CN111533722A - 一种从松针层孔菌中提取纯化具有抗氧化活性多酚类化合物的方法 - Google Patents

一种从松针层孔菌中提取纯化具有抗氧化活性多酚类化合物的方法 Download PDF

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Abstract

一种从松针层孔菌中提取纯化具有抗氧化活性多酚类化合物的方法，包括：采用甲醇‑水溶液提取松针层孔菌粉末得粗提液；采用大孔树脂分离色素粗提液,依次采用水和乙醇洗脱,收集在波长为280nm处存在紫外可见吸收的组分洗脱液；采用Sephadex LH‑20分离组分,采用水与乙醇作为洗脱液进行洗脱,收集在波长为280nm处存在紫外可见吸收的小分子组分提取物；采用HPLC分离纯化小分子组分洗脱液,检测波长为280nm,收集吸收峰得到。本发明提取的小分子不仅具有很强的体外抗氧化活性,且可保护由过氧化氢氧化产生H9c2细胞的氧化损伤,预防与自由基相关的各种疾病。本发明提取的小分子具有抗氧化性,可用于制备高性能的抗氧化产品。

Description

一种从松针层孔菌中提取纯化具有抗氧化活性多酚类化合物 的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种松针层孔菌(Phellinus pini(Thore:Fr)Ames.)中具有抗氧化黄酮类小分子提取物及其制备方法。
背景技术
近年来，自从世界卫生组织(WHO)提倡将传统药物与现代药物相结合应用于疾病治疗与保健之后，药用真菌作为中药或功能性食品，在医药产业引起了广泛关注。从药用真菌中分离获得的许多活性成分，包括小分子、多糖、蛋白、多糖-蛋白复合物等，具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节的作用等等。松针层孔菌就是如上说的有用真菌之一。
松针层孔菌Phellinus pini属担子菌门，非褶菌目，多孔菌科，针层孔菌属大型真菌(Phellinus pini(Thore:Fr)Ames.)的干燥子实体，又别名松木层孔菌、松白腐菌、黄芝、松针林芝、红缘树舌等。分布于东北、河北、山西、甘肃、四川等地。常生长于针叶树的树干或朽木上。研究表明其具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫、降血糖等药理作用。松针层孔菌有悠久的药用历史，《神农本草经》曾记载：黄芝，味甘、平。主治心腹五邪，益脾气，安神，忠信和乐.久食轻身，不老延年。
目前，除了对松针层孔菌Phellinus pini栽培技术的研究外，对其生物活性成分的研究相对较少，主要是从其粗提物、小分子代谢产物和多糖这三方面来进行研究。1、Jeong S C.等(JMicrobiol Biotechn 2004，21：15-21)研究并证实了Phellinus pini深层培养的水溶性糖-蛋白的免疫调节活性和化学特性，发现了它使巨噬细胞的一氧化氮(NO)释放能力和酸性磷酸酶活性分别增加了1.6倍(ug/ml)和3.4倍(500ug/ml)，并且混合淋巴细胞反应(MLR)中的脾细胞增殖与对照组相比，也增加了2.6倍(200ug/ml)。Peng Jiang等(Int J Biol Macromol.,2016,93：566–571)发现了从Phellinus pini液体培养提取的一种多糖(PPE)具有很高的巨噬细胞激活能力，从而增强了吞噬作用，而促进了肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor:TNF)的诱发和活性氧的产生；Lee S M(Macromol Res.,2010,18(6):602-609)等证明Phellinus pini子实体的两种多糖具有对单纯疱疹病毒1(HSV-1)的抑制活性。2、Im K H.等(Mycobiolog.,2018,46(2):159–167)从其子实体分离出一种甲醇提取物，显着降低了大鼠的血浆脂质和葡萄糖，而抑制α-葡糖苷酶和α-淀粉酶活性。3、KimY.等(Int J Med Mushrooms 2015,17(3):297-307)从Phellinus pini子实体中分离得到3种具有抗氧化作用的葡聚糖。Kaur,N等(Int J Med Mushrooms 2019,21:549-559)证明了从Phellinus pini提取的热水提取物(HW)具有较强的抗氧化活性，包括羟自由基清除活性(90.0％)、超氧化物自由基清除活性(88.9％)和DPPH自由基清除活性(74.92％)。
总的来说，目前对Phellinus pini的组成及其药用价值研究较少，尤其是对于Phellinus pini中多酚及小分子活性成分研究还非常有限。
根据研究结果，氧化应激(Oxidative stress)在各种心血管疾病的发病机制中起着至关重要的作用，如心力衰竭，心肌缺血再灌注损伤，心肌病，高血压，动脉粥样硬化，代谢综合征和心房颤动。氧化应激导致(ROS:reactive oxygen species)的过量产生，这是心血管疾病发展中的重要事件。过量的ROS会对心肌细胞造成严重损害，从而损害氧化-抗氧化平衡系统。此外，损伤的进一步发展可导致体内的正常细胞凋亡。氧化应激和细胞凋亡在心血管疾病的发展中起重要作用。减轻氧化应激和/或直接干预抑制凋亡途径可以为治疗性治疗提供潜在的分子靶点。
因此，发现和开发一种新的天然产物，对预防和治疗氧化应激引起的心脏病具有重要意义。目前国内外对药用真菌的抗氧化药理作用的研究主要集中在蘑菇里面的多酚类小分子。水-乙醇体系提取Phellinus pini中黄酮类小分子的工艺方法及提取物生物活性的研究尚未见报道。
发明内容
针对上述问题，本发明目的在于，提供松针层孔菌Phellinus pini中一种抗氧化小分子提取物及其制备方法。而本发明首次从Phellinus pini中分离纯化得到一种具有抗氧化活性的小分子活性成分，该提取物对H2O2诱导大鼠心肌细胞株H9c2的氧化损伤具有明显这保护作用。
本发明的技术方案
一种从松针层孔菌Phellinus pini中提取纯化具有抗氧化活性多酚类化合物的方法，该活性成分通过甲醇浸提、大孔树脂吸附、葡聚糖凝胶过滤，得到一种黄铜类型的小分子，按照如下方法制备：
(1)将松针层孔菌菌核体50～70℃烘干并研磨成粉，浸泡于50％～80％甲醇溶液中，于40～60℃搅拌8～16小时，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液，取上清旋转蒸发去多余的水分,-45℃冷冻干燥得到粗品P-P-1。
(2将松针层孔菌小分子粗品溶解于去离子水中，用去离子水、20％、30％、50％和70％乙醇依次洗脱，通过测量OD280得到一个洗脱峰,收集30％乙醇洗脱峰组分,为抗氧化活性组分PP-3，柱子用无水乙醇洗去杂质，用去离子水再冲洗。
(3)将30％乙醇洗脱峰组分上样于1.5×70cm的SephadexLH-20，用去离子水、30％、60％和90％乙醇依次洗脱，先用去离子水洗去杂质，通过测量OD280得到二个洗脱峰,收集60％乙醇洗脱峰组分,为抗氧化活性组分PP-S-4。
(4)将60％乙醇洗脱峰组分冷冻干燥后用制备型HPLC的C18柱,以0.05％乙酸溶液、乙腈和甲醇混合液洗脱，流动相A为乙腈:甲醇体积比v/v＝80:20，流动相B为去离子水:冰乙酸体积比v/v＝99.5:0.5。梯度洗脱条件如下：0-5min，25％A；5-20min，80％A；20-25min，45％B；25-30min，B。洗脱速度为2ml/min，洗去杂质后，收集得到一个抗氧化活性纯品峰组分，命名为PP-S4-1，鉴定为儿茶素。
进一步的，步骤(1)中松针层孔菌菌核体粉末粉与甲醇溶液(优选70％)的质量比为1:8；
步骤(2)中洗脱使用2.4×50cm的大孔吸附树脂AB-8柱,洗脱时，洗脱流速为1ml/min,洗脱体积为2～2.5BV；步骤(3)中洗脱使用1.5×70cm的葡聚糖凝胶柱LH-20,洗脱时，洗脱流速为0.4ml/min,洗脱体积为2～3BV；步骤(4)中C18反向柱上用HPLC法纯化出单一活性成分,流动相A为乙腈:甲醇＝80:20，v/v，流动相B为去离子水:冰乙酸＝99.5:0.5,v/v。梯度洗脱条件如下：0-5min，25％A；5-20min，80％A；20-25min，45％B；25-30min，B。柱子温度为30℃，洗脱速度为2ml/min，通过测量OD280得到一个洗脱峰，收集活性组分PP-S4-1。
本发明同时提供了一种上述方法提取的具有抗氧化活性的多酚类化合物——黄铜类型的小分子，命名为PP-S4-1，高分辨ESI负离子质谱及核磁共振氢碳谱确定PP-S4-1的分子量为290.015，分子式为C15H14O6,鉴定为儿茶素((+)-Catechin)。
本发明中松针层孔菌Phellinus pini抗氧化小分子提取物PP-S4-1对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤具有明显的抑制作用，Hochest-PI双染色、DAPI染色证明该小分子能够保护心肌细胞的氧化损伤。
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明中松针层孔菌Phellinus pini抗氧化小分子提取物为天然提取物，具有良好的安全性；(2)本发明中松针层孔菌Phellinus pini抗氧化小分子提取物为单一黄酮类小分子；(3)本发明中松针层孔菌Phellinus pini抗氧化小分子提取物具有较强的抗氧化活性；(4)本发明中松针层孔菌Phellinus pini抗氧化小分子提取方法简单，成本低，适于大规模生产。
附图说明
图1本发明Phellinus pini抗氧化组分的提取及纯化流程图。
图2本发明Phellinus pini抗氧化组分的AB-8大孔树脂层析图。
图3本发明Phellinus pini抗氧化组分的Sephadex LH-20凝胶层析图。
图4本发明Phellinus pini抗氧化组分PP-S-4的分析型及制备型HPLC图，其中，a:
分析型HPLC图，b:制备型HPLC图。
图5本发明Phellinus pini抗氧组分PP-S4-1的ESI-MS色谱图。
图6本发明Phellinus pini抗氧化组分PP-S4-1的1H NMR及13NMR色谱图，其中，a:
1H NMR色谱图，b:13NMR色谱图。
图7本发明Phellinus pini抗氧化组分PP-S4-1对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护效果，其中，a:H9c2细胞毒性试验结果，b:对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护效果。
图8本发明Phellinus pini抗氧化组分PP-S4-1对H9c2细胞凋亡形态的影响，其中，a:Hochest-PI染色结果，b:DAPI染色结果。
图9本发明Phellinus pini抗氧化组分PP-S4-1对H9c2细胞的抗氧化酶和脂质过氧化的影响，其中，a:PP-S4-1对超氧化物歧化酶(SOD)的影响，b:PP-S4-1对过氧化酶(CAT)的影响，c:PP-S4-1对谷胱甘肽过氧化物酶的影响，d:PP-S4-1对脂质过氧化物(MDA)的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
以下所述实施例中所用的材料、试剂等，任何人均能从商业渠道采购。所述的松针层孔菌Phellinus pini可从黑龙江省栾川市当地市场获得。
实施例1：
本发明松针层孔菌Phellinus pini抗氧化小分子提取物PP-S4-1的制备与结构分析，提取及纯化流程参见图1。
1)松针层孔菌Phellinus pini抗氧化小分子提取物PP-S4-1的分离及纯化
(1)将松针层孔菌菌核体70℃烘干并研磨成粉，浸泡于70％甲醇溶液中，质量比为1:8，于55℃搅拌12小时，8000rpm离心10min，收集上清液，取上清旋转蒸发去多余的水分,-45℃冷冻干燥得到粗品P-P-1。
(2)将P-P-1溶解于去离子水中，用去离子水、20％、30％、50％和70％乙醇依次洗脱，洗脱速度为1ml/min，脱体积为2～2.5BV，通过测量OD280得到一个洗脱峰,收集30％乙醇洗脱峰组分,为抗氧化活性组分PP-3，参见图2。
(3)将PP-3上样于1.5×70cm的SephadexLH-20，用去离子水、30％、60％乙醇依次洗脱，先用去离子水洗去杂质，洗脱速度为0.4ml/min,脱体积为2～3BV，通过测量0D280得到二个洗脱峰,收集60％乙醇洗脱峰组分,为抗氧化活性组分PP-S-4，参见图3。
(4)将60％乙醇洗脱峰组分冷冻干燥后用制备型HPLC的C18柱,流动相A为乙腈:甲醇＝80:20,v/v，流动相B为去离子水:冰乙酸＝99.5:0.5,v/v。梯度洗脱条件如下:0-5min，25％A；5-20min，80％A；20-25min，45％B；25-30min，B。柱子温度为30℃，洗脱速度为2ml/min，通过测量0D280得到一个洗脱峰，收集得到一个抗氧化活性纯品峰，命名为PP-S4-1，参见图4。
2)松针层孔菌Phellinus pini抗氧化小分子组分的结构鉴定
(1)高分辨率负离子质谱(ESI-MS质谱)
MS测定是在VG ZAB-HS型色谱质谱联用仪上进行，高分辨率ESI负离子质谱确定PP-4-1组分的分子量为[M+H]+m/z＝290.0150，参见图5。
(2)核磁共振氢谱与核磁共振碳谱(1D-与2D-核磁共振)
NMR测定是在Quantum-1型(400MHz)核磁共振谱仪上进行，PP-S4-1组分的核磁共振氢谱分析结果如下:1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ5.83(H-8:d,J＝2.3Hz),δ5.94(H-6,d,J＝2.3Hz),δ4.57(H-2,d,J＝7.4Hz),δ3.72(H-3,J＝7.8Hz,J＝5.4Hz),δ2.42(H-4α,dd,J＝16.1Hz,J＝5.4Hz),δ2.84(H-4β,dd,J＝16.1Hz,J＝5.4Hz),δ6.84(H-2′,d,J＝1.9Hz),δ6.72(H-5′,d,J＝1.9Hz),δ6.76(H-6′,dd,J＝8.1Hz,J＝1.9Hz)，参见图6a。核磁共振碳谱分析结果如下：13C NMR(DMSO-d6,160.30MHz):δ157.12(C-7),δ155.47(C-9),δ156.52(C-5),δ147.20(C-4′),δ144.97(C-3′),δ130.87(C-1′),δ120.46(C-5′),δ118.93(C-6′),δ113.92(C-2′),δ99.96(C-10),δ97.24(C-8),δ94.93(C-6),δ81.87(C-2),δ67.51(C-3),δ27.32(C-4)，分子式为C15H14O6,鉴定为儿茶素((+)-Catechin)，参见图6b。
实施例2：本发明Phellinus pini中黄酮类小分子的抗氧化活性
1)Phellinus pini中黄酮类小分子的细胞水平抗氧化活性测定
(1)正常昆明种雄性小鼠摘眼球取血,收集于冰浴的0.15M NaCl的离心管中,于2500rpm离心10min,将红细胞与血浆和破碎细胞膜分离。
(2)并用10倍体积pH7.4的PBS溶液(10ml pH7.4 Na2HPo4-NaH2PO4液,125mM Nacl)洗涤2次,最后得到完整的红细胞。
(3)此分析体系采用过氧自由基造成红细胞溶血,以pH7.4的PBS制备20％的红细胞悬液,加入到等体积的200mMAAPH中(溶于PBS),其中含有待测样品。
(4)反应混合物置于37℃温浴振荡1h,温浴结束后将此体系以8倍体积的PBS稀释,2500rpm离心10min,于540nm测定上清液的吸光值A。
(5)同时,将此体系以8倍体积的蒸馏水稀释,使红细胞完全溶血,并于540mm测定上清的吸光值B.L-抗坏血酸作为正对照。样品抑制溶血百分率按下式计算；
抑制率(％)＝(1-A/B)×100(％)
2)Phellinus pini中黄酮类小分子的组织水平抗氧化活性测定
(1)取正常昆明种雄性小鼠的脑,剪成小块后,用Polytron电动匀浆器,在冰冻Tris-HCL缓冲液(20mmol L-1,pH7.4)中,得到1/10匀浆。
(2)所得匀浆以14000rmin'离心15min,将匀浆中的上清均分成1ml加到含有待测样品、10μmol.L-1FeSO4和0.1mmol L-1。
(3)维生素C的试管中,于37℃保温1h,保温结束后,加入1.0ml三氯醋酸(TCA,28％)终止反应,再加入1.5ml硫代巴比妥酸(TBA,1％),然后将此体系于100℃加热15min。
(4)离心除去蛋白质沉淀后,于532nm测定丙二醛(MDA)-TBA复合物的吸光度。
(5)BHA(丁化羟基苯甲醚)为阳性对照。待测样品的抗氧化活性以下式计算:
抑制率(％)＝(A-A1)/A×100(％)。
其中A为对照的吸光度,A1为含待测样品体系的吸光度。
表1.各组分的抗氧化活性与总多酚含量
Table 1.Antioxidant activities and total phenolic contents(TPC)thefractions
Figure BDA0002508434160000071
每个值用均数±标准差表示(n＝3)
TPC:总酚含量(TPC)作为儿茶素当量(CE)mg/g的提取物进行分析。
#:样品的浓度是125μg/毫升
*:与“制备型HPLC前”相比较与p<0.05.
实施例3：本发明Phellinus pini中黄酮类小分子对H2O2诱导H9c2细胞氧化损伤的保护作用
1)Phellinus pini中黄酮类小分子对心肌细胞(H9c2细胞)毒性的影响(参见图7a)
(1)取正常生长的H9c2细胞用胰酶消化并计数，调整细胞浓度为1.5×105cfu/ml,2ml/孔接种在96孔培养板中，于37℃培养24小时。
(2)培养24h后，每孔加入10μL用培养基依次梯度稀释的浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的抗氧化小分子提取物，并设空白对照，于37℃继续培养24h。
(3)取出96孔板，向每孔液面上方缓慢加入25μL预冷的50％TCA溶液，继而4℃放置1h；蒸馏水洗5次后，室温控干；向每孔中加入100μL 0.4％的SRB溶液，室温染色30min；用1％乙酸溶液洗去多余的SRB染液，室温控干。
(4)加入150μL 10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液，75rpm/min、37℃振荡15min溶解染料。
(5)在酶标仪上，测定溶液在490nm处的吸收光值，并计算细胞存活率，计算公式如下：
细胞存活率＝ODtreat/ODcontrol×100％
2)Phellinus pini中黄酮类小分子对H2O2诱导H9c2细胞损伤的抑制效果(参见图7b)
(1)取正常生长的H9c2细胞用胰酶消化并计数，调整细胞浓度为1.5×105cfu/ml,2ml/孔接种在96孔培养板中，于37℃培养24小时。
(2)培养24h后，每孔加入10μL用培养基依次梯度稀释的浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的抗氧化小分子提取物，并设空白对照，37℃培养24h。
(3)弃各组细胞培养基，向每孔加入2ml用含H2O2的DMEM培养基，加入终浓度为300μmol/L的H2O2溶液培养3h。
(4)取出96孔板，向每孔液面上方缓慢加入25μL预冷的50％TCA溶液，继而4℃放置1h；蒸馏水洗5次后，室温控干；向每孔中加入100μL 0.4％的SRB溶液，室温染色30min；用1％乙酸溶液洗去多余的SRB染液，室温控干。
(5)加入150μL 10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液，75rpm/min、37℃振荡15min溶解染料。
(6)在酶标仪上，测定溶液在490nm处的吸收光值，并计算细胞存活率，计算公式如下：
细胞存活率＝ODtreat/ODcontrol×100％
3)Hoechst-PI染色分析(参见图8a)
(1)取正常生长的H9c2细胞用胰酶消化并计数，调整细胞浓度为1.5×105cfu/ml,2ml/孔接种在6孔培养板中，于37℃培养24小时。
(2)培养24h后，每孔加入10μL用培养基依次梯度稀释的浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的抗氧化小分子提取物，并设空白对照，37℃培养24h。
(3)弃各组细胞培养基，向每孔加入2ml用含H2O2的DMEM培养基，加入终浓度为300μmol/L的H2O2溶液培养3h。
(4)H2O2处理后，培养液吸出后加入0.25％胰酶进行消化，加入血清终止消化，收集细胞，1000rpm/min离心5min。
(5)弃上清，加入5ml 0.01M PBS悬浮细胞，1000rpm/min离心5min，加入2ml 0.01MPBS悬浮细胞，1000rpm/min离心5min。
(6)200μl 0.01M PBS悬浮细胞，加Hoechst33342染色剂10μl，加入PI 10μl混匀，37℃避光孵育染色15min，1000rpm/min离心10min，去上清后用滤纸控干EP管。
(7)加入少量0.01M PBS，吹匀，用锡纸包裹，使用荧光显微镜观察，参考图8a。
4)DAPI染色分析(参见图8b)
(1)先取将高压灭菌过的盖玻片放入12孔培养板，将正常生长的H9c2细胞用胰酶消化并计数，调整细胞浓度为1.5×105cfu/ml,1ml/孔接种在12孔培养板中，于37℃培养24小时。
(2)培养24h后，每孔加入10μL用培养基依次梯度稀释的浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的抗氧化小分子提取物，并设空白对照，37℃培养24h。
(3)弃各组细胞培养基，向每孔加入1ml用含H2O2的DMEM培养基，加入终浓度为300μmol/L的H2O2溶液培养3h，加入0.01M PBS洗涤2次，吸干残留的PBS。
(4)4％多聚甲醛于37℃固定20min，洗净后加入0.01M PBS洗2次，加入1μl/mlDAPI工作液室温避光染色15min。
(4)加入0.01M PBS清洗后，荧光显微镜下照相观察，参考图8b。
实施例4：本发明Phellinus pini中黄酮类小分子对H9c2细胞的抗氧化酶和脂质过氧化的影响，参见图9。
(1)取正常生长的H9c2细胞用胰酶消化并计数，调整细胞浓度为1.5×105cfu/ml,2ml/孔接种在6孔培养板中，于37℃培养24小时。
(2)培养24h后，每孔加入10μL用培养基依次梯度稀释的浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的抗氧化小分子提取物，并设空白对照，37℃培养24h。
(3)弃各组细胞培养基，向每孔加入2ml用含H2O2的DMEM培养基，加入终浓度为300μmol/L的H2O2溶液培养3h。
(4)吸掉各组细胞培养液，用0.01M PBS洗涤1次，用不含EDTA的胰酶消化液消化细胞，终止消化后将细胞悬液加至相应的离心管，1000rpm离心3min，弃培养基。
(5)用1mL预冷的0.01M PBS洗涤两次，1000rpm离心3min，弃上清，重复2次，将PBS吸净后加入500μl 0.01M PBS，混匀制成细胞悬液。
(6)使用细胞超声仪中进行细胞破碎，连续20次，每次5s，间隔10s，取样量为200μl。
(7)用比色法测定细胞内CAT活力、GSH-Px活力、SOD活力及MDA产生量。详细操作操作方法及检测过程按照试剂盒说明进行。
在正常细胞中，存在适当的过氧化-抗氧化平衡，但是，当活性氧(reactiveoxygen species,ROS)的生成增强或抗氧化剂的水平降低时这种平衡可以转向助氧化，这种状态称为氧化应激。
活性氧主要由过氧化氢(H2O2),单线态氧,超氧阴离子以及羟自由基组成,其中H2O2极易通过细胞膜,进入细胞内发生Fenton反应,产生大量活性较高的自由基,自由基大量堆积将导致机体氧化损伤。
当H2O2浓度过高时，会造成细胞不可逆的损伤，即使添加了抗氧化剂也无法起到保护作用。而当H2O2浓度过低时，不能对小鼠脾细胞起到明显氧化损伤效果。实验选择300μmol/l H2O2诱导小鼠脾细胞氧化损伤，细胞的存活率为51.9％左右。结果表明,当PP-S4-1浓度增加到50和100μg ml-1时，PP-S4-1组分显示出对氧化损伤细胞的保护作用。以300μmol/lH2O2处理H9c2心肌细胞3h后,细胞SOD、CAT及GSH-Px活性降低,MDA含量增加。这意味着此时心肌细胞以发生明显的氧化损伤与损伤模型组相比,PP-S4-1各浓度组处理后,SOD、CAT及GSH-Px活力明显增高,MDA生成减少。以上结果说明PP-S4-1可通过上调心肌细胞抗氧化酶水平提高其清除自由基的能力,从而降低脂质过氧化水平,保护心肌细胞PP-S4-1能抑制。
Hoechst-PI染色就是利用Hoechst染色液能够穿透完整细胞膜,而PI染液只能通过损伤的细胞膜的原理,而DAPI染液的原理也同样是根据染液透过胞膜,使细胞核着色,根据细胞核的形态来判别细胞状态。实验发现,给予H2O2处理后,Hoechst-PI染色可见H9c2细胞中部分细胞的细胞核凝集呈亮蓝色,部分细胞处于晚期凋亡呈红色荧光,部分细胞成碎片状DAPI染色可见模型组心肌胞核呈亮蓝色,染色质凝集呈颗粒状流式细胞术检测细胞凋亡率显著增高。给予PP-S4-1各浓度处理后,多数心肌细胞形态恢复正常，Hoechst-PI染色可见红染细胞明显减少,细胞凋亡率与模型组相比显著下降,说明PP-S4-1能够明显改善氧化应激损伤引起的心肌细胞凋亡,改善细胞形态。

Claims (8)

1.一种从松针层孔菌中提取纯化具有抗氧化活性多酚类化合物的方法，其特征在于该活性成分通过甲醇浸提、大孔树脂吸附、葡聚糖凝胶过滤，得到一种黄铜类型的小分子；提取方法包括：
(1)将松针层孔菌菌核体50～70℃烘干并研磨成粉，浸泡于50％～80％甲醇溶液中，于40～60℃搅拌8～16小时，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液，取上清旋转蒸发去多余的水分,-45℃冷冻干燥得到粗品P-P-1；
(2)将松针层孔菌小分子粗品溶解于去离子水中，用去离子水、20％、30％、50％和70％乙醇依次洗脱，通过测量OD280得到一个洗脱峰，收集30％乙醇洗脱峰组分，为抗氧化活性组分PP-3，柱子用无水乙醇洗去杂质，用去离子水再冲洗；
(3)将30％乙醇洗脱峰组分上样于1.5×70cm的SephadexLH-20，用去离子水、30％、60％和90％乙醇依次洗脱，先用去离子水洗去杂质，通过测量OD280得到二个洗脱峰，收集60％乙醇洗脱峰一个组分，为抗氧化活性组分PP-S-4；
(4)将60％乙醇洗脱峰组分冷冻干燥后用制备型HPLC的C18柱，以0.05％乙酸溶液、乙腈和甲醇混合液洗脱，洗脱速度为2ml/min，洗去杂质后，收集得到一个抗氧化活性纯品峰。
2.根据权利要求1所述的从松针层孔菌中提取纯化具有抗氧化活性多酚类化合物的方法，其特征在于，具体操作步骤包括：
(1)将松针层孔菌菌核体70℃烘干并研磨成粉，浸泡于70％甲醇溶液中，于55℃搅拌12小时，8000rpm离心10min，收集上清液，取上清旋转蒸发去多余的水分,-45℃冷冻干燥得到粗品P-P-1；
(2将P-P-1溶解于去离子水中，用去离子水、20％、30％、50％和70％乙醇依次洗脱，洗脱速度为1ml/min，通过测量OD280得到一个洗脱峰，收集30％乙醇洗脱峰组分，为抗氧化活性组分PP-3；
(3)将PP-3上样于1.5×70cm的SephadexLH-20，用去离子水、30％、60％和90％乙醇依次洗脱，先用去离子水洗去杂质，洗脱速度为0.4ml/min，通过测量OD280得到二个洗脱峰，收集60％乙醇洗脱峰组分，为抗氧化活性组分PP-S-4；
(4)将60％乙醇洗脱峰组分冷冻干燥后用制备型HPLC的C18柱，以0.05％冰乙酸溶液、乙腈和甲醇混合液洗脱，流动相A为乙腈:甲醇体积比v/v＝80:20，流动相B为去离子水:冰乙酸体积比v/v＝99.5:0.5，梯度洗脱条件如下：0-5min，25％A；5-20min，80％A；20-25min，45％B；25-30min，B；柱子温度为30℃，洗脱速度为2ml/min，通过测量0D280得到一个洗脱峰，收集得到一个抗氧化活性纯品峰组分，命名为PP-S4-1，鉴定为儿茶素。
3.按照权利要求1或2所述的从松针层孔菌中提取纯化具有抗氧化活性多酚类化合物的方法，其特征在于：步骤(1)中松针层孔菌菌核体粉末与甲醇溶液的质量比为1:8。
4.按照权利要求1或2所述的从松针层孔菌中提取纯化具有抗氧化活性多酚类化合物的方法，其特征在于，步骤(2)中洗脱使用2.4×50cm的大孔吸附树脂AB-8柱,洗脱时，洗脱流速为1ml/min，洗脱体积为2～2.5BV，仅用30％乙醇即可从粗提物P-P-1中一步分离出活性组分PP-3。
5.按照权利要求1或2所述的从松针层孔菌中提取纯化具有抗氧化活性多酚类化合物的方法，其特征在于，步骤(3)中洗脱使用1.5×70cm的葡聚糖凝胶柱LH-20，洗脱时，洗脱流速为0.4ml/min，洗脱体积为2～3BV，仅用60％的乙醇有效纯化得到黄酮类有效成分PP-S-4。
6.按照权利要求1或2所述的从松针层孔菌中提取纯化具有抗氧化活性多酚类化合物的方法，其特征在于，步骤(4)中C18反向柱上用HPLC法纯化出单一活性成分，流动相A为乙腈:甲醇体积比v/v＝80:20，流动相B为去离子水:冰乙酸体积比v/v＝99.5:0.5；梯度洗脱条件如下：0-5min，25％A；5-20min，80％A；20-25min，45％B；25-30min，B；柱子温度为30℃，洗脱速度为2ml/min，通过测量0D280得到一个洗脱峰，得到活性组分PP-S4-1。
7.一种权利要求1或2所述方法提取的多酚类化合物，所述化合物为黄铜类型的小分子，命名为PP-S4-1，鉴定为儿茶素。
8.一种权利要求7所述的多酚类化合物的应用,其特征在于：用于对H2O2诱导大鼠心肌细胞株H9c2的氧化损伤的保护作用，Hochest-PI双染色、DAPI染色证明该小分子能够保护心肌细胞的氧化损伤。
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