CN101824021A - 莲藕中儿茶素类小分子的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明莲藕中儿茶素类小分子的提取方法及其应用，本发明莲藕中儿茶素类小分子的提取方法，为通过水浸提、大孔树脂吸附、葡聚糖凝胶过滤，得到两种纯化产物没食子儿茶素和儿茶素。本发明提取的莲藕中没食子儿茶素和儿茶素不仅具有很强的体外、细胞内抗氧化活性，更具有高效清除活性氧自由基的活性以及抗HIV的活性，可提高机体免疫水平，预防与自由基相关的各种疾病。本发明具有抗氧化和抗HIV的特点，原材料资源丰富，成本低廉，提取方便，安全无毒，可用于药物或天然保健品开发。
Description
技术领域：
本发明涉及莲藕中儿茶素类小分子的提取方法和应用。
背景技术：
医学研究表明活性氧与很多衰老相关疾病都有联系，包括肿瘤、糖尿病、动脉硬化症、癌症、哮喘、心肌缺血再灌注、早老性痴呆症、关节炎、白内障、皮炎、视网膜损伤以及肝脏损伤等，同时活性氧还可以诱导细胞的凋亡。近几年研究表明氧化损伤与病毒引起的疾病如AIDS有着密切的关系。
人们日常食用的蔬菜中含有很多抗氧化物质。如：茄子、苔菜、尖椒、西红柿等对DPPH自由基的抑制率较高；香椿、芦蒿、莴笋叶、水芹、茼蒿、藕等具有较强的抗氧化活性，并且其抗氧化能力与其中总酚含量密切相关。
莲(Nulumbo nuciferra Gaertn)又名芙蓉、荷、水芝、玉环、六月春等，在我国各地均有种植，以其肥嫩根状茎供食用，是千百年来及其重要的水生蔬菜，也是人们喜爱的健康蔬菜之一。目前国内外对莲的抗氧化、抗病毒等药理作用的研究主要集中在莲子、荷叶、藕节等，而对人们日常食用最多的莲藕的抗氧化研究相对较少。传统的有机溶剂萃取莲藕中总酚的方法未能明确指出其抗氧化成分的结构，并且由于有机溶剂毒性的残留，为药物及保健食品的开发带来了困难。水-乙醇体系提取莲藕中儿茶素类小分子的工艺方法及提取物生物活性的研究尚未见报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种无毒的水-乙醇提取莲藕中儿茶素类小分子的方法及其在医药领域中的应用。提取到的活性成分经鉴定为儿茶素和没食子儿茶素，它们都具有天然的高效抗氧化、抗HIV-1逆转录酶的活性，可制成药品或保健食品用于疾病治疗以及提高机体免疫力。莲藕是极为常见的蔬菜，在我国种植广泛，资源丰富，提取方便，无毒安全，广为人们所接受。
本发明莲藕中儿茶素类小分子的提取方法，该小分子活性成分通过水浸提、大孔树脂吸附、葡聚糖凝胶过滤，得到两种纯化产物没食子儿茶素和儿茶素。
莲藕中儿茶素类小分子的提取方法，经过下述步骤：
(1)取新鲜莲藕，粉碎，去离子水4℃浸泡过夜，过滤除去残渣，5000rpm离心10min取上清旋转蒸发去多余的水分，-45℃冷冻干燥得到粗提物L；
(2)将粗提物L溶于去离子水中，上样于大孔吸附树脂，洗脱，先用去离子水洗去杂质L1，再用30％的乙醇洗脱得到有效成分样品L2，柱子用90％乙醇洗去杂质L3；
(3)得到的样品L2冷冻干燥后称、取上样于1.2×80cm的葡聚糖凝胶柱LH-20，洗脱，先用去离子水和乙醇依次洗去杂质L2a~L2d，再用乙醇洗脱，通过测量OD280得到三个洗脱峰，分别命名为L2e、L2f和L2g，收集第二个峰，为抗氧化活性总产物L2f；
(4)L2f冷冻干燥后用制备型HPLC的C18柱，以水和甲醇混合液洗脱，洗脱速度为3ml/min，洗去杂质L2f-1后，收集得到两个抗氧化活性纯品峰，命名为L2f-2，鉴定为没食子儿茶素，以及L2f-3，鉴定为儿茶素。
所述的步骤(1)中为冷水浸提。
所述的步骤(2)中使用1.5×35cm的弱极性大孔吸附树脂NKA柱，仅用水和30％乙醇即可从粗提物L中一步分离出活性总产物L2。
所述的步骤(3)中使用1.2×80cm的葡聚糖凝胶柱LH-20，仅用水和不同浓度乙醇即可对活性总产物进行用分离，用60％的乙醇有效纯化得到儿茶素类有效成分L2f。
所述的步骤(4)中，仅用水和甲醇即可在C18反向柱上用HPLC法纯化出单一活性成分，甲醇与水的体积比例为3∶7。
所述的提取物L2f-2和L2f-3，可应用于体内外抗氧化以及抗病毒药物或保健品。本发明提取方法的具体步骤：
1、取新鲜莲藕，粉碎，去离子水4℃浸泡过夜，过滤除去残渣。5000rpm离心10min取上清旋转蒸发去多余的水分，-45℃冷冻干燥得到粗提物L；
2、粗提物L，溶于去离子水中，上样于1.5×35cm的弱极性大孔吸附树脂NKA柱，洗脱，先用去离子水洗去杂质L1，再用乙醇洗脱得到样品L2，柱子再用90％乙醇洗去杂质L3(附图1)，再用去离子水冲洗再生，可连续使用；
3、得到的样品L2冷冻干燥后上样于1.2×80cm的葡聚糖凝胶柱LH-20，洗脱速度为3ml/15min，先用去离子水和30％乙醇依次洗去杂质L2a~L2d，再用60％乙醇洗脱得到L2e、L2f和L2g，收集抗氧化活性总产物L2f(附图2)；柱子用依次用50％丙酮和去离子水再生可连续使用；
4、L2f冷冻干燥后用制备型HPLC的C18柱，以水∶甲醇＝7∶3的比例洗脱，洗去杂质L2f-1后，收集得到两个抗氧化活性纯品峰，L2f-2和L2f-3(附图3)，经鉴定为没食子儿茶素和儿茶素。
本发明提取的莲藕中没食子儿茶素和儿茶素不仅具有很强的体外、细胞内抗氧化活性，更具有高效清除活性氧自由基的活性以及抗HIV的活性，可提高机体免疫水平，预防与自由基相关的各种疾病。本发明具有抗氧化和抗HIV的特点，原材料资源丰富，成本低廉，提取方便，安全无毒，可用于药物或天然保健品开发。
附图说明：
图1：莲藕粗提物上样于大孔树脂NKA洗脱图
图2：L2上样于Sephadex LH-20的洗脱图
图3：组分L2f在HPLC C18柱上的洗脱曲线
图4：L2f-2的高分辨率ESI负离子质谱图
图5：L2f-3与儿茶素标准品LC-MS对比
图6：L2f-2和L2f-3对HIV-1RT活性的影响
具体实施方式：
实施例1：
1.莲藕中小分子活性物质提取与纯化
(1)取新鲜莲藕10kg，粉碎，10L去离子水4℃浸泡过夜，过滤除去残渣。5000rpm离心10min取上清旋转蒸发去多余的水分，-45℃冷冻干燥得到粗提物L；
(2)称取1g粗提物L，溶于去离子水中，上样于1.5×35cm的弱极性大孔吸附树脂NKA柱，购于天津南开和成科技有限公司，洗脱速度为1ml/min，先用200ml去离子水洗去杂质L1，再用30％的乙醇洗脱得到样品L2，柱子用90％乙醇洗去杂质L3，再用去离子水冲洗再生可连续使用；
(3)得到的样品L2冷冻干燥后称取100mg上样于1.2×80cm的葡聚糖凝胶柱LH-20，洗脱速度为3ml/15min，先用200ml去离子水和200ml 30％乙醇依次洗去杂质L2a~L2d，再用200ml 60％乙醇洗脱得到L2e、L2f和L2g，收集抗氧化活性总产物L2f；柱子用依次用50％丙酮和去离子水再生可连续使用；
(4)L2f冷冻干燥后用制备型HPLC的C18柱，以水∶甲醇＝7∶3的比例洗脱，洗脱速度为3ml/min，洗去杂质L2f-1后，收集得到两个抗氧化活性纯品峰，命名为L2f-2和L2f-3。
2.莲藕中小分子活性物质成分的鉴定
(1)高分辨率ESI负离子质谱
高分辨率ESI负离子质谱确定L2f-2的分子量为306.607，分子式为C15H14O7(附图4)。
(2)核磁共振氢谱
NMR测定是在Mercury-300BB型NMR仪上进行，以D2O及氘代DMSO为溶剂。取1mg样品，溶于0.25-0.30mL的D2O中，过滤后，将此样品溶液移至直径为5mm的样品管中。置于Mercury-300BB型NMR仪样品窗口，调节分辨率旋钮，使磁场的均匀性达到最佳状态，进行光谱测定。L2f-2的核磁共振氢谱见附图5(溶剂：DMSO-d6)。
(3)液质联用
对有活性的未知成分进行质谱分析，使用仪器为：ThermoFinnigan LCQ Advantage LC-MS，采用ESI离子源，操作条件为：Mode+C/-C；Mass range：50-1000(m/z)；Ispray Votage：4.0Kv；Solvent：methanol/water。L2f-3与标准品儿茶素的对照液质联用图见附图6。
(4)红外光谱
采用溴化钾压片法：取2mg样品置于玛瑙研钵中研细。再向研钵中加入200mg KBr粉末充分研磨均匀。把上述均匀混合物置于模具中，在真空下加压成直径为5mm或13mm的半透明片子。把此片置于Magna-560型付里叶变换红外光谱仪的样品窗口，在参比窗口放上空白KBr片，进行测谱。L2f-3与标准品儿茶素的对照红外光谱图。
实施例2：
莲藕中小分子儿茶素类成分抗氧化活性
1.细胞水平抗氧化活性测定
正常昆明种雄性小鼠摘眼球取血，收集于冰浴的0.15M NaCl的离心管中，于2500rpm离心10min，将红细胞与血浆和破碎细胞膜分离。并用10倍体积pH7.4的PBS溶液(10mM pH7.4Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，125mM NaCl)洗涤2次，最后得到完整的红细胞(Miki M，Tamai H，MinoM，et al.Free-radical chain oxidation of rat red blood cells by molecular oxygen andits inhibition by α-tocopherol.Arch Int Physiol Biochim Biophys 1987，258：373～380.)。此分析体系采用过氧自由基造成红细胞溶血(Sugiyama H，Fung K P.and Wu T W.Purpruogallinas an antioxidant protector of human erythrocytes against lysis by peroxyl radicals.J.Life Sci.，1993，53：39～43.)，以pH7.4的PBS制备20％的红细胞悬液，加入到等体积的200mM AAPH中(溶于PBS)，其中含有待测样品。反应混合物置于37℃温浴振荡1h。温浴结束后将此体系以8倍体积的PBS稀释，2500rpm离心10min，于540nm测定上清液的吸光值A。同时，将此体系以8倍体积的蒸馏水稀释，以达到红细胞完全溶血，并于540nm测定上清的吸光值B。L-抗坏血酸作为正对照。样品抑制溶血百分率按下式计算：
抑制率(％)＝(1-A/B)×100％
2.组织水平抗氧化活性测定(Ng T B，Liu F，Wang Z T.Antioxidative activity of naturalproducts from plants[J].Life Sci，2000，60：709.)
取正常昆明种雄性小鼠的脑，剪成小块后，用Polytron电动匀浆器，在冰冻Tris-HCL缓冲液(20mmol·L-1，pH7.4)中，得到1/10匀浆。所得匀浆以14000r·min-1离心15min，将匀浆中的上清均分成1ml加到含有待测样品、10μmol·L-1FeSO4和0.1mmol·L-1维生素C的试管中，于37℃保温1h。保温结束后，加入1.0ml三氯醋酸(TCA，28％)终止反应，再加入1.5ml硫代巴比妥酸(TBA，1％)，然后将此体系于100℃加热15min。离心除去蛋白质沉淀后，于532nm测定丙二醛(MDA)-TBA复合物的吸光度。BHA(丁化羟基苯甲醚)为阳性对照。待测样品的抗氧化活性以下式计算：
抑制率(％)＝(A A1)/A×100％。
其中A为对照的吸光度，A1为含待测样品体系的吸光度。
表1莲藕中活性成分含量及抗氧化活性
3.体外抗氧化活性测定
(1)清除超氧阴离子自由基
反应体系为3.0mL的Tris-HCl缓冲液(16mM，pH 8.0)，包括78μM的NADH，50μM的NBT，10μM的PMS和不同浓度的样品。超氧阴离子自由基和NBT的显色反应在560nm下测定。
(2)清除羟基自由基
反应体系为3mL的PBS缓冲液(0.15mM，pH 7.4)，包含100mM的Vc，100μM的CuSO4，12μM的细胞色素C和不同浓度的样品。反应混合物在25℃下温育90分钟，然后在550nm下测定其分光光度值的变化。清除率的计算公式为：
抑制率(％)＝(T-T2)/(T-T1)×100％
T为OH-系统的光度值，T1和T2是对照和样品的光度值。
表二：莲藕中活性成分L2f-2和L2f-3自由基清除活性
实施例3：
莲藕中小分子儿茶素类成分抗HIV-1逆转录酶(HIV-1RT)活性
在1.5ml的离心管中依次加入20μl不同浓度的样品、20μl RT(0.2ng/μl)和20μl模板与核苷酸混合物组成60μl反应体系，于37℃反应1h(正对照：以20μl lysis buffer代替样品；空白对照：以40μl lysis buffer代替样品和RT)。将60μl反应液转移到MTP板的小孔中，37℃反应1h，完全吸去残液后用250μl洗液洗涤5次，每次洗30s，弃尽残液，每孔加入200μlAnti-DIG-POD(200mU/ml)，加膜，37℃反应1h。吸去残液后用250μl洗液洗5次，每次洗30s，弃尽残液，每孔加入200μl ABTS(约1.3mg/ml)，于15-25℃反应约40min显色。以490nm为本底，在405nm测吸光度。
抑制率％＝100％-(样品-负对照)/(正对照-负对照)％
正对照：反应体系中不含有HIV-1逆转录酶的抑制剂
负对照：反应体系中不含有HIV-1逆转录酶。
Claims (7)
1.一种莲藕中儿茶素类小分子的提取方法，其特征在于该小分子活性成分通过水浸提、大孔树脂吸附、葡聚糖凝胶过滤，得到两种纯化产物没食子儿茶素和儿茶素。
2.如权利要求1所述的莲藕中儿茶素类小分子的提取方法，其特征在于，经过下述步骤：
(1)取新鲜莲藕，粉碎，去离子水4℃浸泡过夜，过滤除去残渣，5000rpm离心10min取上清旋转蒸发去多余的水分，-45℃冷冻干燥得到粗提物L；
(2)将粗提物L溶于去离子水中，上样于大孔吸附树脂，洗脱，先用去离子水洗去杂质L1，再用30％的乙醇洗脱得到有效成分样品L2，柱子用90％乙醇洗去杂质L3；
(3)得到的样品L2冷冻干燥后称、取上样于1.2×80cm的葡聚糖凝胶柱LH-20，洗脱，先用去离子水和乙醇依次洗去杂质L2a~L2d，再用乙醇洗脱，通过测量OD280得到三个洗脱峰，分别命名为L2e、L2f和L2g，收集第二个峰，为抗氧化活性总产物L2f；
(4)L2f冷冻干燥后用制备型HPLC的C18柱，以水和甲醇混合液洗脱，洗脱速度为3ml/min，洗去杂质L2f-1后，收集得到两个抗氧化活性纯品峰，命名为L2f-2，鉴定为没食子儿茶素，以及L2f-3，鉴定为儿茶素。
3.按照权利要求2所述的莲藕中儿茶素类小分子的提取方法，其特征在于，步骤(1)中为冷水浸提。
4.按照权利要求2所述的莲藕中儿茶素类小分子的提取方法，其特征在于，步骤(2)中使用1.5×35cm的弱极性大孔吸附树脂NKA柱，仅用水和30％乙醇即可从粗提物L中一步分离出活性总产物L2。
5.按照权利要求2所述的莲藕中儿茶素类小分子的提取方法，其特征在于，步骤(3)中使用1.2×80cm的葡聚糖凝胶柱LH-20，仅用水和不同浓度乙醇即可对活性总产物进行用分离，用60％的乙醇有效纯化得到儿茶素类有效成分L2f。
6.按照权利要求2所述的莲藕中儿茶素类小分子的提取方法，其特征在于，步骤(4)中，仅用水和甲醇即可在C18反向柱上用HPLC法纯化出单一活性成分，甲醇与水的体积比例为3∶7。
7.一种权利要求1和2所述的莲藕中儿茶素类小分子的应用方法，其特征在于，提取物L2f-2和L2f-3，可应用于体内外抗氧化以及抗病毒药物或保健品。
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