml，弃去氨试液洗液，分取正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法测定法 精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液20μL，注人液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得；
本品按干燥品计算，每g含黄芪以黄芪甲苷计，应为0.40～2.3mg。
10.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述当归含量测定方法为：照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为17：83的乙腈-0.085％磷酸溶液为流动相；检测波长为316nm；柱温35℃；理论板数按阿魏酸峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1mL含12μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品粉末2.5g，精密称定，加水使之溶解，转移至50ml的容量瓶中，加水定容至刻度，量取水溶液10ml于25ml的容量瓶中，精密量取，加甲醇定容至刻度，即得供试品溶液；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，每g含当归以阿魏酸酸计，应为0.001～0.817mg。
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