CN112578055B - 藕节及藕节炭对照提取物的制备工艺及其质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了藕节及藕节炭对照提取物的制备工艺及其质量控制方法，取藕节分别炮制而得藕节及藕节炭饮片，加水煎煮两次，一煎加9倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮30分钟，过滤，立即冷却至室温；二煎加7倍水，煮沸，保持微沸煎煮20分钟，过滤，合并水煎液，冷却至室温，真空冷冻干燥，即得藕节及藕节炭对照提取物。通过合理控制煎煮次数、加水量、煎煮时间等，能有效控制收粉率及其有效成分总多酚的含量，保证了藕节及藕节炭对照提取物成分的稳定性，且工艺运行稳定。同时，建立了藕节及藕节炭对照提取物的特征图谱及其总多酚含量的测定方法，可实现藕节及藕节炭对照提取物制备工艺稳定性和可靠性的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂及检测领域，具体涉及藕节及藕节炭对照提取物的制备工艺及其质量控制方法。
背景技术
随着现代中药制剂的研究和发展，传统的煎煮方式存在的不便性和疗效上的不确定性越显突出，并在很大程度上影响并制约了中药制剂在市场上的应用和推广，为最大限度的提高药效，降低毒副作用，满足中医临床要求，改善中药制剂的提取工艺并建立专属的质量控制是关键。
藕节为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥根茎节部经去杂，洗净，干燥而制成，具有止血、消淤的作用，用于治疗吐血、咯血、尿血、衄血、崩漏等症，具有较高的药用价值。现有研究表明，藕节中含有丰富的酚类物质，主要由多巴、儿茶酚、没食子酸、儿茶素和表儿茶素等组成，是藕节主要功能的活性成分。为促进藕节在中药制剂中的制备和开发，势必需要对藕节中的酚类物质进行有效的提取和质量控制。
覃海明等在“莲藕多酚的提取工艺优化及抗氧化活性评价”(《食品工业科技》，2015年第4期，242-246)中公开了对莲藕中多酚的提取方法：取粉碎莲藕渣，加入一定料液比的乙醇溶液，置于控温的超声场中持续浸提，浸提液经过滤浓缩，真空冷冻干燥后得到粉末状的鲜黄色多酚粗提物，其多酚含量可以达到19.73mgGAE/100mg干重，多酚浸提得率可达到0.23％。
藕节炭为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥根茎节部经炒炭法炒至表面黑褐色或焦黑色，内部黄褐色或棕褐色的炮制品。具有收敛止血，化瘀的功效，可用于吐血、咯血、忸血、尿血、崩漏等症。现有研究表明，藕节炭中的总多酚类物质具有止血的作用，为促进藕节炭在中药制剂中的制备和开发，势必需要对藕节炭中的总多酚类物质进行有效的提取和质量控制。
刘善新等在“不同地区市售藕节炭质量研究”(《中华中医药杂质》2011年2月第26卷第2期，274-276)中通过对不同地区市售藕节炭的炒炭程度、水分、总灰分、酸不溶性灰分、水浸出物、重金属进行考察，采用可见-紫外分光光度法对总多酚进行测定，发现不同地区市售藕节炭质量存在较大差异，因此，建立了采用总多酚含量测定方法实现的藕节炭质量标准控制。为更加准确、快速的实现藕节炭的质量控制，刘善新等在“藕节、藕节炭HPLC指纹图谱研究”中还提出了以3-表白桦脂酸为对照品，藕节炭的甲醇提取物为供试品溶液，照液相色谱法进行检测，建立了藕节、藕节炭HPLC指纹图谱的共有模式，从而实现其质量的控制。
发明内容
本发明的目的在于提供藕节及藕节炭对照提取物的制备工艺，采用藕节炮制而得的藕节饮片和藕节炭饮片为原料分别经煎煮提取而制得，制备过程中，通过合理控制煎煮次数、加水量、煎煮时间等，能有效控制收粉率及其有效成分总多酚的含量，保证了藕节及藕节炭对照提取物成分的稳定性，且工艺运行稳定。
为实现藕节及藕节炭对照提取物制备工艺的稳定性和可靠性，本发明的另一目的在于提供藕节及藕节炭对照提取物制备工艺的质量控制方法。
本发明通过下述技术方案实现：藕节对照提取物的制备工艺，取藕节炮制而得的藕节饮片，加水煎煮两次，一煎加9倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮30分钟，过滤，冷却至室温；二煎加7倍水，煮沸，保持微沸煎煮20分钟，过滤，合并水煎液，冷却至室温，真空冷冻干燥，即得藕节对照提取物。
所述藕节对照提取物中总多酚的含量为1.5～3.5％。
藕节对照提取物的质量控制方法，包括构建所述藕节对照提取物的特征图谱，步骤如下：
A.分别制备藕节对照药材的参照物溶液和藕节对照提取物的供试品溶液；
B.分别取参照物溶液和供试品溶液，按高效液相色谱法进行测定，得到对应的特征图谱；
C.以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建藕节对照提取物的特征图谱。
所述步骤A中，参照物溶液的制备包括：取藕节对照药材，加70％甲醇10ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所述步骤A中，供试品溶液的制备包括：取藕节对照提取物，加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所述步骤B中，按高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，在流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为275nm下进行测定。
所述梯度脱洗满足以下条件：
0～60min，流动相A：5％→90％，流动相B：95％→10％。
所述共有峰包括7个特征峰。
还包括对所述藕节对照提取物中总多酚的含量进行测定，步骤如下：
A.分别制备没食子酸对照品溶液、标准曲线和藕节对照提取物的供试品溶液，
没食子酸对照品溶液的制备包括：取没食子酸对照品，加水制成每1ml含50μg的溶液，即得，
标准曲线的制备包括：分别取没食子酸对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，均加入1ml磷钼钨酸试液，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，
供试品溶液的制备包括：取藕节对照提取物，加水80ml，超声处理30分钟，放冷，用水稀释至100ml，摇匀，静置，滤过，即得；
B.精密量取供试品溶液2ml，照标准曲线的制备方法，测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量，计算得藕节对照提取物中总多酚的含量，所述总多酚的含量限度为1.5～3.5％。
藕节炭对照提取物的制备工艺，取藕节炮制而得的藕节炭饮片，加水煎煮两次，一煎加9倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮30分钟，过滤，立即冷却至室温；二煎加7倍水，煮沸，保持微沸煎煮20分钟，过滤，合并水煎液，冷却至室温，真空冷冻干燥，即得藕节炭对照提取物。
所述藕节炭对照提取物中总多酚的含量为2.0～4.0％。
藕节炭对照提取物制备工艺的质量控制方法，包括构建所述藕节炭对照提取物的特征图谱，步骤如下：
A.分别制备参照物溶液和藕节炭对照提取物的供试品溶液；
B.分别取参照物溶液和供试品溶液，按高效液相色谱法进行测定，得到对应的特征图谱；
C.以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建藕节炭对照提取物的特征图谱。
所述步骤A中，参照物溶液的制备包括：
藕节炭对照药材的参照物溶液：取藕节炭药材，加入70％甲醇10ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
5-羟甲基糠醛对照品的参照物溶液：取5-羟甲基糠醛对照品，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得。
所述步骤B中，按高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，在流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为275nm下进行测定。
所述梯度脱洗满足以下条件：
0～60min，流动相A：5％→90％，流动相B：95％→10％。
所述共有峰包括4个特征峰，与5-羟甲基糠醛参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内，规定值为：峰2：1.362、峰3：3.113、峰4：4.303。
还包括对所述藕节炭对照提取物中总多酚的含量进行测定，步骤如下：
A.分别制备没食子酸对照品溶液、标准曲线和藕节炭对照提取物的供试品溶液，
没食子酸对照品溶液的制备包括：取没食子酸对照品，加水制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。
标准曲线的制备包括：分别取没食子酸对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，均加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置40分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液的制备包括：取藕节炭对照提取物，加水80ml，超声处理30分钟，放冷，用水稀释至100ml，摇匀，静置，滤过，即得。
B.精密量取供试品溶液2ml，照标准曲线的制备方法，测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量，计算，即得藕节炭对照提取物中总多酚的含量，所述总多酚的含量限度为2.0～4.0％。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
(1)本发明方法提供了基于煎煮工艺实现的藕节及藕节炭对照提取物的制备方法，通过合理控制煎煮过程的工艺参数条件，如加水量及煎煮时间，能合理控制收粉率及其有效成分总多酚的含量，保证了藕节及藕节炭对照提取物成分的稳定性，为后续藕节及藕节炭制剂在中药自动配药机中的应用提供更加稳定和精确的数据。
(2)本发明为藕节及藕节炭对照提取物的制备工艺建立了专属的质量控制方法，以藕节及藕节炭药材为参照物，在特定的检测条件下，构建得到藕节及藕节炭对照提取物的特征图谱，可快速并高效地实现藕节及藕节炭对照提取物的质量控制。
(3)本发明同时还建立了藕节及藕节炭对照提取物中总多酚含量的测定方法，以总多酚中没食子酸为对照品，通过标准曲线的绘制，测定藕节及藕节炭对照提取物中有效成分总多酚的含量，分别以没食子酸(C7H6O5)计范围应为1.5～3.5％和2.0～4.0％，可用于藕节及藕节炭对照提取物制备工艺的质量控制。
综上所述，本发明提出了藕节及藕节炭对照提取物的制备工艺并为此建立了专属的质量控制方法，实现了从药材、制备工艺过程及有效成分含量的全面反映，更好的符合中药制剂的规范要求，保证了中药制剂含量的合理性。
附图说明
图1为藕节吸水率曲线。
图2为藕节对照提取物冻干工艺。
图3为18批藕节对照提取物收粉率分布图。
图4为18批藕节对照提取物水分分布图。
图5为藕节对照提取物的特征图谱。
图6为藕节对照提取物的3D色谱图。
图7为藕节对照提取物不同波长色谱图。
图8为柱温考察色谱图(藕节)。
图9为流速考察色谱图(藕节)。
图10为延迟性实验色谱图(藕节)。
图11为提取方法考察色谱图(藕节)。
图12为提取溶剂考察色谱图(藕节)。
图13为提取时间考察色谱图(藕节)。
图14为藕节对照提取物特征图谱专属性考察色谱图。
图15为藕节对照药材特征图谱。
图16为不同仪器考察色谱图(藕节)。
图17为藕节对照提取物色谱柱耐用性考察色谱图。
图18为藕节对照提取物特征图谱(a)。
图19为藕节对照提取物特征图谱(b)。
图20为专属性考察图(藕节)。
图21为没食子酸标准曲线图(藕节)。
图22为藕节对照提取物含量分布图。
图23为藕节炭吸水率曲线。
图24为藕节炭对照提取物冻干工艺。
图25为18批藕节炭对照提取物收粉率分布图。
图26为18批藕节炭对照提取物水分分布图。
图27为藕节炭对照提取物的特征图谱。
图28为藕节炭对照提取物的3D色谱图。
图29为藕节炭对照提取物不同波长色谱图。
图30为柱温考察色谱图(藕节炭)。
图31为流速考察色谱图(藕节炭)。
图32为延迟性实验色谱图(藕节炭)。
图33为提取方法考察色谱图(藕节炭)。
图34为提取溶剂考察色谱图(藕节炭)。
图35为提取时间考察色谱图(藕节炭)。
图36为藕节炭对照提取物特征图谱专属性考察色谱图。
图37为不同仪器考察色谱图(藕节炭)。
图38为藕节炭对照提取物色谱柱耐用性考察色谱图。
图39为藕节炭对照提取物特征图谱(a)。
图40为藕节炭对照提取物特征图谱(b)。
图41为专属性考察图(藕节炭)。
图42为没食子酸标准曲线图(藕节炭)。
图43为藕节炭对照提取物含量分布图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
本实施例提出了藕节对照提取物的制备工艺。
取藕节饮片100g，加水煎煮两次，一煎加9倍水(液面没过饮片高度应为2～5cm)，浸泡30分钟，先用武火煮沸后，改用文火慢煎30分钟，采用200目筛网趁热过滤，滤液在冷水环境下快速冷却至室温；二煎加7倍水(液面没过饮片高度应为2～5cm)，先用武火煮沸后，改用文火慢煎20分钟，采用200目筛网过滤，合并水煎液，滤液在冷水环境下快速冷却至室温，按下表1中的冻干工艺进行真空冷冻干燥后，在温度10～26℃、相对湿度40～60％环境下，按煎煮批次，快速收粉(收粉率范围应为5.0～10.0％)、称量、分装于棕色西林瓶，并封口、贴标签，制得藕节对照提取物。
表1冻干工艺
| 工艺区段 | 时间(h) | 温度(℃) |
| 1 | 3 | -50 |
| 2 | 1 | -40 |
| 3 | 1 | -30 |
| 4 | 2 | -20 |
| 5 | 3 | -10 |
| 6 | 3 | 0 |
| 7 | 3 | 10 |
| 8 | 2 | 20 |
| 9 | 2 | 30 |
| 10 | 22 | 45 |
以下是对藕节对照提取物制备工艺的研究。
1.仪器与设备
电子天平：上海方瑞仪器有限公司JY系列百分之一天平；
煎药壶：美味世家全自动分体式陶瓷煎药壶4升；
筛网：九峰筛网200目；
真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司LGJ-100F；
西林瓶压盖机：SZ20A；2000ml不锈钢量杯若干；西林瓶：10ml，30ml，50ml若干。
2.前处理工艺研究
参考《中国药典》2015年版一部藕节【炮制】项下相关规定及第四部通则0213炮制通则相关规定进行藕节饮片的炮制，具体方法为：除去杂质，洗净，干燥。
3.制备工艺研究
3.1提取溶媒
依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，确定藕节对照提取物的制备提取溶媒为水。
3.2取样量
用于制备藕节对照提取物的饮片取样量定为100g。
3.3浸泡
依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，待煎饮片应当先行浸泡，浸泡时间应根据饮片的质地确定，一般不少于30min。确定浸泡时间为30min。
3.4煎煮次数
依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，煎煮次数定为2次。
3.5加水量
取同一批号藕节50g(批号：010348-1811001)，两份，分别加入10倍量的水(500g)，分别在浸泡5min、10min、20min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、24h测定，计算吸水率，结果见下表2，吸水率曲线见图1。
表2藕节吸水率变化
| 测定时间 | 实验1吸水率(％) | 实验2吸水率(％) | 平均值(％) |
| 0 | 0 | 0 | 0 |
| 5min | 32.5 | 29.9 | 31.2 |
| 10min | 36 | 34.8 | 35.4 |
| 20min | 41.1 | 40.1 | 40.6 |
| 30min | 47.1 | 57.6 | 52.4 |
| 1h | 60.9 | 69.6 | 65.3 |
| 2h | 77.5 | 76.8 | 77.2 |
| 4h | 103.4 | 103.6 | 103.5 |
| 6h | 127 | 119.5 | 123.3 |
| 8h | 145.1 | 141.2 | 143.2 |
| 24h | 173.2 | 168.6 | 170.9 |
由藕节的吸水率曲线可知其在前30min急剧吸水，30min时的平均吸水率为52.4％，30min后增长率逐渐减小，8-24h吸水接近饱和，24h时的平均吸水率为170.9％。
取饮片100g(批号：010348-1811001))于煎药壶，分别加入5倍7倍水、9倍水、11倍水、13倍水，观察水面没过饮片的高度，结果见下表3。
表3不同加水量液面高度
| 加水量 | 药/液面高度(cm) | 浸过药面高度(cm) |
| 未加水 | 1.2 | 0 |
| 5倍 | 2.4 | 1.2 |
| 7倍 | 3.3 | 2.1 |
| 9倍 | 3.7 | 2.5 |
| 11倍 | 4.1 | 2.9 |
| 13倍 | 4.6 | 3.4 |
结果表明，当加水量为7～13倍时，浸过药面高度均在2～5cm范围，参考其吸水率，同时保证不同批次饮片均能在2～5cm范围，确定一煎加水倍数为9倍，二煎加水量为7倍。
3.6煎煮时间
藕节属于止血类药，按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中对照提取物制备的规定：煎煮时间应当根据方剂的功能主治和药物的功效确定。一般药物煮沸后再煎煮20～30分钟；解表类、清热类、芳香类药物不宜久煎，煮沸后再煎煮15～20分钟；滋补药物先用武火煮沸后，改用文火慢煎约40～60分钟。药剂第二煎的煎煮时间应当比第一煎的时间略缩短。确定藕节对照提取物第一煎先用武火煮沸后，改用文火慢煎30min，第二煎先用武火煮沸后，改用文火慢煎20min。
3.7固液分离
根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》，并结合大生产，采用200目筛网趁热过滤。
3.8真空冷冻干燥
根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中要求，对照提取物干燥过程推荐采用真空冷冻干燥方法制备为宜，可保证其质量的稳定、易于保存。真空冷冻干燥工艺参数见下表4及图2。
表4冻干工艺
实施例2：
本实施例涉及18批次藕节对照提取物的制备。按照实施例1所述制备工艺，取18批次藕节药材制备藕节对照提取物。
1.来源
收集18批来自四川双流、湖北十堰、河南西乡等产区的藕节药材，按实施例1选用方式进行炮制。因18批次藕节药材已经在产地加工时除去杂质，洗净，干燥，药材中几乎无杂质存在，可在此将藕节药材同时视为产地饮片，作为对照提取物的制备原料药。
以上18批药材均符合《中国药典》2015版的要求，见下表5。
表5检验结果汇总表
2.性状
用18批藕节饮片进行对照提取物的制备，每批藕节饮片制1批对照提取物，共制得18批冻干粉，各对照提取物批号所对应饮片及药材批号及各批对照提取物性状见下表6。
表6 18批次藕节对照提取物性状
| 序号 | 药材批号 | 对应饮片批号 | 对照提取物批号 | 性状 |
| 1 | XLS201808463 | OJ181101 | OJBT181101 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 2 | XLS201808464 | OJ181102 | OJBT181102 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 3 | XLS201808465 | OJ181103 | OJBT181103 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 4 | XLS201808466 | OJ181104 | OJBT181104 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 5 | XLS201808467 | OJ181105 | OJBT181105 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 6 | XLS201808468 | OJ181106 | OJBT181106 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 7 | XLS201808469 | OJ181107 | OJBT181107 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 8 | 010348-1811001 | OJ181108 | OJBT181108 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 9 | XLS201808780 | OJ181109 | OJBT181109 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 10 | XLS201808781 | OJ181110 | OJBT181110 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 11 | XLS201808782 | OJ181111 | OJBT181111 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 12 | XLS201808783 | OJ181112 | OJBT181112 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 13 | XLS201808784 | OJ181113 | OJBT181113 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 14 | XLS201808785 | OJ181114 | OJBT181114 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 15 | XLS201808786 | OJ181115 | OJBT181115 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 16 | XLS201808787 | OJ181116 | OJBT181116 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 17 | XLS201808788 | OJ181117 | OJBT181117 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
| 18 | XLS201808789 | OJ181118 | OJBT181118 | 棕褐色粉末，气微，味微甘 |
3.收粉率
对18批藕节对照提取物进行测定，所得各批次对照提取物收粉率结果见下表7和图3。
表7 18批藕节对照提取物制备数据汇总
| 批次 | 饮片批号 | 饮片投料量(g) | 对照提取物批号 | 对照提取物收粉量(g) | 收粉率(％) |
| 1 | OJ181101 | 101.60 | OJBT181101 | 7.17 | 7.1 |
| 2 | OJ181102 | 99.26 | OJBT181102 | 7.56 | 7.6 |
| 3 | OJ181103 | 100.36 | OJBT181103 | 7.82 | 7.8 |
| 4 | OJ181104 | 100.83 | OJBT181104 | 7.72 | 7.7 |
| 5 | OJ181105 | 100.45 | OJBT181105 | 9.37 | 9.3 |
| 6 | OJ181106 | 101.10 | OJBT181106 | 8.13 | 8.0 |
| 7 | OJ181107 | 99.36 | OJBT181107 | 7.53 | 7.6 |
| 8 | OJ181108 | 100.57 | OJBT181108 | 7.37 | 7.3 |
| 9 | OJ181109 | 101.08 | OJBT181109 | 7.73 | 7.6 |
| 10 | OJ181110 | 101.00 | OJBT181110 | 7.34 | 7.3 |
| 11 | OJ181111 | 101.04 | OJBT181111 | 6.38 | 6.3 |
| 12 | OJ181112 | 99.57 | OJBT181112 | 6.77 | 6.8 |
| 13 | OJ181113 | 101.52 | OJBT181113 | 7.57 | 7.5 |
| 14 | OJ181114 | 99.23 | OJBT181114 | 7.21 | 7.3 |
| 15 | OJ181115 | 100.37 | OJBT181115 | 6.48 | 6.5 |
| 16 | OJ181116 | 101.94 | OJBT181116 | 6.63 | 6.5 |
| 17 | OJ181117 | 99.72 | OJBT181117 | 6.76 | 6.8 |
| 18 | OJ181118 | 99.97 | OJBT181118 | 5.99 | 6.0 |
结果表明，18批藕节对照提取物收粉率范围为6.0～9.3％，平均值为7.3％，SD为0.8。平均值的70～130％的范围为5.1～9.5％，平均值加减3倍SD范围为4.9～9.7％。
根据以上数据，确定藕节对照提取物收率范围为5.0～10.0％
4.水分
按照《中国药典》2015年版四部通则0832第二法进行测定，18批藕节对照提取物水分测定结果，见下表8和图4。
表8 18批藕节对照提取物水分测定结果
结果表明，18批藕节对照提取物水分在6.4～10.0％范围之内，平均值为8.2％，平均值的70～130％的范围为5.7～10.7％。
根据以上结果，确定藕节对照提取物水分应为不大于11.0％。
实施例3：
本实施例是对藕节对照提取物的质量控制方法，当然，该质量控制方法也可适用于藕节配方颗粒或其单方中药制剂的质量控制。
1.实验仪器与材料
高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters e2695型高效液相色谱仪、岛津20AD型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron、Diamonsil 5μm C18(2)250×4.6mm、XBridge C18 5μm 4.6×250mm、Kromasil 100-5-C184.6×250mm。
2.试剂及试药
甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
藕节对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121580-201302)；
藕节对照提取物(批号：OJBT181101、OJBT181102、OJBT181103、OJBT181104、OJBT181105、OJBT181106、OJBT181107、OJBT181108、OJBT181109、OJBT181110、OJBT181111、OJBT181112、OJBT181113、OJBT181114、OJBT181115、OJBT181116、OJBT181117、OJBT181118)。
3.特征图谱
参照物溶液的制备：取藕节对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
供试品溶液的制备：取藕节对照提取物(批号OJBT181105)约0.5g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定：精密吸取参照物溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表9中的规定进行梯度洗脱，在流速为每分钟1.0ml，柱温为35℃，检测波长为275nm下进行测定。
表9梯度脱洗
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～60 | 5→90 | 95→10 |
以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建藕节对照提取物的特征图谱，见图5。
4.0色谱条件与系统适用性试验
4.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液3D图以及在250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm波长下的色谱图。结果见图6和图7。
结果表明，在检测波长为275nm波长下各色谱峰峰形和对称性更好，整个色谱图信息量较大，故检测波长确定为275nm。
4.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃时进行考察。结果见图8。
结果表明，在柱温为35℃时，各色谱峰能较好分离，确定柱温为35℃进行后续考察。
4.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。结果见图9。
结果表明，在三种流速条件下，各色谱峰都能较好分离，确定流速为1.0ml/min进行后续考察。
4.4延迟性实验
在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至110min。结果见图10。
结果表明，在色谱图采集到60分钟时，已将色谱峰采集完全。故将色谱图采集时间确定为60分钟。
综上所述，藕节对照提取物特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱(见表9)；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为275nm。
5.供试品溶液的制备考察
5.1提取方法考察
取藕节对照提取物(批号OJBT181105)约0.5g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，密塞，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图11。
结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果无显著差异。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
5.2提取溶剂考察
取藕节对照提取物(批号OJBT181105)约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇、70％甲醇、水时进行考察，溶剂加入量为25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图12。
结果表明，当提取溶剂为70％甲醇时，色谱峰信息量较大。故选择提取溶剂为70％甲醇。
5.3提取时间考察
取藕节对照提取物(批号OJBT181105)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图13。
结果表明，在提取时间为20分钟，即可充分提取。故供试品提取时间确定为20分钟。
综上所述，藕节对照提取物特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取藕节对照提取物约0.5g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.方法学考察
6.1专属性考察
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备藕节对照提取物供试品溶液。
对照药材溶液的制备：取藕节对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺藕节对照提取物的阴性对照溶液。
结果见图14、15。结果表明，对照提取物中的9个特征峰在藕节对照药材图谱中能够一一对应。在以下方法学考察中，将峰4设为S峰，对样品中的9个峰进行考察。
6.2仪器精密度试验
精密称取藕节对照提取物(批号：OJBT181105)1份，按拟定实验方法进行制备，连续进样6次，每次10μl。结果见下表10和表11。
表10精密度考察-特征峰保留时间
表11精密度考察-特征峰峰面积
结果表明，仪器精密度考察中，各特征峰保留时间的RSD在0.04～0.10％，各特征峰峰面积的RSD在0.07～0.76％。该仪器精密度良好。
6.3重复性考察
精密称取藕节对照提取物(批号：OJBT181105)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。结果见表12和表13。
表12重复性考察—特征峰相对保留时间比值
图13重复性考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD为0.00～0.08％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.26～1.31％。该方法重复性良好。
6.4中间精密度考察
6.4.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取藕节对照提取物(批号：OJBT181107)一份，制备供试品溶液，分别在安捷伦1260、Waters e2695、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm5-Micron)。结果见图16。
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，对照提取物中的9个特征峰在藕节对照药材图谱中均能够一一对应。
6.4.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取藕节对照提取物(批号：OJBT181105)各两份，制备供试品，进行测定。结果见表14和表15。
表14不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间比值
表15不同人员与时间考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.00～0.10％；各特征峰相对峰面积的RSD在0.34～1.31％。
6.5耐用性考察
6.5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical 4.6×250mm 5-Micron、Diamonsil 5μm C18(2)250×4.6mm、XBridge C18 5μm4.6×250mm、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm时进行考察。结果见图17。
结果表明，用上述4种色谱柱对样品进行检测时，对照提取物中的特征峰在藕节对照药材图谱中均能够一一对应，但峰1、峰2、峰3分离度较差，且峰2和峰3由于样品批次间差异，对照药材峰面积过小。
6.5.2稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，3h，6h，12h，18h，24h时测定。结果见表16和表17。
表16稳定性考察-特征峰保留时间
表17稳定性考察-特征峰峰面积
结果表明，各特征峰保留时间的RSD在0.05～0.12％，各特征峰峰面积的RSD在0.15～1.14％。该方法供试品在24小时内稳定性良好。
综上所述，峰2、峰3在对照药材色谱中峰面积过小，且色谱柱考察时峰1、峰2、峰3分离度较差，将分析色谱柱推荐为ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron，将上述除峰2、峰3以外的7个特征峰纳入后续考察。
6.6特征峰的确定及对照图谱的建立
采用拟定的方法对藕节对照提取物18批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。结果见图18，图19以及下表18和表19。(图18中，由下至上依次为：OJBT181101、OJBT181102、OJBT181103、OJBT181104、OJBT181105、OJBT181106、OJBT181107、OJBT181108、OJBT181109；图19中，由下至上依次为：OJBT181110、OJBT181111、OJBT181112、OJBT181113、OJBT181114、OJBT181115、OJBT181116、OJBT181117、OJBT181118)
表18 18批藕节对照提取物相对保留时间
表19 18批藕节对照提取物相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，18批次藕节对照提取物特征峰相对峰面积的RSD差异较大，因此不列入质量标准正文，18批次藕节对照提取物7个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。但因为7个特征峰暂没有指认，检测时无法确定S峰位置。最终规定：供试品特征图谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对18批次藕节对照提取物特征图谱进行合成，建立藕节对照提取物特征图谱的对照特征图谱(参见图5)。
实施例4：
本实施例是在实施例3的基础上，对藕节对照提取物的质量控制方法，当然，该质量控制方法也可适用于藕节配方颗粒或其单方中药制剂的质量控制。
1.试验仪器与材料
1.1仪器
紫外分光光度计：岛津UV-2450型；
电子天平：ME204E/02、MS205DΜ、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ5200DB型(200W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)。
1.2材料
没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201605，纯度90.8％)；
无水碳酸钠(四川奥瑞特化学试剂有限公司，纯度≥99.8)；
磷钼钨酸试液(北京华科盛精细化工产品贸易有限公司)；
水为超纯水。
藕节对照提取物(批号：OJBT181101、OJBT181102、OJBT181103、OJBT181104、OJBT181105、OJBT181106、OJBT181107、OJBT181108、OJBT181109、OJBT181110、OJBT181111、OJBT181112、OJBT181113、OJBT181114、OJBT181115、OJBT181116、OJBT181117、OJBT181118)。
2.含量测定
没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含50μg的溶液，即得。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液的制备：取藕节对照提取物约0.2g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水80ml，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，即得。
含量测定：精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(μg)，计算，即得。藕节对照提取物按干燥品计算，含总多酚以没食子酸(C7H6O5)计范围应为1.5～3.5％。
整个实验过程应避光操作。
3.供试品溶液制备方法考察
3.1取样量考察
取藕节对照提取物(批号：OJBT181108)6份，2份0.1g，2份0.2g，2份0.3g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水80ml，超声处理30分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，即得。测量紫外吸光度并计算不同取样量总多酚的含量，结果见下表20。
表20不同提取方式分析结果
结果表明，不同取样量所得总多酚含量无显著差异，为使吸光度读数在0.3-0.7之间，保证计算的准确性，选择取样量0.2g。
3.2提取时间考察
取藕节对照提取物(批号：OJBT181108)6份约0.2g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水80ml，分别超声提取10min、30min、60min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，即得。测量紫外吸光度并计算不同提取时间总多酚的含量，结果见下表21。
表21不同提取时间的分析结果
结果表明，在提取时间为10min，即可充分提取。为保证成分的完全溶出，选择提取时间为30分钟。
供试品溶液制备方法确定：
取藕节对照提取物约0.2g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水80ml，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，即得。
4.方法学考察
4.1专属性实验
对照品溶液制备：取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取藕节对照提取物约0.2g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水80ml，超声处理30分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，即得。
阴性溶液的制备：参考标准曲线的制备中空白试剂的制备方法制备缺本品的阴性溶液。结果见图20。
结果表明，阴性溶液在200-800nm波长下对吸光度测定无干扰，供试品溶液在760nm波长时有较高且稳定的吸光度，表明该方法专属性好。
4.2仪器精密度考察
取对照品溶液连续测定6次，记录没食子酸的吸光度，计算RSD值，结果见下表22。
表22精密度考察结果
结果表明，仪器精密度考察中没食子酸的吸光度RSD值为0.08％，该仪器精密度良好。
4.3线性关系
精密称取没食子酸对照品6.814mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含没食子酸61.871μg)。精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml、6ml、5ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标Y，浓度为横坐标X，绘制标准曲线。结果见下表23和图21。
表23总多酚标准曲线分析结果
| 编号 | 浓度μg/mL | 吸光度 |
| 1 | 1.237 | 0.175 |
| 2 | 2.475 | 0.346 |
| 3 | 4.950 | 0.620 |
| 4 | 7.425 | 0.847 |
| 5 | 9.899 | 1.128 |
| 6 | 12.374 | 1.354 |
结果表明：没食子酸浓度范围在1.237～12.374μg/ml，线性关系为Y＝0.1049X+0.0742，R2＝0.9978。表明进样浓度在1.237～12.374μg/ml时，呈良好的线性关系。
4.4稳定性实验
取同一供试品溶液(批号：OJBT181108)，分别在20，30，40，60，90，120min测定供试品溶液的吸光度，结果见下表24。
表24稳定性实验结果
| 序号 | 分析时间(min) | 吸光度 |
| 1 | 20 | 0.499 |
| 2 | 30 | 0.498 |
| 3 | 40 | 0.493 |
| 4 | 60 | 0.486 |
| 5 | 90 | 0.472 |
| 6 | 120 | 0.490 |
结果表明，在本实验条件下，吸光度RSD值为2.03％，供试品溶液在120min内稳定性良好。
4.5重复性
取同一供试品(批号：OJBT181108)0.2g，精密称定6份，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的含量，结果见下表25。
表25重复性实验结果
结果表明，总多酚含量的RSD值为0.91％，表明本方法重复性良好。
4.6中间精密度
取同一供试品(批号：OJBT181108)由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)制备供试品溶液进行分析，计算供试品中总多酚的含量，结果见下表26。
表26中间精密度实验结果—不同人员、不同时间
结果表明，总多酚的含量由不同人员、不同时间测定的RSD值为1.12％表明本方法中间精密度良好。
4.7准确度
取已知含量的供试品(批号：OJBT181108，没食子酸的含量2.78％)约0.1g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的没食子酸对照品(纯度：90.8％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见下表27。计算公式如下：
表27加样回收实验结果
结果表明，总多酚加样回收率在95.02％～102.00％，回收率结果的RSD值为2.95％，本方法准确度良好。
4.8样品含量测定验证
以18批藕节对照提取物为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录吸光度，计算总多酚的含量，结果见下表28和图22。
表28 18批藕节对照提取物含量测定结果
结果表明，18批藕节对照提取物总多酚以没食子酸(C7H6O5)计含量实测范围为1.7～3.4％，平均含量为2.6％，SD为0.5％。平均值的70～130％限量范围为1.8～3.4％，含量测定均值加减3倍SD的限量范围为1.1～4.1％。
根据以上结果，确定藕节对照提取物含量限度为：本品按干燥品计，含总多酚以没食子酸(C7H6O5)计范围应为1.5～3.5％。
实施例5：
本实施例提出了藕节炭对照提取物的制备工艺。
取藕节炭饮片100g，加水煎煮两次，一煎加9倍水(液面没过饮片高度应为2～5cm)，浸泡30分钟，先用武火煮沸后，改用文火慢煎30分钟，采用200目筛网趁热过滤，滤液在冷水环境下快速冷却至室温；二煎加7倍水(液面没过饮片高度应为2～5cm)，先用武火煮沸后，改用文火慢煎20分钟，采用200目筛网过滤，合并水煎液，滤液在冷水环境下快速冷却至室温，按下表29中的冻干工艺进行真空冷冻干燥后，在温度10～26℃、相对湿度40～60％环境下，按煎煮批次，快速收粉(收粉率范围应为12.0～24.0％)、称量、分装于棕色西林瓶，并封口、贴标签，制得藕节炭对照提取物。
表29冻干工艺
以下是对藕节炭对照提取物制备工艺的研究。
1.仪器与设备
电子天平：上海方瑞仪器有限公司JY系列百分之一天平；
煎药壶：美味世家全自动分体式陶瓷煎药壶4升；
筛网：九峰筛网200目；
真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司LGJ-100F；
西林瓶压盖机：SZ20A；2000ml不锈钢量杯若干；西林瓶：10ml，30ml，50ml若干。
2.前处理工艺研究
参考《中国药典》2015年版一部藕节【炮制】项下藕节炭相关规定及第四部通则0213炮制通则相关规定进行炮制，具体方法为：取净藕节，照炒炭法炒至表面黑褐色或焦黑色，内部黄褐色或棕褐色。
具体炮制方法考察如下：
分别取净藕节100g(批号：010348-1811001)，分别于350℃分别炒制25、30、35min，于300℃、350℃、400℃炒制25min，测定其中总多酚含量，计算炮制转移率与炮制收率。结果见下表30。
表30藕节炭炮制方法考察
| 试验编号 | 炒炭温度(℃) | 炒炭时间(min) | 炮制转移率(％) | 炮制收率(％) |
| 1 | 300 | 25 | 79.9 | 78.4 |
| 2 | 350 | 25 | 75.3 | 76.8 |
| 3 | 400 | 25 | 76.3 | 71.1 |
| 4 | 350 | 30 | 71.3 | 76.8 |
| 5 | 350 | 35 | 63.0 | 75.3 |
结果表明，在炒炭时间都为25min时，300～400℃范围内，温度越高，炮制收率越低，但炮制转移率差异不大；在炒碳温度都为350℃时，25～35min范围内，时间越久，炮制收率越低，炮制转移率也越低。说明炒制过程中，物料炭化不能过度，在性状满足《中国药典》2015年版中对炮制品“表面黑褐色或焦黑色，内部黄褐色或棕褐色”的描述时及时出锅为宜。因此，最终确定藕节炭的炮制工艺为：取净藕节，置热锅内，于350℃炒约25min，至表面黑褐色或焦黑色，内部黄褐色或棕褐色时，微喷水，灭尽火星，取出晾干。
3.制备工艺研究
3.1提取溶媒
依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，确定藕节炭对照提取物的制备提取溶媒为水。
3.2取样量
用于制备藕节炭对照提取物的饮片取样量定为100g。
3.3浸泡
依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，待煎饮片应当先行浸泡，浸泡时间应根据饮片的质地确定，一般不少于30min。确定浸泡时间为30min。
3.4煎煮次数
依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，煎煮次数定为2次。
3.5加水量
取同一批号藕节炭饮片50g(批号：OJT181208)，两份，分别加入10倍量的水(500g)，分别在浸泡10min、20min、30min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、24h测定，计算吸水率，结果见下表31，吸水率曲线见图23。
表31藕节炭吸水率变化
| 测定时间 | 实验1吸水率(％) | 实验2吸水率(％) | 平均值(％) |
| 0 | 0 | 0 | 0 |
| 10min | 18.2 | 23.4 | 20.8 |
| 20min | 20.0 | 27.7 | 23.9 |
| 30min | 22.2 | 31.7 | 27.0 |
| 1h | 25.3 | 34.5 | 29.9 |
| 1.5h | 36.6 | 42.8 | 39.7 |
| 2h | 45.8 | 53.0 | 49.4 |
| 4h | 50.5 | 58.1 | 54.3 |
| 6h | 71.2 | 69.5 | 70.4 |
| 8h | 76.4 | 79.6 | 78.0 |
| 24h | 99.1 | 99.9 | 99.5 |
由藕节炭的吸水率曲线可知其在前30min急剧吸水，30min时的平均吸水率为27.0％，30min后增长率逐渐减小，24h时的平均吸水率为99.5％。
取藕节炭饮片100g(批号：OJT181208)于煎药壶，分别加入5倍7倍水、9倍水、11倍水、13倍水，观察水面没过饮片的高度，结果见下表32。
表32不同加水量液面高度
| 加水量 | 药/液面高度(cm) | 浸过药面高度(cm) |
| 未加水 | 0.5 | 0 |
| 8倍 | 2.6 | 2.1 |
| 10倍 | 2.9 | 2.4 |
| 12倍 | 3.5 | 3.0 |
| 14倍 | 4.0 | 3.5 |
结果可知当加水量为8-14倍时，浸过药面高度均在2-5cm范围，参考其吸水率，同时保证不同批次饮片均能在2-5cm范围，确定一煎加水倍数为9倍，二煎加水量为7倍。
3.6煎煮时间
藕节炭属于止血类药，按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中对照提取物制备的规定：煎煮时间应当根据方剂的功能主治和药物的功效确定。一般药物煮沸后再煎煮20～30分钟；解表类、清热类、芳香类药物不宜久煎，煮沸后再煎煮15～20分钟；滋补药物先用武火煮沸后，改用文火慢煎约40～60分钟。药剂第二煎的煎煮时间应当比第一煎的时间略缩短。确定藕节炭对照提取物第一煎先用武火煮沸后，改用文火慢煎30min，第二煎先用武火煮沸后，改用文火慢煎20min。
3.7固液分离
根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》，并结合大生产，采用200目筛网趁热过滤。
3.8真空冷冻干燥
根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》、《医疗机构中药煎药室管理规范》中要求，对对照提取物干燥过程推荐采用真空冷冻干燥方法制备为宜，可保证其质量的稳定、易于保存。真空冷冻干燥工艺参数见下表33及图24。
表33冻干工艺
实施例2：
本实施例涉及18批次藕节炭对照提取物的制备。按照实施例1所述制备工艺，取18批次藕节药材制备藕节炭对照提取物。
1.来源
收集18批来自四川双流、湖北十堰、河南西乡等产区的藕节药材，按《中国药典》2015版藕节项下规定进行炮制，制得18批次藕节炭饮片。
以上18批藕节药材、18批藕节炭饮片均符合《中国药典》2015版的要求，见下表34、表35。
表34药材检验结果
表35饮片检验结果
2.性状
用18批藕节炭饮片进行对照提取物的制备，每批藕节炭饮片制1批对照提取物，共制得18批冻干粉，各对照提取物批号所对应饮片及药材批号及各批对照提取物性状见下表36。
表36 18批次藕节炭对照提取物性状
| 序号 | 药材批号 | 对应饮片批号 | 对照提取物批号 | 性状 |
| 1 | XLS201808463 | OJT181201 | OJTBT181201 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 2 | XLS201808464 | OJT181202 | OJTBT181202 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 3 | XLS201808465 | OJT181203 | OJTBT181203 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 4 | XLS201808466 | OJT181204 | OJTBT181204 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 5 | XLS201808467 | OJT181205 | OJTBT181205 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 6 | XLS201808468 | OJT181206 | OJTBT181206 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 7 | XLS201808469 | OJT181207 | OJTBT181207 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 8 | 010348-1812001 | OJT181208 | OJTBT181208 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 9 | XLS201808780 | OJT181209 | OJTBT181209 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 10 | XLS201808781 | OJT181210 | OJTBT181210 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 11 | XLS201808782 | OJT181211 | OJTBT181211 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 12 | XLS201808783 | OJT181212 | OJTBT181212 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 13 | XLS201808784 | OJT181213 | OJTBT181213 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 14 | XLS201808785 | OJT181214 | OJTBT181214 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 15 | XLS201808786 | OJT181215 | OJTBT181215 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 16 | XLS201808787 | OJT181216 | OJTBT181216 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 17 | XLS201808788 | OJT181217 | OJTBT181217 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
| 18 | XLS201808789 | OJT181218 | OJTBT181218 | 棕色粉末，气微，味微甘、涩 |
3.收粉率
对18批藕节炭对照提取物进行测定，所得各批次对照提取物收粉率结果见下表37和图25。
表37 18批藕节炭对照提取物制备数据汇总
| 批次 | 饮片批号 | 饮片投料量(g) | 对照提取物批号 | 对照提取物收粉量(g) | 出膏率(％) |
| 1 | OJT181201 | 100.00 | OJTBT181201 | 16.23 | 16.2 |
| 2 | OJT181202 | 100.53 | OJTBT181202 | 16.50 | 16.4 |
| 3 | OJT181203 | 100.19 | OJTBT181203 | 16.85 | 16.8 |
| 4 | OJT181204 | 101.61 | OJTBT181204 | 16.35 | 16.1 |
| 5 | OJT181205 | 101.72 | OJTBT181205 | 16.04 | 15.8 |
| 6 | OJT181206 | 101.42 | OJTBT181206 | 17.74 | 17.5 |
| 7 | OJT181207 | 100.22 | OJTBT181207 | 16.65 | 16.6 |
| 8 | OJT181208 | 101.65 | OJTBT181208 | 17.43 | 17.1 |
| 9 | OJT181209 | 100.77 | OJTBT181209 | 15.47 | 15.4 |
| 10 | OJT181210 | 101.63 | OJTBT181210 | 16.71 | 16.4 |
| 11 | OJT181211 | 101.38 | OJTBT181211 | 14.52 | 14.3 |
| 12 | OJT181212 | 100.20 | OJTBT181212 | 18.42 | 18.4 |
| 13 | OJT181213 | 100.73 | OJTBT181213 | 16.27 | 16.2 |
| 14 | OJT181214 | 101.03 | OJTBT181214 | 22.02 | 21.8 |
| 15 | OJT181215 | 100.82 | OJTBT181215 | 20.69 | 20.5 |
| 16 | OJT181216 | 100.87 | OJTBT181216 | 19.46 | 19.3 |
| 17 | OJT181217 | 101.02 | OJTBT181217 | 21.94 | 21.7 |
| 18 | OJT181218 | 100.43 | OJTBT181218 | 15.94 | 15.9 |
结果表明，18批藕节炭对照提取物出膏率范围为14.3～21.8％，平均值为17.4％，SD为2.1。平均值的70％-130％的范围为12.2～22.6％，平均值加减3倍SD范围为11.1～23.7％。
根据以上数据，确定藕节炭对照提取物收率范围为12.0～24.0％。
4.水分
按照《中国药典》2015年版四部通则0832第二法进行测定，18批藕节炭对照提取物水分测定结果，见下表38和图26。
表38 18批藕节炭对照提取物水分测定结果
结果表明，18批藕节炭对照提取物水分在3.7～6.9％范围之内，平均值为5.3％。
结合以上数据，确定藕节炭对照提取物水分应不得大于8.0％。
实施例3：
本实施例是对藕节炭对照提取物的质量控制方法，当然，该质量控制方法也可适用于藕节炭配方颗粒或其单方中药制剂的质量控制。
1.实验仪器与材料
高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters e2695型高效液相色谱仪、岛津20AD型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron、Diamonsil 5μm C18(2)250×4.6mm、XBridge C18 5μm 4.6×250mm、Kromasil 100-5-C184.6×250mm。
2.试剂及试药
甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
5-羟甲基糠醛(中国食品药品检定研究院，批号：111626-201711，纯度99.4％)；
藕节炭对照药材(批号：OJT181208)；
藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201、OJTBT181202、OJTBT181203、OJTBT181204、OJTBT181205、OJTBT181206、OJTBT181207、OJTBT181208、OJTBT181209、OJTBT181210、OJTBT181211、OJTBT181212、OJTBT181213、OJTBT181214、OJTBT181215、OJTBT181216、OJTBT181217、OJTBT181218)。
3.特征图谱
参照物溶液的制备：取藕节炭药材1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取藕节炭对照提取物(批号OJTBT181201)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定：精密吸取参照物溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表39中的规定进行梯度洗脱，在流速为每分钟1.0ml，柱温为35℃，检测波长为275nm下进行测定。
表39梯度脱洗
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～60 | 5→90 | 95→10 |
以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建藕节炭对照提取物的特征图谱，见图27。
供试品特征图谱中应呈现4个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应，与5-羟甲基糠醛参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：1.362(峰2)、3.113(峰3)、4.303(峰4)。
4.0色谱条件与系统适用性试验
4.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液3D图以及在250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm波长下的色谱图。结果见图28和图29。
结果表明，在检测波长为275nm波长下各色谱峰峰形和对称性更好，整个色谱图信息量较大，故检测波长确定为275nm。
4.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃时进行考察。结果见图30。
结果表明，在柱温为35℃时，各色谱峰能较好分离，确定柱温为35℃进行后续考察。
4.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。结果见图31。
结果表明，在三种流速条件下，各色谱峰都能较好分离，确定流速为1.0ml/min进行后续考察。
4.4延迟性实验
在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至110min。结果见图32。
结果表明，在色谱图采集到60分钟时，已将色谱峰采集完全。故将色谱图采集时间确定为60分钟。
综上所述，藕节炭对照提取物特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱(见表10)；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为275nm。
5.供试品溶液的制备考察
5.1提取方法考察
取藕节炭对照提取物(批号OJTBT181201)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图33。
结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果无显著差异。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
5.2提取溶剂考察
取藕节炭对照提取物(批号OJTBT181201)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇、70％甲醇、水时进行考察，溶剂加入量为25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图34。
结果表明，当提取溶剂为70％甲醇时，色谱峰信息量较大。故选择提取溶剂为70％甲醇。
5.3提取时间考察
取藕节炭对照提取物(批号OJTBT181201)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图35。
结果表明，在提取时间为20分钟，即可充分提取。故供试品提取时间确定为20分钟。
综上所述，藕节炭对照提取物特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取藕节炭对照提取物约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.方法学考察
6.1专属性考察
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备藕节炭对照提取物供试品溶液。
藕节对照药材溶液的制备：取藕节对照药材1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
藕节炭对照药材溶液的制备：取藕节炭对照药材1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺藕节炭对照提取物的阴性对照溶液。
结果见图36。结果表明，藕节炭对照提取物色谱中的峰1为5-羟甲基糠醛，藕节炭对照提取物色谱中的4个特征峰在藕节炭对照药材色谱中能够一一对应，藕节炭对照提取物中的峰3、峰4能与藕节对照药材色谱对应。在以下方法学考察中，将峰1设为S峰，对样品中的4个峰进行考察。
6.2仪器精密度试验
精密称取藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201)1份，按拟定实验方法进行制备，连续进样6次，每次10μl。结果见下表40和表41。
表40精密度考察-特征峰保留时间
表41精密度考察-特征峰峰面积
结果表明，仪器精密度考察中，各特征峰保留时间的RSD在0.02～0.009％，各特征峰峰面积的RSD在0.15～0.16％。该仪器精密度良好。
6.3重复性考察
精密称取藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。结果见表42和表43。
表42重复性考察—特征峰相对保留时间比值
图43重复性考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD为0.00～0.04％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.20～0.58％。该方法重复性良好。
6.4中间精密度考察
6.4.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201)一份，制备供试品溶液，分别在安捷伦1260、Waters e2695、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm5-Micron)。结果见下表44、表45及图37。
表44仪器考察—特征峰相对保留时间比值
表45仪器考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD为0.54～3.40％，各特征峰相对峰面积的RSD在1.83～4.43％。
6.4.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201)各两份，制备供试品，进行测定。结果见表46和表47。
表46不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间比值
表47不同人员与时间考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.03～0.06％；各特征峰相对峰面积的RSD在0.27～0.64％。
6.5耐用性考察
6.5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical 4.6×250mm 5-Micron、Diamonsil 5μm C18(2)250×4.6mm、XBridge C18 5μm4.6×250mm、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm时进行考察。结果见下表48、表49及图38。
表48色谱柱考察—特征峰相对保留时间比值
表49色谱柱考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，用上述4种色谱柱对样品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD为0.66～6.05％，各特征峰相对峰面积的RSD在7.46～13.74％。
6.5.2稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，3h，6h，12h，18h，24h时测定。结果见表50和表51。
表50稳定性考察-特征峰保留时间
表51稳定性考察-特征峰峰面积
结果表明，各特征峰保留时间的RSD在0.03～006％，各特征峰峰面积的RSD在0.14～0.25％。该方法供试品在24小时内稳定性良好。
综上所述峰3、峰4在色谱柱耐用性考察中相对保留时间的RSD较高，将色谱柱定为ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron，同时，考虑到仪器耐用性，将各特征峰相对保留时间的范围规定为±10％。将上述4个特征峰纳入后续考察。
6.6特征峰的确定及对照图谱的建立
采用拟定的方法对藕节炭对照提取物18批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。结果见图39，图40以及下表52和表53。(图39中，由下至上依次为：OJTBT181201、OJTBT181202、OJTBT181203、OJTBT181204、OJTBT181205、OJTBT181206、OJTBT181207、OJTBT181208、OJTBT181209；图40中，由下至上依次为：OJTBT181210、OJTBT181211、OJTBT181212、OJTBT181213、OJTBT181214、OJTBT181215、OJTBT181216、OJTBT181217、OJTBT181218)
表52 18批藕节炭对照提取物相对保留时间
表53 18批藕节炭对照提取物相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了4个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，18批次藕节炭对照提取物特征峰相对峰面积的RSD差异较大，因此不列入质量标准正文，18批次藕节炭对照提取物4个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。最终规定：供试品色谱中应呈现4个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应，与5-羟甲基糠醛参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：1.362(峰2)、3.113(峰3)、4.303(峰4)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对18批次藕节炭对照提取物特征图谱进行合成，建立藕节炭对照提取物特征图谱的对照特征图谱(参见图27)。
实施例4：
本实施例是在实施例3的基础上，对藕节炭对照提取物的质量控制方法，当然，该质量控制方法也可适用于藕节炭配方颗粒或其单方中药制剂的质量控制。
1.试验仪器与材料
1.1仪器
紫外分光光度计：岛津UV-2450型；
电子天平：ME204E/02、MS205DΜ、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ5200DB型(200W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)。
1.2材料
没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201605，纯度90.8％)；
无水碳酸钠(四川奥瑞特化学试剂有限公司，纯度≥99.8)；
磷钼钨酸试液(北京华科盛精细化工产品贸易有限公司)；
水为超纯水。
藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201、OJTBT181202、OJTBT181203、OJTBT181204、OJTBT181205、OJTBT181206、OJTBT181207、OJTBT181208、OJTBT181209、OJTBT181210、OJTBT181211、OJTBT181212、OJTBT181213、OJTBT181214、OJTBT181215、OJTBT181216、OJTBT181217、OJTBT181218)。
2.含量测定
没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含50μg的溶液，即得。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液的制备：取藕节炭对照提取物约0.2g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水80ml，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，即得。
精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(μg)，计算，即得。藕节炭对照提取物按干燥品计算，含总多酚以没食子酸(C7H6O5)计范围应为2.0～4.0％。
3.供试品溶液制备方法考察
3.1取样量考察
取藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181208)6份，2份0.1g，2份0.2g，2份0.3g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水80ml，超声处理30分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，即得。测量紫外吸光度并计算不同取样量总多酚的含量，结果见下表54。
表54不同提取方式分析结果
结果表明，不同取样量所得总多酚含量无显著差异，为使吸光度读数在0.3-0.7之间，保证计算的准确性，选择取样量0.2g。
3.2提取时间考察
取藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181208)6份约0.2g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水80ml，分别超声提取10min、30min、60min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，即得。测量紫外吸光度并计算不同提取时间总多酚的含量，结果见下表55。
表55不同提取时间的分析结果
结果表明，在提取时间为10min，即可充分提取。为保证成分的完全溶出，选择提取时间为30分钟。
供试品溶液制备方法确定：
取藕节炭对照提取物约0.2g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水80ml，超声处理(功率200W，频率40kHz)30分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，即得。
4.方法学考察
4.1专属性实验
对照品溶液制备：取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取藕节炭对照提取物约0.2g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水80ml，超声处理30分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，即得。
阴性溶液的制备：参考标准曲线的制备中空白试剂的制备方法制备缺本品的阴性溶液。结果见图41。
结果表明，阴性溶液在200～800nm波长下对吸光度测定无干扰，供试品溶液在760nm波长时有较高且稳定的吸光度，表明该方法专属性好。
4.2精密度考察
取对照品溶液连续进样6次，记录没食子酸的吸光度，计算RSD值，结果见下表56。
表56精密度考察结果
结果表明，精密度考察中没食子酸的吸光度RSD值为0.08％，本方法的进样精密度良好。
4.3线性关系
精密称取没食子酸对照品5.986mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含没食子酸54.353μg)。精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml、6ml、5ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标Y，浓度为横坐标X，绘制标准曲线。结果见下表57和图42。
表57总多酚标准曲线分析结果
| 编号 | 浓度μg/ml | 吸光度 |
| 1 | 1.087 | 0.137 |
| 2 | 2.174 | 0.281 |
| 3 | 4.348 | 0.507 |
| 4 | 6.522 | 0.716 |
| 5 | 8.696 | 0.909 |
| 6 | 10.871 | 1.134 |
结果表明：没食子酸浓度范围在1.087～10.870μg/ml，线性关系为Y＝0.0998X+0.0534，R2＝0.9980。表明进样浓度在1.087～10.870μg/ml时，呈良好的线性关系。
4.4稳定性实验
取同一供试品溶液(批号：OJTBT181208)，分别在20，30，40，60，90，120min测定供试品溶液的吸光度，结果见下表58。
表58稳定性实验结果
| 序号 | 分析时间(min) | 吸光度 |
| 1 | 20 | 0.461 |
| 2 | 30 | 0.454 |
| 3 | 40 | 0.422 |
| 4 | 60 | 0.424 |
| 5 | 90 | 0.417 |
| 6 | 120 | 0.380 |
结果表明，在本实验条件下，显色时间在40～90min时吸光度RSD值为0.86％，供试品溶液在显色时间为40～90min内稳定性良好。基于稳定性考察结果，在后续考察中，待测溶液的显色时间调整为40min。
4.5重复性
取同一供试品(批号：OJTBT181208)0.2g，精密称定6份，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品的含量，结果见下表59。
表59重复性实验结果
结果表明，总多酚含量的RSD值为1.32％，表明本方法重复性良好。
4.6中间精密度
取同一供试品(批号：OJTBT181208)由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)制备供试品溶液进行分析，计算供试品中总多酚的含量，结果见下表60。
表60中间精密度实验结果—不同人员、不同时间
结果表明，总多酚的含量由不同人员、不同时间测定的RSD值为2.25％表明本方法中间精密度良好。
4.7准确度
取已知含量的供试品(批号：OJTBT181208，没食子酸的含量2.5％)约0.1g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的没食子酸对照品(纯度：90.8％)，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见下表61。计算公式如下：
表61加样回收实验结果
结果表明，总多酚加样回收率在95.44～99.83％，回收率结果的RSD值为1.66％，本方法准确度良好。
4.8样品含量测定验证
以18批藕节炭对照提取物为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录吸光度，计算总多酚的含量，结果见下表62和图43。
表34 18批藕节炭对照提取物含量测定结果
结果表明，18批藕节炭对照提取物总多酚以没食子酸(C7H6O5)计含量实测范围为2.1～3.7％，平均含量为2.9％，SD为0.5％。平均值的70～130％限量范围为2.0～3.8％，含量测定均值加减3倍SD的限量范围为1.4～4.4％。
根据以上结果，确定藕节炭对照提取物含量限度为：本品按干燥品计，含总多酚以没食子酸(C7H6O5)计范围应为2.0～4.0％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.藕节对照提取物制备工艺的质量控制方法，其特征在于：包括构建藕节对照提取物的特征图谱以及对藕节对照提取物中总多酚的含量进行测定，
特征图谱构建步骤如下：
A.分别制备藕节对照药材的参照物溶液和藕节对照提取物的供试品溶液，
参照物溶液的制备包括：取藕节对照药材，加70%甲醇10ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，
供试品溶液的制备包括：取藕节炮制而得的藕节饮片，加水煎煮两次，一煎加9倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮30分钟，过滤，冷却至室温；二煎加7倍水，煮沸，保持微沸煎煮20分钟，过滤，合并水煎液，冷却至室温，真空冷冻干燥，即得藕节对照提取物，取藕节对照提取物，加入70%甲醇25ml，称定重量，超声处理20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
B.分别取参照物溶液和供试品溶液，按高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，在流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为275nm下进行测定，得到对应的特征图谱，其中，梯度脱洗满足以下条件：0～60min，流动相A：5%→90%，流动相B：95%→10%；
C.以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建藕节对照提取物的特征图谱，所述共有峰包括7个特征峰，
总多酚含量的测定步骤如下：
A.分别制备没食子酸对照品溶液、标准曲线和藕节对照提取物的供试品溶液，
没食子酸对照品溶液的制备包括：取没食子酸对照品，加水制成每1ml含50μg的溶液，即得，
标准曲线的制备包括：分别取没食子酸对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，均加入1ml磷钼钨酸试液，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，
供试品溶液的制备包括：取所述藕节对照提取物，加水80ml，超声处理30分钟，放冷，用水稀释至100ml，摇匀，静置，滤过，即得；
B.精密量取供试品溶液2ml，照标准曲线的制备方法，测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量，计算得藕节对照提取物中总多酚的含量，所述总多酚的含量限度为1.5～3.5%。
2.藕节炭对照提取物制备工艺的质量控制方法，其特征在于：包括构建藕节炭对照提取物的特征图谱以及对藕节炭对照提取物中总多酚的含量进行测定，
特征图谱构建步骤如下：
A.分别制备参照物溶液和藕节炭对照提取物的供试品溶液，
参照物溶液的制备包括：取藕节炭药材，加入70%甲醇10ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，
供试品溶液的制备包括：取藕节炮制而得的藕节炭饮片，加水煎煮两次，一煎加9倍水，浸泡30分钟，煮沸，保持微沸煎煮30分钟，过滤，立即冷却至室温；二煎加7倍水，煮沸，保持微沸煎煮20分钟，过滤，合并水煎液，冷却至室温，真空冷冻干燥，即得藕节炭对照提取物，取藕节炭对照提取物，加入70%甲醇25ml，超声处理20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
B.分别取参照物溶液和供试品溶液，按高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，在流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为275nm下进行测定，得到对应的特征图谱，其中，梯度脱洗满足以下条件：0～60min，流动相A：5%→90%，流动相B：95%→10%；
C.以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建藕节炭对照提取物的特征图谱，所述共有峰包括4个特征峰，与5-羟甲基糠醛参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内，规定值为：峰2：1.362、峰3：3.113、峰4：4.303，
总多酚含量的测定步骤如下：
A.分别制备没食子酸对照品溶液、标准曲线和藕节炭对照提取物的供试品溶液，
没食子酸对照品溶液的制备包括：取没食子酸对照品，加水制成每1 ml含0.05mg的溶液，即得,
标准曲线的制备包括：分别取没食子酸对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，均加入磷钼钨酸试液1ml，再分別加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置40分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线,
供试品溶液的制备包括：取藕节炭对照提取物，加水80ml，超声处理30分钟，放冷，用水稀释至100ml，摇匀，静置，滤过，即得;
B. 精密量取供试品溶液2ml，照标准曲线的制备方法，测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量，计算，即得藕节炭对照提取物中总多酚的含量，所述总多酚的含量限度为2.0～4.0%。
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
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| Publication number | Publication date |
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