WO2013081046A1 - ブドウ梗由来抽出物 - Google Patents

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WO2013081046A1
WO2013081046A1 PCT/JP2012/080892 JP2012080892W WO2013081046A1 WO 2013081046 A1 WO2013081046 A1 WO 2013081046A1 JP 2012080892 W JP2012080892 W JP 2012080892W WO 2013081046 A1 WO2013081046 A1 WO 2013081046A1
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WO
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extract
grape
rachis
derived
elution
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PCT/JP2012/080892
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English (en)
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藤井　博
誠一 河原
秀文 真壁
Original Assignee
国立大学法人信州大学
株式会社サンクゼール
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Publication date
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    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/87—Vitaceae or Ampelidaceae (Vine or Grape family), e.g. wine grapes, muscadine or peppervine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/58—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4
    • C07D311/60—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with aryl radicals attached in position 2
    • C07D311/62—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with aryl radicals attached in position 2 with oxygen atoms directly attached in position 3, e.g. anthocyanidins

Definitions

  • the present invention relates to a grape rachis-derived extract.
  • the present invention also relates to an antitumor agent comprising the grape rachis-derived extract as an active ingredient.
  • the present invention relates to a compound derived from grape infarction, an antitumor agent containing the compound as an active ingredient, and the like.
  • Patent Document 1 it has been confirmed that an extract based on polyphenol extracted from red grape skin and seeds suppresses the growth of human gastric cancer cells. It has been suggested that this extract can be used.
  • Patent Document 2 shows that catechins (polyphenols) contained in wine vines and the like can be used for prescription of drugs for the purpose of preventing the onset of prostate cancer and improving symptoms of prostate hypertrophy.
  • Patent Document 3 discloses that in order to obtain a wine with an increased phenolic compound content, in a method for brewing wine, adding steamed grape pebbles to mash and fermenting it is disclosed. 4, it is disclosed that the color tone of a food or drink can be maintained by containing resveratrol, which is a kind of polyphenol contained in an extract extracted from squeezed grape vines, pericarps, leaves, or infarcts, in the food or drink. ing. Although these can be said to be effective utilization methods of grape residues, provision of more useful utilization methods is desired.
  • Patent Document 2 shows that catechins (polyphenols) that can be extracted from grape vines and their products can be used to prevent the onset of prostate cancer, improve symptoms of prostate hypertrophy, and the like.
  • catechins polyphenols
  • Patent Document 2 neither the method of extracting catechin (polyphenol) from grape vines or their products nor the effect of this formulation is specifically shown, and a useful method of using grape residues is fully disclosed. I could't say it was.
  • the present invention has an object of providing a useful method of using grape residue. More specifically, as a useful method of using the residue of grapes, it is an object to obtain an extract from grape rachis, and to use this extract as an active ingredient such as an antitumor agent.
  • the present invention relates to the following compounds (1) to (23), a grape rachis-derived extract, a method for producing the grape rachis-derived extract, and the like.
  • a compound represented by the following general formula (1) (A) n 1- (B) n 2 ...
  • A is a group represented by the following general formula (2);
  • R 1-1 may be the same or different and represents —H, —OH, —OCH 3 , —O-Glu, —O-Gal, —O-Sugar;
  • R 1-2 may be the same or different and represents —OH, —OCH 3 , —O-Glu, —O-Gal, —O-Sugar;
  • R 1-3 may be the same or different and represents —OH, —O-Glu, —O-Gal, —O-Sugar, —Gallate;
  • R 1-4 may be the same or different and represents -Catechin, -Epicatechin;
  • R 1-5 may be the same or different and represents —H or —OH;
  • B is a group represented by the following general formula (3);
  • R 2 may be the same or different and represents
  • Extract 7 obtained by elution with water A fraction soluble in water from the extract of 5) above is fractionated with a synthetic adsorbent using adsorption by Van der Weals force, and extract 7 obtained by elution with water )
  • the above 6) extract is further fractionated with a cellulose-based or derivative or hydrophilic compound polymer.
  • An antitumor agent comprising the grape rachis-derived extract according to any one of (10) to (14) as an active ingredient.
  • the antitumor agent according to (15), wherein the tumor is prostate cancer.
  • a tumor metastasis inhibitor comprising the grape rachis-derived extract according to any of (10) to (14) as an active ingredient.
  • the tumor metastasis inhibitor according to (17), wherein the tumor is prostate cancer.
  • the extract is further fractionated with a synthetic adsorbent using adsorption by Van der Weals force and eluted with an ethyl acetate / methanol solution to obtain an extract.
  • the extract of the above 1) is further obtained by Van der Weals force. Fractionation with a synthetic adsorbent using adsorption, and elution with methanol to obtain an extract 4)
  • the extract of 2) above is further fractionated with a synthetic adsorbent using adsorption by Van der Weals force to obtain acetic acid.
  • Step 5 Elution with an ethyl / methanol solution to obtain an extract 5)
  • the extract of 3) above is further fractionated with a synthetic adsorbent using adsorption by Van der Weals force
  • Step 6) Obtaining an extract by elution with ethanol: Soluble water-soluble matter among the extracts in 5) above is fractionated with a synthetic adsorbent using adsorption by Van der Weals force, and the extract is obtained by elution with water.
  • Step 7) Obtaining the extract of the above 6) by further fractionating with a cellulosic polymer or a derivative or hydrophilic polymer and eluting with purified water 8) Obtaining the extract of the above 6) further Step 9) Fractionation with cellulosic or its derivative or hydrophilic compound polymer, and elution with 50% ethanol aqueous solution to obtain an extract 9)
  • the above extract 6) is further extracted with cellulosic, its derivative or hydrophilic compound Step 10) Obtaining an extract by elution with isopropyl alcohol and elution with isopropyl alcohol 10) Further extract the extract of 1) above, or a derivative thereof or a hydrophilic compound.
  • the extract of 10) above is further fractionated with a synthetic adsorbent using adsorption by Van der Weals force to obtain 40% aqueous methanol solution.
  • Step 12) The step 10) is obtained by further fractionating the extract of 10) above with a cellulosic polymer or a derivative or hydrophilic polymer, and elution with a 60% aqueous methanol solution to obtain the extract 13 )
  • the step 1) is obtained by further fractionating the extract of 1) with a cellulose-based polymer or a derivative thereof or a polymer of a hydrophilic compound and eluting with 60% acetone aqueous solution to obtain the extract.
  • the resulting extract (23) is a grape incision of the Vitis vinifera Chardonnay, Sauvignon Blanc, Riesling, Kerner, Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Merlopinoir, or Yama Grape, or Vinifera hybrid Koshu,
  • the grape rachis origin according to any one of the above (19) to (22), which is derived from at least one grape selected from the group consisting of Muscat Berry A, Niagara, Campbell Early, Muscat Alexandria, Kyoho, or Concord A method for producing an extract.
  • the grape rachis-derived extract as an active ingredient such as an antitumor agent according to the present invention, it is possible to provide a useful method for using grape residues.
  • the grape rachis-derived extract of the present invention has been confirmed to be particularly useful for prostate cancer, and can be widely used for prevention of prostate cancer, improvement of prostate enlargement, and the like.
  • the compound derived from grape infarction obtained by the present invention can also be effectively used as an antitumor agent, a tumor metastasis inhibitor or the like.
  • FIG. 3 is a graph showing the influence on the expression level of the FABP5 gene in PC-3 cells by the addition of a grape rachis-derived extract (methanol eluate (hereinafter sometimes referred to as crude extract B)).
  • the vertical axis R.R. Q. Indicates the expression level of FABP5 gene / expression level of 18srRNA.
  • FIG. 2 is a diagram showing a separation and purification scheme of grape rachis-derived extracts (crude extracts AK) (Example 2).
  • A It is the figure which showed the influence on the expression level of FABP5 gene in PC-3 cell by the grape rachis origin extract (crude extract J) addition. In the statistical processing of the graph, the presence or absence of a significant difference by a one-way t-test was tested for the significant difference of the average value (Example 2).
  • B Examples 2, 1.
  • Example 2 (1) purified water eluate prepared in step 5, (2) 50% methanol eluate, (3) grape rachis-derived extract (crude extract J) or (4) grape rachis-derived extract (crude extract K) (Example 2) which showed the influence on the expression level of FABP5 gene in PC-3 cell by addition of ().
  • PC-3 by addition of (3) ethyl acetate / ethanol solution eluate prepared in Example 2, Step 3-1 and grape rachis-derived extract (crude extract G) prepared in Example 2, Step 3-2 It is the figure which showed the influence on the expression of FABP5 protein in a cell (Example 2).
  • FIG. 3 is a graph showing the effect on the expression of the FABP5 gene in PC-3 cells by the addition of an extract derived from the berry A infarct, an extract derived from the Chardonnay infarction, an extract derived from the Chardonnay branch, or a compound (implementation).
  • Example 8 shows that
  • the following compounds correspond to the “compound” of the present invention.
  • This compound may be a compound that is separated and purified from natural products such as grape rachis, or a synthesized compound.
  • A is a group represented by the following general formula (2);
  • R 1-1 may be the same or different and represents —H, —OH, —OCH 3 , —O-Glu, —O-Gal, —O-Sugar;
  • R 1-2 may be the same or different and represents —OH, —OCH 3 , —O-Glu, —O-Gal, —O-Sugar;
  • R 1-3 may be the same or different and represents —OH, —O-Glu, —O-Gal, —O-Sugar, —Gallate;
  • R 1-4 may be the same or different and represents -Catechin, -Epicatechin;
  • R 1-5 may be the same or different and represents —H or
  • —O-Glu refers to glucose
  • —O-Gal refers to galactose
  • “Sugar” of —O-Sugar in the general formula (2) and the general formula (3) is a monosaccharide such as glucose, fructose other than galactose, rhamnose, arabinose, mannose, xylose, galacturonic acid, glucuronic acid, Disaccharides such as sucralose, lactose, maltose, isomaltose, gentiobiose, melibiose, sucrose, trehalose, turanose, cellobiose, etc. It refers to polysaccharides such as dextrin and glucan.
  • -Gallate in the general formula (2) refers to a gallate group or a gallate residue, and refers to -Catechin, -Epicatechin, a catechin group, a catechin residue, an epicatechin group, or an epicatechin residue.
  • the general formula (2) is preferably any one selected from the group consisting of gallocatechin, epigallocatechin, catechin or epicatechin, a salt or derivative of gallocatechin, a salt or derivative of epigallocatechin, a catechin It may be a salt or derivative, or a salt or derivative of epicatechin.
  • Examples of the compound of the present invention include a compound represented by the general formula (4) and a compound represented by the general formula (5). Furthermore, the compound represented by the general formula (6), the compound represented by the general formula (7), the compound represented by the general formula (8), the compound represented by the general formula (9), and the general formula (10). Examples thereof include compounds and compounds represented by the general formula (11).
  • R 3 may be the same or different and represents —H or —OH, and at least one represents —OH.
  • R 3 may if -OH, all of R 3 may be -OH.
  • the —OH in R 3 may be one, two, three, four, five, six, seven, or eight.
  • R 4 may be the same or different and represents —H or —OH, and at least one represents —OH.
  • R 4 may if -OH, all R 4 may be -OH.
  • the —OH in R 4 may be one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or ten.
  • the “antitumor agent” of the present invention refers to an agent that prevents tumors from occurring in humans and the like, and can also be used for the treatment of tumors that have occurred. Also included are agents that suppress the growth of tumor cells in metastasized tissues.
  • the “tumor metastasis inhibitor” of the present invention causes the tumor to metastasize to other tissues from the primary lesion or the tissue where the tumor has already metastasized to other tissues by hematogenous metastasis, lymphatic metastasis, or disseminated metastasis. It refers to an agent that suppresses this, and is also included in this “antitumor agent”.
  • Such a “tumor metastasis inhibitor” of the present invention is preferably an agent having an activity of suppressing the expression of the FABP5 gene, which is a tumor metastasis-inducing gene.
  • the “antitumor agent” or “tumor metastasis inhibitor” of the present invention may be an agent containing the compound of the present invention as an active ingredient.
  • Such an “antitumor agent” of the present invention may be an agent consisting only of the compound of the present invention, and is necessary for the formation of a pharmaceutically acceptable carrier or drug in addition to the compound of the present invention. It may contain components and the like. Furthermore, it may be a compound containing another effective ingredient having an antitumor action and showing a synergistic effect on the compound of the present invention.
  • the “antitumor agent” or “tumor metastasis inhibitor” of the present invention includes the “vine rachis-derived extract” and “grass rachis-derived extract” containing the compound, and the “compound” of the present invention. Similarly to agents containing as an active ingredient, agents exhibiting antitumor activity are also included. These “anti-tumor agents” and “tumor metastasis inhibitors” may be agents derived from only “the grape rachis-derived extract” or “gravine rachis-derived extract” containing these compounds. In addition to the extract, it may contain a pharmaceutically acceptable carrier, a component necessary for forming a drug, and the like. Furthermore, it may be a compound containing another effective ingredient having an antitumor action and showing a synergistic effect on the compound of the present invention.
  • the “tumor” targeted by the “antitumor agent” or “tumor metastasis inhibitor” of the present invention for prevention or treatment may be a “tumor” in which the “antitumor agent” of the present invention acts effectively. Any of those conventionally known may be used. In particular, it is preferable to target prostate cancer, breast cancer and the like.
  • a grape rachis-derived extract containing a compound refers to an extract extracted from grape rachis and containing these compounds.
  • This “grape rachis-derived extract containing a compound” is a “grape rachis-derived extract” that exhibits the same action as the compound of the present invention, and is estimated to contain the compound of the present invention.
  • the extract derived from the infarction is also included.
  • Such “a grape rachis-derived extract containing a compound” is obtained by extracting grape rachis with hot water, hydrous alcohol, hydrous acetone, or an amphiphilic solvent in which a hydrophilic solvent and a lipophilic solvent are mixed. And grape rachis-derived extract.
  • the “grape rachis-derived extract” in the present invention is an extract obtained by extracting grape rachis with water, hydrous alcohol, hydrous acetone or an amphiphilic solvent in which a hydrophilic solvent and a lipophilic solvent are mixed. Any of them may be used, and they may be further separated and purified.
  • the hydrous alcohol include water-containing ethanol, methanol, and the like.
  • an amphiphilic solvent in which a hydrophilic solvent and a lipophilic solvent are mixed chloroform, ethyl acetate, methanol, butanol, water, or the like is used. A mixed solvent may be mentioned.
  • the grape stem used as a raw material may be any kind of grape stem.
  • the “grape rachis-derived extract” of the present invention is an extract obtained by extracting grape rachis with hot water, hydrous alcohol, hydrous acetone, an amphipathic solvent in which a hydrophilic solvent and a lipophilic solvent are mixed, and the like. It may be separated and purified.
  • the grapes that are used for extraction are the ones removed from the grapes with the de-infractor crusher (A-8) (manufactured by BAUCH), the ones that have been washed with water, or the ones whose surface has been removed from water after washing. What is necessary is just to have dried these further.
  • the grape rachis may be dried by any conventionally known method such as hot air drying, hot air drying, cold air drying, sun drying, freeze drying, microwave drying or vacuum drying.
  • this “separation and purification” includes fractionation by “synthetic adsorbent using adsorption by Van der Weals force” and “cellulosic, or a derivative or hydrophilic polymer thereof”. You may fractionate several times combining a synthetic adsorbent and a polymer.
  • Examples of the “synthetic adsorbent using adsorption by Van der Weals force” include reverse phase silica, polystyrene synthetic resin, acrylic synthetic resin, and the like.
  • the “synthetic adsorbent utilizing adsorption by Van der Weals force” used in the present invention may be a commercially available synthetic adsorbent, and examples thereof include silica gel modified with octadecyl group as reverse phase silica.
  • Amberlite (registered trademark) XAD (registered trademark) -1180N manufactured by Organo) (hereinafter sometimes referred to as XAD (registered trademark) -1180N)
  • Amberlite (registered trademark) XAD (registered trademark) -7HP Manufactured by Organo) (hereinafter sometimes referred to as XAD (registered trademark) -7HP)
  • Amberlite (registered trademark) XAD (registered trademark) -1160N (manufactured by Organo) hereinafter referred to as XAD (registered trademark) -1160N)
  • Diaion HP-20 Mitsubishi Chemical Corporation
  • Sephadex LH-20 is a cellulose-based polymer or a derivative or hydrophilic compound polymer thereof.
  • the grape rachis-derived extract (crude extract J) obtained in Example 2 of the present invention can be used. .
  • Sephadex LH-20 is a “cellulose-based polymer or a derivative or hydrophilic compound polymer”, for example, the grape rachis-derived extract (crude extract K) obtained in Example 2 of the present invention. .
  • Examples of the “grape rachis-derived extract” separated and purified in this way include those shown in the following 1) or 2).
  • examples of such an extract include the grape rachis-derived extract (crude extract Q) obtained in Example 5 of the present specification.
  • Diaion (trademark) HP-20 was used as the “synthetic adsorbent utilizing adsorption by Van der Weals force”, and the grape rachis-derived extract (Gyo extract R) obtained in Example 5 of the present invention was used. ) And the like.
  • the “method for producing an extract derived from grape rachis” of the present invention obtains an extract obtained by extracting grape rachis with hot water, hydrous alcohol, hydrous acetone, or an amphiphilic solvent obtained by mixing a hydrophilic solvent and a lipophilic solvent. Any process including a process may be used, and a process for further separating and purifying the extract thus extracted may be included.
  • Examples of the separation and purification step include fractionation by “synthetic adsorbent using adsorption by Van der Weals force” and “cellulosic, or its derivative or hydrophilic polymer”. An agent or a polymer may be combined and subjected to a step of fractionating multiple times.
  • synthetic adsorbent using adsorption by Van der Weals force and “cellulosic, or derivatives or hydrophilic compounds thereof” used herein, the above-mentioned commercially available ones can also be used.
  • PC-3 cells Culture of human prostate cancer cells (PC-3 cells) PC-3 cells obtained from the Human Science Foundation as human prostate cancer cells, 10% FBS (manufactured by MP Biomedicals) and 1% antibiotics The cells were cultured in RPMI medium (manufactured by SIGMA) supplemented with (100 U / ml penicillin, 250 ng / ml amphotericin B and 100 ⁇ g / ml streptomycin).
  • RT-PCR RT-PCR was performed using a RiverTra Ace (registered trademark) kit (manufactured by TOYOBO) and 2 ⁇ GoTaq (registered trademark) Green Master Mix (manufactured by Promega).
  • the sample prepared in the above (1) was diluted to 250 ng / ⁇ l with DEPC water.
  • Reagents were added to this sample and the compositions shown in Table 1 were processed in steps 1 to 3 with a thermal cycler (step 1.30 ° C., 10 minutes, step 2.42 ° C., 60 minutes, step 3.95 ° C. 5 minutes), cDNA (complementary DNA) was synthesized.
  • primers for amplifying the FABP5 gene shown in Table 2 (Sequence Listing Sequence Nos. 1 and 2)
  • primers for amplifying the ⁇ -actin gene as an endogenous control (Sequence Listing Sequence Nos.
  • a primer for amplifying 18s rRNA (SEQ ID NO: 5 and 6) having the composition shown in Table 3 as a primer was treated with a thermal cycler in steps 1 to 3 (step 1.95 ° C., 5 minutes, step 2.1) 95 ° C, 30 seconds, 2) 59 ° C, 40 seconds, 3) 72 ° C, 1 minute from 1) to 3) for 25 cycles, step 3.72 ° C, 5 minutes) to amplify the DNA.
  • the amplified DNA was electrophoresed on an agarose gel, stained with ethidium bromide, and irradiated with UV to examine the presence and extent of FABP5 gene expression in PC-3 cells. As a result, as shown in FIG. 2 (A), it was confirmed that the expression level of the FABP5 gene in PC-3 cells decreased depending on the addition concentration of the grape rachis-derived extract (crude extract A).
  • FIG. 3 shows, as an example, a photograph in the case of adding 2 mg / ml grape rachis-derived extract (crude extract A). This was similar to the cell morphology of RWPE-1, a normal prostate cell model.
  • RNAzol registered trademark
  • RT reagent RN190 manufactured by Molecular Research Center
  • the grape rachis-derived extract (crude extract A) was added to the medium of PC-3 cells so that the extract was 0.06 mg / ml, 0.12 mg / ml, and 0.6 mg / ml. After culturing them for 36 hours, Examples 1, 4-1,. The presence and extent of FABP5 gene expression were examined by the same method as described above. As a result, as shown in FIG. 5, when an extract derived from grape residue (skin and seed) was added, even when a high concentration of 1.5 mg / ml was added, the FABP5 gene in PC-3 cells It was confirmed that the expression level of the sera was not significantly reduced (FIG. 5, sample A).
  • Comparative Example 2 1. Preparation of Comparative Compound Each comparative compound shown in Table 4 was dissolved in the solvent shown in Table 4 so that the concentration of the comparative compound was 10 mM.
  • the structural formula of each comparative compound is shown in FIGS.
  • EGCG manufactured by Nagara Science Co., Ltd.
  • a compound synthesized as follows was used. That is, a gallocatechin skeleton is formed using 1,3,5-trihydroxybenzone as a starting material, the phenolic hydroxyl group of the catechin or epicatechin monomer is protected with a Benzyl group, and the C-ring secondary alcohol is protected with an Acetyl group.
  • trimer is a product of 2 catechin molecules and 1 molecule of epicatechin
  • tetramer (A) is a product of 4 molecules of catechin
  • tetramer (B) is 4 molecules of epicatechin.
  • the pentamer is obtained by binding five catechin molecules.
  • RT-PCR RT-PCR was performed using a RiverTra Ace (registered trademark) kit (manufactured by TOYOBO) and 2 ⁇ GoTaq (registered trademark) Green Master Mix (manufactured by Promega).
  • each sample prepared in 1) was diluted to 250 ng / ⁇ l with DEPC water.
  • the sample having the composition shown in Table 5 together with the reagent was processed in steps 1 to 3 with a thermal cycler (step 1.30 ° C., 10 minutes, step 2.42 ° C., 60 minutes, step 3.95 ° C., 5 Minutes) and cDNA (complementary DNA) was synthesized.
  • primers for amplifying the FABP5 gene shown in Table 6 (SEQ ID NOs: 7 and 8) or primers for amplifying 18s rRNA as endogenous controls (SEQ ID NOs: 9 and 10), respectively
  • a primer having the composition shown in Table 7 was prepared. This was set in a StepOne (registered trademark) real-time PCR system (Applied Biosystems), and quantitative analysis was performed by the ⁇ CT method to examine the presence and extent of FABP5 gene expression. DNA amplification in the StepOne® real-time PCR system (Applied Biosystems) was performed by the following steps 1 to 3. Step 1. 90 ° C., 5 minutes, Step 2.1) 95 ° C., 30 seconds, 2) 59 ° C., 40 seconds, 3) 72 ° C., 1 minute 1) to 3) 25 cycles, Step 3.72 ° C. 5 minutes
  • the expression level of the FABP5 gene did not decrease in any of the PC-3 cells to which each comparative compound was added.
  • the expression level of the FABP5 gene was lowered in PC-3 cells to which the grape rachis-derived extract (crude extract A) was added. Therefore, it was confirmed that only the grape rachis-derived extract (crude extract A) of the present invention had an effect of reducing the expression level of the FABP5 gene in PC-3 cells.
  • the expression level of FABP5 gene in PC-3 cells also did not decrease with Prodelphindin C2 (PDC2). 8 and FIG. Q. Indicates FABP5 gene expression level / 18srRNA expression level.
  • Examples 2, 3. As in the method described in 1., the expression level of FABP5 protein was examined, and it was confirmed that the expression of FABP5 protein was suppressed in PC-3 cells to which the grape rachis-derived extract (crude extract A) was added. .
  • Step 2 11.2 g of the methanol eluate (crude extract C) obtained in Step 1 was turbid in 100 ml of purified water. This was further adsorbed to 1.5 L of XAD (registered trademark) -1180N.
  • XAD registered trademark
  • a solution in which ethyl acetate and acetone are mixed at a volume ratio of 9: 1 (hereinafter sometimes referred to as an ethyl acetate / acetone solution), (2) a solution in which ethyl acetate and ethanol are mixed at a volume ratio of 9: 1 ( Hereinafter, it may be referred to as an ethyl acetate / ethanol solution), (3) a solution in which ethyl acetate and methanol are mixed at a volume ratio of 9: 1 (hereinafter referred to as an ethyl acetate / methanol solution (hereinafter referred to as a crude extract F).
  • Step 3-2 6 g of the methanol eluate (crude extract E) obtained in Step 2 was turbid in 100 ml of purified water. This was further adsorbed to 1.5 L of XAD (registered trademark) -1180N.
  • XAD registered trademark
  • Step 4 Purified water was added to 6 g of the methanol eluate (crude extract G) obtained in Step 3-2 and dissolved. The undissolved product was filtered with a Kiriyama funnel (filter paper N0.6) and washed with purified water to obtain a water-insoluble part. Moreover, the obtained solution was concentrated under reduced pressure with an evaporator at 40 ° C. or lower to obtain a water-soluble part. 4.4 g of this water-soluble part was adsorbed on 500 ml of XAD (registered trademark) -7HP. This XAD (registered trademark) -7HP was previously washed, placed in an open glass column ( ⁇ 6 cm ⁇ 55 cm), and sufficiently substituted with purified water.
  • XAD registered trademark
  • Step 5 500 mg of the purified water eluate (crude extract H) obtained in Step 4 was dissolved in 3.5 ml of purified water.
  • Sephadex LH-20 25 g was sufficiently wetted with purified water, and this was bet on a glass column packed.
  • B buffer composition: 1 M Tris-HCl (pH 7.5) 2 ml, 5 M NaCl 1.2 ml, 0.2 ml
  • B buffer composition: 1 M Tris-HCl (pH 7.5) 2 ml, 5 M NaCl 1.2 ml, 0.2 ml
  • the protein concentration of this lysate was measured by the Quick start protein assay method, and the sample for electrophoresis was prepared by matching the concentration with the sample having the lowest protein concentration.
  • the protein concentration of the sample for electrophoresis was 1.8 mg / ml.
  • SDS-PAGE SDS-PAGE was performed by the following steps (1) to (3).
  • (1) After mixing 20 ⁇ l of the sample for electrophoresis prepared in 1) above and 5 ⁇ Sample buffer, the sample was subjected to heat treatment at 90 ° C. for 5 minutes in a block insulator.
  • (2) The gel was set in the electrophoresis tank, and 25 ⁇ l of the heat-treated sample and 2 ⁇ l of the marker (prestained marker) were placed in each well.
  • the electrophoresis was initially performed at 60 to 70 V, and after separating gel was performed at 100 to 150 V for 1.5 to 2 hours.
  • Blocking buffer of the nitrocellulose membrane of (1) above composition: 1M Tris-HCl (pH 7.5) 2.5 ml, 5N NaCl 1.5 ml, Skim milk 2.5 g was made 50 ml with purified water) And blocked by shaking with room temp for over 1 hour.
  • nitrocellulose membrane of (3) is washed with a washing solution (composition: 1 M Tris-HCl (pH 7.5) 250 ⁇ l, 5N NaCl 150 ⁇ l, 10% Tween 20 25 ⁇ l made up to 50 ml with purified water) for 15 min and 3 times. did.
  • a washing solution composition: 1 M Tris-HCl (pH 7.5) 250 ⁇ l, 5N NaCl 150 ⁇ l, 10% Tween 20 25 ⁇ l made up to 50 ml with purified water
  • the secondary antibody reaction solution (composition: 1M Tris-HCl (pH 7.5) 250 ⁇ l, 5N NaCl 150 ⁇ l, 10% Tween 20 25 ⁇ l, Skim milk 0.25 g, secondary antibody ( Goat anti-Rabbit IgG.HRP (manufactured by Stressgen) (5 ⁇ l was made up to 5 ml with purified water) was added, and the mixture was shaken with room temp for 1 h or longer to carry out antigen-antibody reaction. (6) The nitrocellulose membrane of (5) was washed in the same manner as (4). (7) Detection Reagent 1 Peroxide Solution and Detection Reagent 2 Luminol Enhancer Solution (both from Pierce (registered trademark) Western Blotting Sublue c) did.
  • the primary antibody (anti-FABP5 antibody) used in the step of 3.3) Western blot (3) was prepared by the present inventors based on the following references. That is, a synthetic peptide consisting of 13 residues on the N-terminal side of human FABP5 and conjugated to a carrier protein in a synthetic peptide shown in SEQ ID NO: 11 was immunized to a rabbit, and serum was collected 8 weeks later to obtain an anti-FABP5 antibody. .
  • the band of the FABP5 protein detected by Western blotting was quantitatively analyzed by ImageJ (free software of the National Institutes of Health (NIH)) (FIG. 13A), and the expression level of the FABP5 gene was also quantitatively analyzed (FIG. 13A).
  • FIG. 13 (B)) the amount of expression suppression was almost the same at both mRNA and protein levels.
  • the grape rachis-derived extract (crude extract C) separated and purified in the step 1 and the grape rachis-derived extract separated and purified in the step 2 ( The addition of the crude extract D, the crude extract E), and the grape rachis-derived extract (crude extract H) separated and purified in the above step 4 also suppresses the expression of the FABP5 gene in PC-3 cells.
  • the crude extract D, the crude extract E), and the grape rachis-derived extract (crude extract H) separated and purified in the above step 4 also suppresses the expression of the FABP5 gene in PC-3 cells.
  • Sephadex LH-20 (25 g) was sufficiently wetted with purified water, and this was bet on a glass column packed.
  • Purified water 200 ml (2) 50% ethanol aqueous solution 300 ml, (3) 50% isopropyl alcohol aqueous solution 200 ml, (4) 30% acetone aqueous solution 100 ml, (5) 40% acetone aqueous solution 700 ml, (6) 50% acetone Elution with 550 ml of aqueous solution or 200 ml of (7) 60% aqueous acetone solution as an elution solvent and concentrating the eluate under reduced pressure at 42 ° C.
  • Step 2 223 mg of the 50% acetone eluate (crude extract L) obtained in Step 1 was dissolved in 1 ml of purified water. Adsorbed to XAD (registered trademark) -1600N. This XAD (registered trademark) -1600N was previously washed, put in an open glass column ( ⁇ 3 ⁇ 30 cm), 80 ml, and sufficiently substituted with purified water. (1) 300 ml of purified water, (2) 200 ml of 20% methanol, (3) 300 ml of 40% methanol, (4) 300 ml of 60% methanol, and (5) 200 ml of 100% methanol as elution solvents. By concentration under reduced pressure at 42 ° C.
  • Step 1 1 g of methanol eluate (crude extract C) was dissolved in 4 ml of 30% methanol, and then betted on Sephadex LH-20 (100 ml) that had been wetted and replaced with 30% methanol.
  • 30% methanol aqueous solution 300 ml (2) 40% ethanol aqueous solution 300 ml, (3) 30% acetone aqueous solution 100 ml, (4) 40% acetone aqueous solution 500 ml or (5) 60% acetone aqueous solution 400 ml
  • Each eluate was concentrated under reduced pressure at 40 ° C.
  • Step 2 The crude extract O345 mg obtained in Step 1 was dissolved in a 30% aqueous methanol solution (2 ml). This was betted on TOSOH TOYOPEARL® HW40F (63 ml) wetted with 30% aqueous methanol.
  • As elution solvents (1) 30% aqueous methanol solution 80 ml, (2) 40% ethanol aqueous solution 100 ml, and (3) 60% acetone aqueous solution 200 ml were sequentially eluted. Thus, (1) 117% methanol eluate 117 mg, (2) 40% ethanol eluate 7 mg, and (3) 30% acetone eluate (hereinafter sometimes referred to as crude extract P) 236 mg were obtained.
  • grape rachis extract Crude extract R 10.5 g of grapes (Chardonnay Vitis vinifera (Beaunois, Morillon)) separated with an ablation crusher (A-8) (manufactured by BAUCH) with water After washing and draining, it was cut to about 10 mm to 20 mm with scissors. The cut infarction was immersed in 200 ml of a 60% acetone solution. This was allowed to stand at room temperature for 3 days, and then filtered through a filter paper (Advantech N0.2). The obtained filtrate was concentrated under reduced pressure, and acetone was distilled off to obtain a solution.
  • A-8 ablation crusher
  • the filtrate obtained by filtration was concentrated to dryness at 40 ° C. or lower with an evaporator to obtain 4.2 g of an acetone extract (FIG. 24, 25: # 1).
  • the residue obtained by filtration was heated by adding 100 ml of purified water, and boiling was continued for 1 hour, followed by hot water extraction. After completion of hot water extraction, hot filtration with a large Buchner funnel (Advantech N0.2), the obtained filtrate was concentrated to dryness at 40 ° C. or lower, and hot water extract (FIG. 24, 25: # 2) 576 mg of was obtained. 3.
  • 3. Was dissolved in 100 ml of purified water. Of this, 75 ml was taken and 100% ethyl acetate was added for liquid separation.
  • the ethyl acetate layer was dried with sodium sulfate decahydrate (sodium salt) and then concentrated to dryness at 40 ° C. or lower to obtain 153 mg (FIG. 24, 25: # 4).
  • the aqueous layer was adsorbed on 1.5 L of XAD (registered trademark) -1180N as it was after removing ethyl acetate in the aqueous layer with an evaporator.
  • This XAD (registered trademark) -1180N was previously washed, placed in an open glass column ( ⁇ 6 cm ⁇ 55 cm), and sufficiently substituted with purified water.
  • catechin 7 has (epi) gallocatechin 7 molecules, (epi) catechin 7 molecules, and candidate compound A-1 having one galloyl group.
  • candidate compound A-1 having one galloyl group.
  • candidate compound A-2 having three molecules of galloyl groups was estimated.
  • Candidate compound A-1 C 127 H 102 O 53 Molecular weight: 2474.5286 [M + H] + 2475.5364
  • Candidate compound A-2 C 128 H 98 O 54 Molecular weight: 24744.4922 [M + H] + 2475.55000
  • the candidate compound A-1 had one molecule of gallocatechin or epigallocatechin, seven molecules of catechin or epicatechin, and one galloyl group.
  • This candidate compound A-1 is a novel compound represented by the following general formula (4), and exhibited the following physicochemical properties.
  • the candidate compound B-1 had one molecule of gallocatechin or epigallocatechin, nine molecules of catechin or epicatechin, and one galloyl group.
  • This candidate compound B-1 is a novel compound represented by the following general formula (5), and exhibited the following physicochemical properties.
  • these compounds, grape rachis-derived extracts containing the compounds, and grape rachis-derived extracts all have antitumor activity and tumor metastasis inhibiting activity, and are antitumor agents and tumors for tumors such as prostate cancer. It has been confirmed that it can be used as a metastasis inhibitor and an active ingredient thereof.
  • a wide range of agents aimed at improving prostate hypertrophy and the like can be provided. Utilizing the grape rachis-derived extract containing the compound of the present invention or the grape rachis-derived extract itself is useful for the useful utilization of grape residues.

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Abstract

下記一般式（１）で示される化合物および同化合物を有効成分として含む抗腫瘍剤。 （Ａ）ｎ１－（Ｂ）ｎ２ ・・・（１） ここで、ｎ１は６～２０のいずれかの整数を示し；ｎ２は１～２０のいずれかの整数を示し；Ａは下記一般式（２）で示される基であり；Ｂは下記一般式（３）で示される基であり；Ｒ１－１～Ｒ１－３は－Ｏ－Ｓｕｇａｒ等を示し；Ｒ１－４は－Ｃａｔｅｃｈｉｎ等を示し；Ｒ１－５は－Ｈ、－ＯＨを示し；Ｒ２は－Ｏ－Ｓｕｇａｒ等を示す。

Description

ブドウ梗由来抽出物
　本発明は、ブドウ梗由来抽出物に関する。また、該ブドウ梗由来抽出物を有効成分として含む抗腫瘍剤に関する。さらに、本発明は、ブドウの梗を由来とする化合物や、該化合物を有効成分として含む抗腫瘍剤等に関する。
　ワイン等のブドウを原料とする加工品の製造過程では、ブドウのしぼりかす、皮、蔓、梗等の残渣が大量に発生する。従来、これらは廃棄するしかなく、処理に費用がかかるとともに、処理によって環境に負荷を与えるという問題があった。そこで、これら残渣を有効に利用するために、様々な研究がなされている。
　例えば、特許文献１では、赤ブドウの果皮、種から抽出したポリフェノールを主成分とする抽出物が、ヒト胃ガン細胞の増殖を抑制することが確認されており、胃ガン細胞のアポトーシスの誘導にこの抽出物が利用できることが示唆されている。
　また、特許文献２では、ワインの蔓等に含まれるカテキン（ポリフェノール）が前立腺癌発症予防や前立腺肥大の症状改善等を目的とする薬剤の処方に利用できることが示されている。
　さらに、特許文献３では、フェノール化合物含量が高められたブドウ酒を得るために、ブドウ酒の醸造方法において、蒸煮したブドウ果梗をもろみに添加して発酵させることが開示されており、特許文献４では、ブドウの窄汁粕、果皮、葉、梗等から抽出した抽出物に含まれるポリフェノールの一種であるリスベラトロールを飲食品に含有することで、飲食品の色調を保持できることが開示されている。
　これらもブドウの残渣の有効な利用方法であるといえるが、さらに有用な利用方法の提供が望まれている。
　本発明では、ブドウの残渣のうちでも、大量に発生する梗を原料として、熱水、含水アルコール、含水アセトン、または親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒で抽出することにより抽出物を得た。さらに、ブドウの梗を由来として化合物を得た。そして、このブドウ梗由来抽出物や化合物が抗腫瘍作用、特に前立腺癌に対する抗腫瘍作用や腫瘍の転移抑制作用を示すことを見出したことにより、ブドウの残渣の新たな利用方法を提供するものである。
　前記のように、特許文献２において、ブドウの蔓やその産物から抽出できるカテキン（ポリフェノール）が前立腺癌発症予防や前立腺肥大の症状改善等に利用できることが示されている。しかし、特許文献２ではブドウの蔓やその産物からカテキン（ポリフェノール）を抽出する方法も、この処方による効果も具体的には示されておらず、ブドウの残渣の有用な利用方法が十分に開示されているとは言えなかった。
特開２００１－９７８７２号公報 特表２００８－５０８２５２号公報 特開平１０－３３７１７１号公報 特許第４４７１６３１号
　本発明は、ブドウの残渣の有用な利用方法の提供を課題とする。さらに詳しくは、ブドウの残渣の有用な利用方法として、ブドウの梗から抽出物を得ること、さらにこの抽出物を抗腫瘍剤等の有効成分として活用することを課題とする。
　本発明者らは前記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、ブドウの梗を熱水や、エタノール等の有機溶媒で抽出することによって抽出物が得られること、該ブドウ梗由来抽出物が抗腫瘍作用を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によって得られるブドウ梗由来抽出物は、前立腺癌由来の細胞に特に有効に作用することから、抗腫瘍剤や腫瘍の転移抑制剤の有効成分等として活用することができる。
　さらに、本発明者らは、ブドウの梗を由来として化合物を得た。この化合物もブドウの梗由来抽出物と同様に、抗腫瘍作用を示すことから、抗腫瘍剤や腫瘍の転移抑制剤の有効成分等として活用することができる。
　即ち、本発明は、次の（１）～（２３）に示される化合物、ブドウ梗由来抽出物、該ブドウ梗由来抽出物の製造方法等に関する。
（１）下記一般式（１）で示される化合物。
（Ａ）ｎ１－（Ｂ）ｎ２　　　・・・一般式（１）
（前記一般式（１）中、
ｎ１は６～２０のいずれかの整数を示し；
ｎ２は１～２０のいずれかの整数を示し；
Ａは下記一般式（２）で示される基であり；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 前記一般式（２）中、
Ｒ１－１は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒを示し；
Ｒ１－２は同一または異なっていてもよく、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒを示し；
Ｒ１－３は同一または異なっていてもよく、－ＯＨ、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒ、－Ｇａｌｌａｔｅを示し；
Ｒ１－４は同一または異なっていてもよく、－Ｃａｔｅｃｈｉｎ、－Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎを示し；
Ｒ１－５は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨを示し；
Ｂは下記一般式（３）で示される基であり；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 前記一般式（３）中、
Ｒ２は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒを示す。）
（２）前記一般式（２）がガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンまたはエピカテキンからなる群より選ばれるいずれか一種以上である前記（１）に記載の化合物。
（３）下記の一般式（４）で示される前記（１）または（２）に記載の化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （前記一般式（４）中、
Ｒ３は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨを示し、少なくとも一つは－ＯＨを示す。）
（４）下記の一般式（５）で示される前記（１）または（２）に記載の化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （前記一般式（５）中、
Ｒ４は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨを示し、少なくとも一つは－ＯＨを示す。）
（５）前記（１）～（４）のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む抗腫瘍剤。
（６）腫瘍が前立腺癌である前記（５）に記載の抗腫瘍剤。
（７）前記（１）～（４）のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む腫瘍の転移抑制剤。
（８）腫瘍が前立腺癌である前記（７）に記載の腫瘍の転移抑制剤。
（９）前記（１）～（４）のいずれかに記載の化合物を含むブドウ梗由来抽出物。
（１０）ブドウの梗を熱水、含水アルコール、含水アセトン、または親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒で抽出して得られるブドウ梗由来抽出物。
（１１）ブドウの梗をそのまま、または凍結した後、熱水、含水アルコール、含水アセトン、または親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒で抽出して得られる前記（１０）に記載のブドウ梗由来抽出物。
（１２）次の１）～１４）のいずれかである前記（１０）または（１１）に記載のブドウ梗由来抽出物。
１）ブドウの梗を熱水抽出して得られる抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物
２）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、酢酸エチル／メタノール溶液で溶出して得られる抽出物
３）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物
４）前記２）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、酢酸エチル／メタノール溶液で溶出して得られる抽出物
５）前記３）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物
６）前記５）の抽出物のうち水可溶物をＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、水で溶出して得られる抽出物
７）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、精製水で溶出して得られる抽出物
８）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、５０％エタノール水溶液で溶出して得られる抽出物
９）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、イソプロピルアルコールで溶出して得られる抽出物
１０）前記１）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、５０％アセトン水溶液で溶出して得られる抽出物
１１）前記１０）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、４０％メタノール水溶液で溶出して得られる抽出物
１２）前記１０）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％メタノール水溶液で溶出して得られる抽出物
１３）前記１）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％アセトン水溶液で溶出して得られる抽出物
１４）前記１３）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％アセトン水溶液で溶出して得られる抽出物
（１３）次の１）または２）のいずれかである前記（１０）または（１１）に記載のブドウ梗由来抽出物。
１）ブドウの梗を６０％アセトンで抽出して得られる抽出物
２）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物
（１４）ブドウの梗が、ヴィニフェラ種（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）のシャルドネ、ソービニオンブラン、リースリング、ケルナー、カベルネ・ソーヴィニヨン、カベルネ・フラン、メルローピノノアール、あるいはヤマブドウ、またはヴィニフェラ系交雑種の甲州、マスカット・ベリーＡ、ナイアガラ、キャンベルアーリー、マスカット・アレキサンドリア、巨峰、あるいはコンコードからなる群より選ばれるいずれか一種以上のブドウ由来である前記（１０）～（１３）のいずれかに記載のブドウ梗由来抽出物。
（１５）前記（１０）～（１４）のいずれかに記載のブドウ梗由来抽出物を有効成分として含む抗腫瘍剤。
（１６）腫瘍が前立腺癌である前記（１５）に記載の抗腫瘍剤。
（１７）前記（１０）～（１４）のいずれかに記載のブドウ梗由来抽出物を有効成分として含む腫瘍の転移抑制剤。
（１８）腫瘍が前立腺癌である前記（１７）に記載の腫瘍の転移抑制剤。
（１９）ブドウの梗を熱水、含水アルコール、含水アセトン、または親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒で抽出する工程を含む前記（１０）～（１４）のいずれかに記載のブドウ梗由来抽出物の製造方法。
（２０）ブドウの梗をそのまま、または凍結した後、熱水、含水アルコール、含水アセトン、または親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒で抽出して得られる前記（１９）に記載のブドウ梗由来抽出物の製造方法。
（２１）次の１）～１４）のいずれかに記載の工程を含む前記（１９）または（２０）に記載のブドウ梗由来抽出物の製造方法。
１）ブドウの梗を熱水抽出して得られる抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して抽出物を得る工程
２）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、酢酸エチル／メタノール溶液で溶出して抽出物を得る工程
３）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して抽出物を得る工程
４）前記２）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、酢酸エチル／メタノール溶液で溶出して抽出物を得る工程
５）前記３）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して抽出物を得る工程
６）前記５）の抽出物のうち水可溶物をＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、水で溶出して抽出物を得る工程
７）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、精製水で溶出して抽出物を得る工程
８）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、５０％エタノール水溶液で溶出して抽出物を得る工程
９）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、イソプロピルアルコールで溶出して抽出物を得る工程
１０）前記１）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、５０％アセトン水溶液で溶出して抽出物を得る工程
１１）前記１０）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、４０％メタノール水溶液で溶出して抽出物を得る工程
１２）前記１０）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％メタノール水溶液で溶出して抽出物を得る工程
１３）前記１）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％アセトン水溶液で溶出して抽出物を得る工程
１４）前記１３）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％アセトン水溶液で溶出して抽出物を得る工程
（２２）次の１）または２）のいずれかに記載の工程を含む前記（１９）または（２０）に記載のブドウ梗由来抽出物の製造方法。
１）ブドウの梗を６０％アセトンで抽出して抽出物を得る工程
２）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物
（２３）ブドウの梗が、ヴィニフェラ種（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）のシャルドネ、ソービニオンブラン、リースリング、ケルナー、カベルネ・ソーヴィニヨン、カベルネ・フラン、メルローピノノアール、あるいはヤマブドウ、またはヴィニフェラ系交雑種の甲州、マスカット・ベリーＡ、ナイアガラ、キャンベルアーリー、マスカット・アレキサンドリア、巨峰、あるいはコンコードからなる群より選ばれるいずれか一種以上のブドウ由来である前記（１９）～（２２）のいずれかに記載のブドウ梗由来抽出物の製造方法。
　本発明によって、ブドウ梗由来抽出物を抗腫瘍剤等の有効成分として活用することにより、ブドウ残渣の有用な利用方法を提供することが可能となる。本発明のブドウ梗由来抽出物は、前立腺癌に特に有用であることが確認されており、前立腺癌の予防や、前立腺肥大の改善等に幅広く利用することができる。
　さらに、本発明によって得られるブドウの梗を由来とする化合物も抗腫瘍剤や、腫瘍の転移抑制剤等として有効に利用することができる。
ブドウ梗由来抽出物（粗抽出濃縮物Ａ（以下、粗抽出物Ａと示す場合がある））添加によるＰＣ－３細胞の増殖への影響を示した図である（（Ａ）ＰＣ－３細胞の細胞数、（Ｂ）細胞増殖率）（実施例１）。 ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルへの影響を示した図である（（Ａ）濃度依存性、（Ｂ）経時変化）。縦軸Ｒ．Ｑ．は、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現量／１８ｓｒＲＮＡの発現量を示す。グラフの統計処理において平均値の有意差については一方向ｔ－検定による有意差の有無を検定した（実施例１）。 ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）添加によるＰＣ－３細胞の形態の変化を示した図である（実施例１）。 ブドウ梗由来抽出物（メタノール溶出物（以下、粗抽出物Ｂと示すことがある））添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルへの影響を示した図である。縦軸Ｒ．Ｑ．は、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現量／１８ｓｒＲＮＡの発現量を示す。グラフの統計処理において平均値の有意差については一方向ｔ－検定による有意差の有無を検定した（実施例１）。 （Ａ）ブドウ残渣（皮と種）由来抽出物添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルへの影響を示した図である（比較例１）。（Ｂ）ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルへの影響を示した図である（比較例１）。 比較化合物の構造式を示した図である（比較例２）。 比較化合物の構造式を示した図である（比較例２）。 ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）添加または比較化合物添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルへの影響を示した図である。グラフの統計処理において平均値の有意差については一方向ｔ－検定による有意差の有無を検定した（比較例２）。 ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）添加または比較化合物添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルへの影響を示した図である。グラフの統計処理において平均値の有意差については一方向ｔ－検定による有意差の有無を検定した（比較例２）。 ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ～Ｋ）の分離精製スキームを示した図である（実施例２）。 （Ａ）ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｊ）添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルへの影響を示した図である。グラフの統計処理において平均値の有意差については一方向ｔ－検定による有意差の有無を検定した（実施例２）。（Ｂ）実施例２、１．工程５で調製した（１）精製水溶出物、（２）５０％メタノール溶出物、（３）ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｊ）または（４）ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｋ）の添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルへの影響を示した図である（実施例２）。 実施例２、工程３－１で調製した（３）酢酸エチル／エタノール溶液溶出物および実施例２、工程３－２で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｇ）の添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５タンパク質の発現への影響を示した図である（実施例２）。 実施例２、工程３－１で調製した（３）酢酸エチル／エタノール溶液溶出物および実施例２、工程３－２で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｇ）の添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現への影響を示した図である。（Ａ）このうちウェスタンブロット法により検出したＦＡＢＰ５タンパク質のバンドをＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）のフリーソフト）により定量解析した図である。（Ｂ）ＦＡＢＰ５遺伝子の発現量をＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）のフリーソフト）により定量解析した図である（実施例２）。 ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｌ～Ｎ）の分離精製のスキームを示した図である（実施例３）。 ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｏ、Ｐ）の分離精製のスキームを示した図である（実施例４）。 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のチャートを示した図である（実施例７）。 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のチャートを示した図である（実施例７）。 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のチャートを示した図である（実施例７）。 ピークＡ由来成分のＬＣ／ＭＳ分析のチャートを示した図である（実施例７）。 ピークＡ由来成分のＬＣＭＳ／ＭＳ分析のチャートを示した図である（実施例７）。 ピークＢ由来成分のＬＣ／ＭＳ分析のチャートを示した図である（実施例７）。 ピークＢ由来成分のＬＣＭＳ／ＭＳ分析のチャートを示した図である（実施例７）。 ベリーＡの梗由来の抽出物、シャルドネの梗由来の抽出物、シャルドネの枝由来の抽出物、または化合物の添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現への影響を示した図である（実施例８）。 化合物、ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｓ）、または該粗抽出物Ｓを得る際に得られる溶出物の添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現への影響を示した図である（実施例９）。 化合物、ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｓ）、または該粗抽出物Ｓを得る際に得られる溶出物の添加によるＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現への影響を示した図である（実施例９）。
　本発明の「化合物」には、次の化合物が該当する。この化合物はブドウの梗等の天然物から分離精製される化合物であっても、合成された化合物であってもよい。
下記一般式（１）で示される化合物。
（Ａ）ｎ１－（Ｂ）ｎ２　　　・・・一般式（１）
（前記一般式（１）中、
ｎ１は６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０のいずれかを示し；
ｎ２は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０のいずれかを示し；
Ａは下記一般式（２）で示される基であり；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 前記一般式（２）中、
Ｒ１－１は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒを示し；
Ｒ１－２は同一又は異なっていてもよく、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒを示し；
Ｒ１－３は同一又は異なっていてもよく、－ＯＨ、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒ、－Ｇａｌｌａｔｅを示し；
Ｒ１－４は同一又は異なっていてもよく、－Ｃａｔｅｃｈｉｎ、－Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎを示し；
Ｒ１－５は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨを示し；
Ｂは下記一般式（３）で示される基であり；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 前記一般式（３）中、
Ｒ２は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒを示す。）
　一般式（２）および一般式（３）における－Ｏ－Ｇｌｕとはグルコースのことをいい、－Ｏ－Ｇａｌとはガラクトースのことをいう。
　また、一般式（２）および一般式（３）における－Ｏ－Ｓｕｇａｒの“Ｓｕｇａｒ”とは、グルコース、ガラクトース以外のフラクトース、ラムノース、アラビノース、マンノース、キシロース、ガラクチュロン酸、グルクロン酸等の単糖類、スクラロース、ラクトース、マルトース、イソマルトース、ゲンチオビオース、メリビオース、スクロース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等の二糖類、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオースの三糖類、アカルボース、スタキオース等の四糖類、グリコーゲン、デンプン、セルロース、デキストリン、グルカン等の多糖類等のことをいう。
　さらに、一般式（２）における－Ｇａｌｌａｔｅとはガレート基またはガレート残基のことをいい、－Ｃａｔｅｃｈｉｎ、－Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎとかカテキン基あるいはカテキン残基、またはエピカテキン基またはエピカテキン残基のことをいう。
　また、一般式（２）は、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンまたはエピカテキンからなる群より選ばれるいずれかであることが好ましく、ガロカテキンの塩あるいは誘導体、またはエピガロカテキンの塩あるいは誘導体、カテキンの塩あるいは誘導体、またはエピカテキンの塩あるいは誘導体であってもよい。
　このような本発明の化合物として、一般式（４）で示される化合物、一般式（５）で示される化合物等が挙げられる。さらに、一般式（６）で示される化合物、一般式（７）で示される化合物、一般式（８）で示される化合物、一般式（９）で示される化合物、一般式（１０）で示される化合物、一般式（１１）で示される化合物等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （前記一般式（４）中、
Ｒ３は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨを示し、少なくとも一つは－ＯＨを示す。）
　ここで、Ｒ３の少なくとも一つが－ＯＨであれば良いが、全てのＲ３が－ＯＨであってもよい。Ｒ３における－ＯＨは１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのいずれかであれば良い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （前記一般式（５）中、
Ｒ４は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨを示し、少なくとも一つは－ＯＨを示す。）
　ここで、Ｒ４の少なくとも一つが－ＯＨであれば良いが、全てのＲ４が－ＯＨであってもよい。Ｒ４における－ＯＨは１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０のいずれかであれば良い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　本発明の「抗腫瘍剤」とは、ヒト等において腫瘍が生じるのを予防し、また、生じた腫瘍の治療等にも利用できる剤のことをいい、腫瘍が生じた組織（原発巣）や転移した組織における腫瘍細胞の増殖を抑制する剤等も含まれる。
　また、本発明の「腫瘍の転移抑制剤」は、血行性転移、リンパ行性転移または播種性転移により、他の組織へ原発巣や既に腫瘍が転移した組織から他の組織に腫瘍が転移することを抑制する剤のことをいい、この「抗腫瘍剤」にも含まれる。
　このような本発明の「腫瘍の転移抑制剤」は、腫瘍の転移誘導遺伝子であるＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性を有する剤であることが好ましい。
　本発明の「抗腫瘍剤」または「腫瘍の転移抑制剤」は、本願発明の化合物を有効成分として含む剤であれば良い。このような本発明の「抗腫瘍剤」は、本発明の化合物のみからなる剤であっても良く、本発明の化合物に加えて、薬学的に許容される担体や薬剤の形成において必要となる成分等を含むものであっても良い。さらに、本発明の化合物に対して相乗的な効果を示す、抗腫瘍作用を有する他の有効な成分を配合したものであっても良い。
　また、本発明の「抗腫瘍剤」または「腫瘍の転移抑制剤」には、この「化合物を含むブドウ梗由来抽出物」や「ブドウ梗由来抽出物」であって、本発明の「化合物」を有効成分として含む剤と同様に抗腫瘍作用を示す剤も含まれる。
　これらの「抗腫瘍剤」や「腫瘍の転移抑制剤」は、この「化合物を含むブドウ梗由来抽出物」や「ブドウ梗由来抽出物」のみから剤であっても良く、これらのブドウ梗由来抽出物に加えて、薬学的に許容される担体や薬剤の形成において必要となる成分等を含むものであっても良い。さらに、本発明の化合物に対して相乗的な効果を示す、抗腫瘍作用を有する他の有効な成分を配合したものであっても良い。
　これらの本発明の「抗腫瘍剤」または「腫瘍の転移抑制剤」が予防、治療等の対象とする「腫瘍」は、本発明の「抗腫瘍剤」が有効に作用する「腫瘍」であれば従来知られているいずれのものであってもよい。特に前立腺癌、乳癌等を対象とすることが好ましい。
　なお、前記の本発明の「化合物を含むブドウの梗由来抽出物」とは、ブドウの梗を由来として抽出される抽出物であって、これらの化合物を含むもののこという。この「化合物を含むブドウの梗由来抽出物」には、本発明の化合物と同様の作用を示す「ブドウの梗由来抽出物」であって、本発明の化合物を含むと推定される「ブドウの梗由来抽出物」も含まれる。
　このような「化合物を含むブドウの梗由来抽出物」には、ブドウの梗を熱水、含水アルコール、含水アセトン、または親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒で抽出して得られるブドウ梗由来抽出物等が挙げられる。
　また、本発明における「ブドウ梗由来抽出物」とは、ブドウの梗を水、含水アルコール、含水アセトンまたは親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒等で抽出して得られる抽出物であればいずれのものであっても良く、これをさらに分離精製したものであってもよい。
　ここで、含水アルコールとして、水を含んでいるエタノール、メタノール等が挙げられ、親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒としては、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、ブタノール、または水等を混合した溶媒が挙げられる。
　抽出物を得るにあたり、原料とするブドウの梗は、どの種類のブドウの梗であってもよい。例えば、ヴィニフェラ種（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）のシャルドネ、ソービニオンブラン、リースリング、ケルナー、カベルネ・ソーヴィニヨン、カベルネ・フラン、メルロー、ピノノアール、あるいはヤマブドウ、またはヴィニフェラ系交雑種の甲州、マスカット・ベリーＡ、ナイアガラ、キャンベルアーリー、マスカット・アレキサンドリア、巨峰、コンコードからなる群より選ばれるいずれか一種以上のブドウ由来の梗等が挙げられる。
　本発明の「ブドウ梗由来抽出物」は、ブドウの梗を熱水、含水アルコール、含水アセトン、親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒等で抽出して得られる抽出物をさらに分離精製したものであってもよい。
　抽出にあたり使用するブドウの梗は、除梗破砕機（Ａ－８）（ＢＡＵＣＨ社製）等でブドウから除いたものそのもの、これを水洗したもの、または水洗後表面の水分を除去したもの等であればよく、これらをさらに乾燥させたもの等であってもよい。
　ブドウの梗の乾燥は、熱風乾燥、温風乾燥、冷風乾燥、天日干し、凍結乾燥、マイクロウェーブ乾燥または真空乾燥等の従来知られているいずれの方法で行っても良い。
　また、この「分離精製」には、「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」や「セルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマー」によって分画することも含まれ、これらの合成吸着剤やポリマーを組み合わせて複数回分画しても良い。
　「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としては、逆相シリカ、ポリスチレン系合成樹脂、アクリル系合成樹脂等が挙げられる。本発明で使用する「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」は市販の合成吸着剤であってもよく、例えば、逆相シリカとしてオクタデシル基で修飾したシリカゲル等が挙げられる。また、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎ（オルガノ社製）（以下、ＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎと示す場合がある）、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ（登録商標）－７ＨＰ（オルガノ社製）（以下、ＸＡＤ（登録商標）－７ＨＰと示す場合がある）またはアンバーライト（登録商標）ＸＡＤ（登録商標）－１１６０Ｎ（オルガノ社製）（以下、ＸＡＤ（登録商標）－１１６０Ｎと示す場合がある）、ダイヤイオンＨＰ－２０（三菱化学株式会社）等が挙げられる。
　本発明で使用する「セルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマー」も市販のものであってもよく、例えば、デキストランをベースとするＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）、ポリビニル系のＴＯＳＯＨ　ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　ＨＷ－４０Ｆ（東ソー株式会社）等が挙げられる。
　このように分離精製された「ブドウ梗由来抽出物」としては、例えば、次の１）～１４）に示されるものが挙げられる。
　１）ブドウの梗を熱水抽出して得られる抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物。
　このうち逆相シリカを「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としたものには、本願発明実施例１において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｂ）が挙げられ、ＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎを「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としたものには、本願発明実施例１において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｃ）等が挙げられる。
　２）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、酢酸エチル／メタノール溶液で溶出して得られる抽出物。
　このうちＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎを「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としたものには、本願発明実施例２において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｄ）等が挙げられる。
　３）前記２）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物。
　このうち、ＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎを「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としたものには、本願発明実施例２において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｅ）等が挙げられる。
　４）前記２）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、酢酸エチル／メタノール溶液で溶出して得られる抽出物。
　このうちＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎを「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としたものには、本願発明実施例２において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｆ）等が挙げられる。
　５）前記３）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物。
　このうちＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎを「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としたものには、本願発明実施例２において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｇ）等が挙げられる。
　６）前記５）の抽出物のうち水可溶物をＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、水で溶出して得られる抽出物。
　このうちＸＡＤ（登録商標）－７ＨＰを「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としたものには、本願発明実施例２において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｈ）等が挙げられる。
　７）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、精製水で溶出して得られる抽出物。
　このうちＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０を「セルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマー」としたものには、本願発明実施例２において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｉ）等が挙げられる。
　８）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、５０％エタノール水溶液で溶出して得られる抽出物。
　このうちＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０を「セルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマー」としたものには、本願発明実施例２において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｊ）等が挙げられる。
　９）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、イソプロピルアルコールで溶出して得られる抽出物。
　このうちＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０を「セルロース系、あるいはその誘導体また
は親水性化合物のポリマー」としたものには、本願発明実施例２において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｋ）等が挙げられる。
　１０）前記１）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、５０％アセトン水溶液で溶出して得られる抽出物。
　このうちＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０を「セルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマー」としたものには、本願発明実施例３において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｌ）等が挙げられる。
　１１）前記１０）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤セルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、４０％メタノール水溶液で溶出して得られる抽出物。
　このうちＸＡＤ（登録商標）－１１６０Ｎを「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としたものには、本願発明実施例３において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｍ）等が挙げられる。
　１２）前記１０）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％メタノール水溶液で溶出して得られる抽出物。
　このうちＸＡＤ（登録商標）－１１６０Ｎを「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としたものには、本願発明実施例３において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｎ）等が挙げられる。
　１３）前記１）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％アセトン水溶液で溶出して得られる抽出物。
　このうち、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０を「セルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマー」としたものには、本願発明実施例４において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｏ）等が挙げられる。
　１４）前記１３）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％アセトン水溶液で溶出して得られる抽出物。
　このうち、ＴＯＳＯＨ　ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　ＨＷ４０Ｆを「セルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマー」としたものには、本願発明実施例４において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｐ）等が挙げられる。
　また、このように分離精製された「ブドウ梗由来抽出物」としては、例えば、次の１）または２）に示されるものも挙げられる。
　１）ブドウの梗を６０％アセトンで抽出して得られる抽出物。このような抽出物としては、本願明細書実施例５において得たブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｑ）等が挙げられる。
　２）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物。
　このうち、ダイヤイオン（商標）ＨＰ－２０を「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としたものには、本願発明実施例５において得たブドウ梗由来抽出物（祖抽出物Ｒ）等が挙げられる。
　また、ＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎを「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」としたものには、本願発明実施例６において得たブドウ梗由来抽出物（祖抽出物Ｓ）等が挙げられる。
　これら１）または２）のブドウ梗由来抽出物は、６０％アセトンで抽出して得られる抽出物から、適当な有機溶媒、例えば酢酸エチル等によって分液することで脂溶性物質を留去して得られる抽出物であることがさらに好ましい。
　本発明の「ブドウ梗由来抽出物の製造方法」は、ブドウの梗を熱水、含水アルコール、含水アセトン、または親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒で抽出した抽出物を得る工程を含むものであれば良く、このように抽出した抽出物をさらに分離精製する工程を含んでいても良い。
　この分離精製する工程には、「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」や「セルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマー」によって分画する工程が挙げられ、これらの合成吸着剤やポリマーを組み合わせて複数回分画する工程を経るものであっても良い。
　ここで使用する「Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤」や「セルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマー」には、前記の市販のもの等も使用することできる。
　以下に実施例、比較例を示し、さらに本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。
１．ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ、粗抽出物Ｂ）の調製
１）除梗破砕機（Ａ－８）（ＢＡＵＣＨ社製）で分離されたブドウ（シャルドネ　Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ（Ｂｅａｕｎｏｉｓ，Ｍｏｒｉｌｌｏｎ））の梗を水で洗浄し、水切りした後、はさみで３センチ程度にカットした。カットした梗１ｋｇをステンレスの縦長バットに入れ、精製水を４Ｌ加え、上部をアルミホイルで覆い、水分が蒸発しないようにした。これをガスコンロで加熱し、９０℃以上に達した後、１時間沸騰を保ち熱水抽出を行った。
２）前記１）の熱水抽出終了後、大型ブフナーロートにて熱時ろ過（アドバンテックＮ０．２）した。得られた濾過液を熱水抽出物（粗抽出物Ａ）とし、室温まで冷却した。
３）前記２）の熱水抽出物の一部を固相抽出カートリッジ（Ｓｅｐ－Ｐａｋ　Ｐｌｕｓ　Ｃ１８　２０ｃｃ（Ｗａｔｅｒｓ））にて分画し、非吸着物画分、１００％酢酸エチル溶出物および１００％メタノール溶出物（粗抽出物Ｂ）をそれぞれ得た。
２．ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ－３細胞）の培養
　ヒト前立腺癌細胞として財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より入手したＰＣ－３細胞を、ＦＢＳ（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１０％、および、抗生物質を１％（１００Ｕ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０ｎｇ／ｍｌ　ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ　Ｂおよび１００μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎの混合液）添加したＲＰＭＩ培地（ＳＩＧＭＡ社製）により培養した。
３．細胞増殖抑制試験
　前記１．で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）による、ＰＣ－３細胞における細胞増殖抑制活性を調べた。
１）細胞増殖数
　前記２．１）で培養したＰＣ－３細胞を１２ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ（登録商標）ＭＵＬＴＩＤＩＳＨ）で各ｗｅｌｌが８割になるまで培養した。これに、前記１．で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を１％ｗ／ｖになるように添加した。培養開始６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後または７２時間後の細胞数を、血球計算版によって測定した。ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を添加せず、同時間培養したものをコントロールとした。
　その結果、図１（Ａ）に示されたように、コントロールでは経時的に細胞が増殖するのに対し、ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を添加したものはＰＣ－３細胞の増殖が抑制されることが確認できた。
２）細胞増殖率
　前記３．１）において、細胞の増殖数に差が出始めた培養開始２４時間後以降の細胞増殖能をＭＴＴ　ａｓｓａｙで確認した。
　即ち、前記２．１）で培養したＰＣ－３細胞を９６ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ（登録商標）ＭＵＬＴＩＤＩＳＨ）で各ｗｅｌｌが８割になるまで培養した。これに、前記１．で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を１％ｗ／ｖになるように添加した。培養開始から２４時間、３６時間、４８時間または７２時間経過した段階で、ＭＴＴ溶液を１０μｌずつ添加し、４時間呈色反応（３７．０℃、ＣＯ２　５％）を行った。その後、培地を除去し、細胞可溶化溶液を１００μｌ添加してピペッティングした後、マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍの吸光度値を測定した。
　その結果、図１（Ｂ）に示されたように、経時的に細胞の増殖が抑制され、培養開始後４８時間では、細胞増殖が約６割抑制されていることが確認できた。
４－１．ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験
　前記１．で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）による、ＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性（濃度依存性・時間依存性）を調べた。
１）濃度依存性
（１）試料の調製
　前記２．１）で培養したＰＣ－３細胞を１２ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ（登録商標）ＭＵＬＴＩＤＩＳＨ）で、各ｗｅｌｌが８割になるまで培養した。これに、前記１．で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０２ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加して３６時間培養した。その後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、ＲＮＡｚｏｌ（登録商標）　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　ＲＮ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ社製）を５００ｍｌ添加してピペッティングし、ＲＮＡを回収した。
　回収したＲＮＡに１００ｍｌクロロホルムを添加し混合して室温で２～３分置いた後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ　１５分　４℃）し、上清を回収した。この上清に同量のイソプロパノールを添加し転倒混和して室温で１０分置いた後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ　１０分　４℃）し、上清をデカンテーションした。
　これに７０％エタノールを添加してペレットを洗浄した後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ　５分　４℃）し、上清をデカンテーションし、室温でペレットを乾燥した後、ＤＥＰＣ水を２０μｌ添加して溶解したものを試料とした。
（２）ＲＴ－ＰＣＲ
　ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（登録商標）キット（ＴＯＹＯＢＯ社製）および２×ＧｏＴａｑ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によって、ＲＴ－ＰＣＲを行った。
　まず、前記（１）で調製した試料をＤＥＰＣ水で２５０ｎｇ／μｌに希釈した。この試料に試薬を加え、表１の組成としたものを、サーマルサイクラーで工程１～３で処理し（工程１．３０℃、１０分間、工程２．４２℃、６０分間、工程３．９５℃、５分間）、ｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
  
　合成したｃＤＮＡを鋳型とし、表２に示したＦＡＢＰ５遺伝子を増幅するプライマー（配列表配列番号１、２）、内因性コントロールとしてβ－ａｃｔｉｎ遺伝子を増幅するプライマー（配列表配列番号３、４）、または１８ｓ　ｒＲＮＡを増幅するプライマー（配列表配列番号５、６）をそれぞれプライマーとして表３の組成としたものを、サーマルサイクラーで工程１～３で処理し（工程１．９５℃、５分間、工程２．１）９５℃、３０秒間、２）５９℃、４０秒間、３）７２℃、１分間の１）～３）を２５サイクル、工程３．７２℃、５分間）、ＤＮＡを増幅した。
　増幅したＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色してＵＶ照射することにより、ＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現の有無および程度を調べた。
　その結果、図２（Ａ）に示したように、ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）の添加濃度依存的にＰＣ－３細胞においてＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルが低下することが確認できた。
　また、ＰＣ－３細胞の細胞形態への影響を観察したところ、図３に示したように、ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を添加した細胞はいずれもＰＣ－３細胞が示す角ばった形態から丸い形態に変化していることが確認できた。図３には一例として、２ｍｇ／ｍｌのブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を添加した場合の写真を示した。これは正常前立腺細胞モデルであるＲＷＰＥ－１の細胞形態と同様であった。
２）時間依存性
　前記２．１）で培養したＰＣ－３細胞を１２ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ（登録商標）ＭＵＬＴＩＤＩＳＨ）へ分注し、各ｗｅｌｌが８割になるまで培養した。これに、前記１．で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加して６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間または７２時間培養した。
　培養後、前記１）濃度依存性の試験と同様にＰＣ－３細胞からＲＮＡを回収し、ＲＴ－ＰＣＲを行い、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現の有無および程度を調べた。
　その結果、図２（Ｂ）に示したように、ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を添加した後、時間依存的にＰＣ－３細胞においてＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルが低下することが示され、特に３６時間後および７２時間後に、顕著にＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルが低下することが確認できた。
４－２．ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験
　前記１．で調製した非吸着物画分、１００％酢酸エチル溶出物および１００％メタノール溶出物（粗抽出物Ｂ）について、前記４－１．と同様にＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性を調べた。
　即ち、前記２．１）で培養したＰＣ－３細胞を１２ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ（登録商標）ＭＵＬＴＩＤＩＳＨ）で各ｗｅｌｌが８割になるまで培養した。これに、前記１．で調製した非吸着物画分、１００％酢酸エチル溶出物または１００％メタノール溶出物（粗抽出物Ｂ）を１％ｗ／ｖになるようにそれぞれ添加して、７２時間培養した。
　その後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、ＲＮＡｚｏｌ（登録商標）　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　ＲＮ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ社製）を５００ｍｌ添加してピペッティングし、回収したＲＮＡについて前記４－１．と同様にＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性を調べた。
　その結果、図４に示したように、非吸着画分と１００％酢酸エチル溶出物の画分を添加したＰＣ－３細胞においては、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルに大きな変化はなかった。しかし、メタノール溶出物（粗抽出物Ｂ）を添加したＰＣ－３細胞においては、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルの低下が確認できた。
［比較例１］
１．ブドウ残渣（皮と種）由来抽出物の調製
１）除梗破砕機（Ａ－８）（ＢＡＵＣＨ社製）で分離されたブドウ（シャルドネ　Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ（Ｂｅａｕｎｏｉｓ，Ｍｏｒｉｌｌｏｎ））の残渣（皮と種）を水で洗浄した。この残渣１ｋｇをステンレスのバットに入れ、精製水を４Ｌ加えた。上部開口部をアルミホイルで覆い、これをガスコンロで加熱し、９０℃以上に達した後、１時間沸騰を保ち熱水抽出を行った。
２）前記１）の熱水抽出終了後、大型ブフナーロートにて熱時ろ過（アドバンテックＮ０．２）した。得られた濾過液をブドウ残渣（皮と種）由来抽出物とし、室温まで冷却した。
２．ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験
　前記１．で調製したブドウ残渣（皮と種）由来抽出物と、前記実施例１、１．と同様の方法で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）について、前記実施例１、２．と同様の方法で培養したＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性（濃度依存性）を調べた。
　この試験では、ブドウ残渣（皮と種）由来抽出物が０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、または１．５ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにそれぞれＰＣ－３細胞の培地に添加した。また、ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）が０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．１２ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌとなるように、それぞれＰＣ－３細胞の培地に添加した。これらを３６時間培養した後、記実施例１、４－１．と同様の方法で、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現の有無および程度を調べた。
　その結果、図５に示したように、ブドウ残渣（皮と種）由来抽出物を添加した場合には、１．５ｍｇ／ｍｌという高濃度を添加した場合にも、ＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルがあまり低下しないことが確認できた（図５、ｓａｍｐｌｅＡ）。
　一方、ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を添加した場合には、０．１２ｍｇ／ｍｌという低濃度を添加した場合でも、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルが低下することが確認できた。さらにこのブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）の添加濃度依存的にＰＣ－３細胞においてＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルが低下することも確認できた（図５、ｓａｍｐｌｅＢ）。
　従って、この結果より、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現を抑制する効果は、ブドウの種や皮を由来とする抽出物は有さず、ブドウの梗を由来とする抽出物が特異的に有するものであることが確認できた。
［比較例２］
１．比較化合物の調製
　表４に示した各比較化合物について、比較化合物の濃度がいずれも１０ｍＭとなるように、表４に示した溶媒に溶解した。なお、各比較化合物の構造式は図６、図７に示した。
　ＥＧＣＧ（長良サイエンス株式会社製）以外の比較化合物については、次のように合成した物を使用した。即ち、１，３，５－ｔｒｉｈｙｄｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅを出発原料にしてガロカテキン骨格を形成し、カテキンあるいはエピカテキンのモノマーのフェノール性水酸基をＢｅｎｚｙｌ基で保護、Ｃ環２級アルコールをＡｃｅｔｙｌ基で保護した後、もう一分子の未保護のカテキンを種々のルイス酸にて縮合した。次いで、脱保護を順次行い、それぞれの化合物を得た。
　このうち、３量体はカテキン２分子とエピカテキン１分子が結合した物であり、４量体（Ａ）はカテキン４分子が結合したものであり、４量体（Ｂ）はエピカテキン４分子が結合したものであり、５量体はカテキン５分子が結合したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
  
２．ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験
　前記１．で調製した各比較化合物と、前記実施例１、１．と同様の方法で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）について、ＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性（濃度依存性）を調べた。
１）試料の調製
　この試験では、各比較化合物とブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）をそれぞれ次の濃度となるようにＰＣ－３細胞の培地に添加して７２時間培養した。その後、前記実施例１、４－１．１）（１）と同様の方法で、ＰＣ－３細胞から抽出したＲＮＡをそれぞれ試料とした。
＜濃度＞
ＥＣＧＣ：１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ
ＰＤＢ３：１０μＭ、２５μＭ
ＰｒｏＢ１、ＰｒｏＢ２、ＰｒｏＢ３、ＰｒｏＢ４、ＰｒｏＣ１、ＰｒｏＣ２、３量体、４量体（Ａ）、４量体（Ｂ）、５量体：５０μＭ、１００μＭ
粗抽出物Ａ：３００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ
２）ＲＴ－ＰＣＲ
　ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（登録商標）キット（ＴＯＹＯＢＯ社製）および２×ＧｏＴａｑ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により、ＲＴ－ＰＣＲを行った。
　まず、前記１）で調製した各試料をＤＥＰＣ水で２５０ｎｇ／μｌに希釈した。この試料を試薬とともに表５の組成としたものを、サーマルサイクラーで工程１～３で処理し（工程１．３０℃、１０分間、工程２．４２℃、６０分間、工程３．９５℃、５分間）、ｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
  
　合成したｃＤＮＡを鋳型とし、表６に示したＦＡＢＰ５遺伝子を増幅するプライマー（配列表配列番号７、８）または、内因性コントロールとして１８ｓ　ｒＲＮＡを増幅するプライマー（配列表配列番号９、１０）をそれぞれプライマーとして表７の組成としたものを調製した。
　これをＳｔｅｐＯｎｅ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にセットし、ΔΔＣＴ法により定量解析を行い、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現の有無および程度を調べた。
　ＳｔｅｐＯｎｅ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）におけるＤＮＡ増幅は、次の工程１～３により行った。
　工程１．９０℃、５分間、工程２．１）９５℃、３０秒間、２）５９℃、４０秒間、３）７２℃、１分間の１）～３）を２５サイクル、工程３．７２℃、５分間
　その結果、図８、図９に示したように、各比較化合物を添加したＰＣ－３細胞はいずれもＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルが低下しなかった。一方、ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を添加したＰＣ－３細胞はＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルが低下していた。したがって、本発明のブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）のみがＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルを低下させる効果を有することが確認できた。
　なお、図には示していないが、ＰｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＣ２（ＰＤＣ２）もＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルは低下しなかった。図８、図９の縦軸Ｒ．Ｑ．は、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現量／１８ｓｒＲＮＡの発現量を示す。
　また、実施例２、３．に記載の方法と同様に、ＦＡＢＰ５タンパク質の発現量を調べたところ、ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を添加したＰＣ－３細胞においてＦＡＢＰ５タンパク質の発現が抑制されることも確認できた。
１．ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｃ～Ｋ）の分離精製
　実施例１、１．と同様の方法により、ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）を得て、これを次の工程１～５により分離精製した。分離精製のスキームは図１０に示した。
工程１：
　ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）をそのまま１．５ＬのＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎに吸着させた。このＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎは、あらかじめ、洗浄し、オープンガラスカラム（φ６ｃｍ×５５ｃｍ）に入れ、精製水で十分置換した物であった。
　（１）精製水、（２）１００％酢酸エチルまたは（３）１００％メタノール（各３Ｌ）を溶出溶媒として順次溶出させ、それぞれの溶出液をエバポレーターで、４２℃で減圧下濃縮することで、（１）精製水溶出物　９７．３ｇ、（２）１００％酢酸エチル溶出物　３．６ｇおよび（３）１００％メタノール溶出物（以下、粗抽出物Ｃと示すことがある）　３．１ｇを得た。
工程２：
　前記工程１で得たメタノール溶出物（粗抽出物Ｃ）１１．２ｇを精製水１００ｍｌに混濁した。これをさらに１．５ＬのＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎに吸着させた。
　（１）精製水、（２）１００％酢酸エチル、（３）酢酸エチルとメタノールを容積比９：１で混合した溶液（以下、酢酸エチル／メタノール溶液と示す場合がある）または（４）１００％メタノール（各３Ｌ）を溶出溶媒として順次溶出させ、それぞれ溶出液をエバポレーターで、４２℃で減圧下濃縮することで、（１）精製水溶出物　１ｇ、（２）１００％酢酸エチル溶出物　１．４ｇ、（３）酢酸エチル／メタノール溶液溶出物（以下、粗抽出物Ｄと示すことがある）　１．８ｇまたは（４）１００％メタノール溶出物（以下、粗抽出物Ｅと示すことがある）　６ｇを得た。
工程３－１：
　前記工程２で得た酢酸エチル／メタノール溶液溶出物（粗抽出物Ｄ）４ｇを精製水５０ｍｌに混濁した。これをさらに１．５ＬのＸＡＤ（登録商標）－１１８０に吸着させた。
　（１）酢酸エチルとアセトンを容積比９：１で混合した溶液（以下、酢酸エチル／アセトン溶液と示す場合がある）、（２）酢酸エチルとエタノールを容積比９：１で混合した溶液（以下、酢酸エチル／エタノール溶液と示す場合がある）、（３）酢酸エチルとメタノールを容積比９：１で混合した溶液（以下、酢酸エチル／メタノール溶液（以下、粗抽出物Ｆと示すことがある）、または（４）１００％メタノール（各３Ｌ）を溶出溶媒として順次溶出させ、それぞれの溶出液をエバポレーターで、４２℃で減圧下濃縮することで、（１）酢酸エチル／アセトン溶液溶出物　８００ｍｇ、（２）酢酸エチル／エタノール溶液溶出物　１．６ｇ、（３）酢酸エチル／メタノール溶液溶出物　８００ｍｇまたは（４）メタノール溶出物　２００ｍｇを得た。
工程３－２：
　前記工程２で得たメタノール溶出物（粗抽出物Ｅ）６ｇを精製水１００ｍｌに混濁した。これをさらに１．５ＬのＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎに吸着させた。
　（１）精製水、（２）１００％酢酸エチル、（３）酢酸エチル／アセトン溶液、（４）酢酸エチル／エタノール溶液、（５）酢酸エチル／メタノール溶液または（６）１００％メタノール（各３Ｌ）を溶出溶媒として順次溶出させ、それぞれの溶出液をエバポレーターで、４２℃で減圧下濃縮することで、（１）精製水溶出物　０ｇ（２）酢酸エチル溶出物　２ｇ、（３）酢酸エチル／アセトン溶液溶出物　６００ｍｇ、（４）酢酸エチル／エタノール溶液溶出物　１．２ｇ、（５）酢酸エチル／メタノール溶液溶出物　２００ｍｇ、または（６）メタノール溶出物（以下、粗抽出物Ｇと示すことがある）　１．６ｇを得た。
工程４：
　前記工程３－２で得たメタノール溶出物（粗抽出物Ｇ）６ｇに精製水を加え溶解させた。溶解しなかった物を桐山ロート（ろ紙Ｎ０．６）で濾過し、精製水で洗浄し水不溶部として得た。
　また、得られた溶液は４０℃以下でエバポレーターにて減圧濃縮し、水可溶部として得た。この水可溶部４．４ｇを５００ｍｌのＸＡＤ（登録商標）－７ＨＰに吸着させた。このＸＡＤ（登録商標）－７ＨＰは、あらかじめ、洗浄し、オープンガラスカラム（φ６ｃｍ×５５ｃｍ）に入れ、精製水で十分置換した物であった。
　（１）精製水　２Ｌ、（２）１０％エタノール水溶液　１Ｌ、（３）２０％エタノール水溶液　１Ｌ、（４）３０％エタノール水溶液　１Ｌ、（５）５０％エタノール水溶液　１Ｌまたは（６）１００％メタノール　１．５Ｌを溶出溶媒として順次溶出させ、それぞれの溶出液をエバポレーターで、減圧下４２℃で濃縮することで、（１）精製水溶出物（以下、粗抽出物Ｈと示すことがある）　１ｇ、（２）１０％エタノール溶出物　２０ｍｇ、（３）２０％エタノール溶出物　１０ｍｇ、（４）３０％エタノール溶出物　１０ｍｇ、（５）５０％エタノール溶出物　８００ｍｇまたは（６）１００％メタノール溶出物　１０ｍｇを得た。
工程５：
　前記工程４で得た精製水溶出物（粗抽出物Ｈ）５００ｍｇを精製水３．５ｍｌに溶解した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０　２５ｇを精製水で十分湿潤させ、ガラスカラムに充填したものにこれをベットした。
　（１）精製水　３００ｍｌ、（２）５０％メタノール水溶液　３００ｍｌ、（３）５０％エタノール水溶液　１５０ｍｌ、（４）１００％イソプロピルアルコール　１５０ｍｌを溶出溶媒として順次溶出させ、それぞれの溶出液をエバポレーターで、４２℃で減圧下濃縮することで、（１）精製水溶出物（以下、粗抽出物Ｉと示すことがある）　１８７ｍｇ、（２）５０％メタノール溶出物　５０ｍｇ、（３）５０％エタノール溶出物（以下、粗抽出物Ｊと示すことがある）　８５ｍｇまたは（４）イソプロピルアルコール溶出物（以下、粗抽出物Ｋと示すことがある）　７１ｍｇを得た。
２－１．ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験
　前記１．で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｊ）について、実施例１、４－１．と同様の方法でＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性（時間依存性）を調べた。ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｊ）は、ＰＢＳで濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調製したものを試料として０．０３ｍｌ添加して培養し、培養開始６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後または７２時間後のＦＡＢＰ５遺伝子発現を調べた。
　その結果、図１１（Ａ）に示されたように、培養開始６時間後からＦＡＢＰ５遺伝子の発現量が約３０％抑制されはじめ、培養開始７２時間後には約５０％までＦＡＢＰ５遺伝子の発現量が抑制された。ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｊ）の添加によってＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現量が時間依存的に抑制されることが確認できた。
２－２．ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験
　前記１．工程５で調製した（１）精製水溶出物（粗抽出物Ｉ）、（２）５０％メタノール溶出物、（３）ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｊ）または（４）ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｋ）について、前記２－１．と同様の方法でＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性（時間依存性）を調べた。
　（１）精製水溶出物（粗抽出物Ｉ）、（２）５０％メタノール溶出物、（３）ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｊ）または（４）ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｋ）は、いずれもＰＢＳで濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調製したものを試料として０．０３ｍｌ添加して培養し、培養開始４８時間後のＦＡＢＰ５遺伝子発現を調べた。
　その結果、図１１（Ｂ）に示されたように、（２）５０％メタノール溶出物を除く全ての試料においてＦＡＢＰ５遺伝子の発現が５０％以上抑制され、特に（３）ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｊ）または（４）ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｋ）はコントロールに比べてＦＡＢＰ５遺伝子の発現量が８０％程度と顕著に抑制された。
３．ＦＡＢＰ５タンパク質発現抑制試験
　前記１．工程３－１で調製した（３）酢酸エチル／メタノール溶液溶出物（粗抽出物Ｆ）および前記１．工程３－２で調製した（６）メタノール溶出物（粗抽出物Ｇ）について、ＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５タンパク質への影響を調べた。（３）酢酸エチル／メタノール溶液溶出物または（６）メタノール溶出物（粗抽出物Ｇ）はＰＢＳで濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調製したものをそれぞれ試料とした。
１）泳動試料の作製
　前記実施例１と同様の方法で、前記試料を０．０３ｍｌ添加してＰＣ－３細胞を４８時間培養した後、培地を除去し、ＰＢＳで二回洗浄した。これにｃｏｌｄ　ＰＢＳ（－）を加え、ｃｅｌｌ　ｓｃｒａｐｅｒではがしたＰＣ－３細胞を５０ｍｌｔｕｂｅに回収した。これを遠心分離（ｒｏｏｍ　ｔｅｍｐ、２０００ｒｐｍ、１．５ｍｉｎ）し、上清を捨て、さらにｃｏｌｄ　ＰＢＳ（－）　１．２ｍｌ程度を加えて懸濁し、１．５ｍｌ　ｔｕｂｅに移した。これをさらに遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）し、ＰＢＳ（－）を完全に除いた後、Ｂ　ｂｕｆｆｅｒ（組成：１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２ｍｌ、５Ｍ　ＮａＣｌ　１．２ｍｌ、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　８０μｌ、１０％　ＮＰ－４０　４ｍｌ、プロテアーゼ阻害剤（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ製）　４００μｌを精製水で４０ｍｌとした）２００μｌ、プロテアーゼ阻害剤（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ製）２μｌを加えてボルテックスし、１５分間氷上に置いた。これを遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、上清を回収してライセートとした。
　このライセートのタンパク質濃度をＱｕｉｃｋ　ｓｔａｒｔプロテインアッセイ法により測定し、タンパク質濃度が一番低かった試料に濃度を合わせて泳動用試料を作製した。泳動用試料のタンパク質濃度は、１．８ｍｇ／ｍｌであった。
２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　次の（１）～（３）の工程により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。
（１）前記１）で調製した泳動用試料２０μｌと５×Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒを混合した後、ｂｌｏｃｋ　ｉｎｃｕｂａｔｏｒで９０℃、５ｍｉｎ加熱処理した。
（２）ゲルを泳動槽にセットし、加熱処理したＳａｍｐｌｅを２５μｌずつ、マーカー（ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ　ｍａｒｋｅｒ）を２μｌずつ各ｗｅｌｌの中に入れた。
（３）泳動ははじめ６０～７０Ｖで行い、ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　ｇｅｌ以降は１００～１５０Ｖで１．５～２時間行った。
３）ウェスタンブロット
　前記２）でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行って分離したタンパク質をセミドライ法によりニトロセルロース膜にブロッティングし、このニトロセルロース膜に、目的のタンパク質特異的に結合する抗体を反応させて、ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅによりＦＡＢＰ５タンパク質を検出した。
　即ち、次の（１）～（７）の工程により、ウェスタンブロットを行った。
（１）ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行って分離したタンパク質をセミドライ法によりニトロセルロース膜にブロッティングした（１４０ｍＡ、４０ｍｉｎ）。
（２）前記（１）のニトロセルロース膜をＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（組成：１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）　２．５ｍｌ、５Ｎ　ＮａＣｌ　１．５ｍｌ、Ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋ　２．５ｇを精製水で５０ｍｌにした）に入れて、１時間以上、ｒｏｏｍ　ｔｅｍｐで振とうすることによりブロッキングした。
（３）前記（２）のニトロセルロース膜に一次抗体反応液（組成：１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）　２５０μｌ、５Ｎ　ＮａＣｌ　１５０μｌ、１０％　Ｔｗｅｅｎ２０　２５μｌ、Ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋ　０．２５ｇ、一次抗体（抗ＦＡＢＰ５抗体）　１０μｌ（１／１００）、抗β－ａｃｔｉｎ抗体（抗ヒトβ－ａｃｔｉｎ抗体＃４９６７、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社　０．５μｌ（１／１０００）を精製水で５ｍｌにした）を加え、ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔ、４℃で抗原抗体反応を行った。
（４）前記（３）のニトロセルロース膜を洗浄液（組成：１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ　７．５）　２５０μｌ、５Ｎ　ＮａＣｌ　１５０μｌ、１０％　Ｔｗｅｅｎ２０　２５μｌを精製水で５０ｍｌにした）で１５ｍｉｎ、３回洗浄した。
（５）前記（４）のニトロセルロース膜に二次抗体反応液（組成：１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）　２５０μｌ、５Ｎ　ＮａＣｌ　１５０μｌ、１０％　Ｔｗｅｅｎ２０　２５μｌ、Ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋ　０．２５ｇ、二次抗体（Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　．ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社製）５μｌを精製水で５ｍｌにした）を加え、１ｈ以上、ｒｏｏｍ　ｔｅｍｐで振とうし、抗原抗体反応を行った。
（６）前記（５）のニトロセルロース膜を前記（４）と同様に洗浄した。
（７）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ１　Ｐｅｒｏｘｉｄｅ　ＳｏｌｕｔｉｏｎおよびＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ２　Ｌｕｍｉｎｏｌ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（いずれもＰｉｅｒｃｅ（登録商標）　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製））の混合液を前記（６）のニトロセルロース膜にかけ、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅによりタンパク質を検出した。
　前記３．３）ウェスタンブロット（３）の工程において使用した一次抗体（抗ＦＡＢＰ５抗体）は、下記参考文献に基づき本発明者らが作製したものである。
　即ち、ヒトＦＡＢＰ５のＮ末端側１３残基からなる、配列表配列番号１１に示される合成ペプチドをキャリアータンパク質と結合させてウサギに免疫し、８週間後に血清を採取して抗ＦＡＢＰ５抗体を得た。
参考文献：Ｒ．　Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｈ．　Ｆｕｊｉｉ，　Ａ．　Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ｔ．　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｋ．　Ｋａｍｅｄａ，　Ｍ．　Ｉｔｏ　ａｎｄ　Ｔ．　Ｏｎｏ，Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｋｉｎ．　Ｊ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．　Ｓｃｉ．　１６：　１７－２２，　１９９７
　その結果、図１２に示されたように、工程３－１で調製した（３）酢酸エチル／メタノール溶液溶出物（粗抽出物Ｆ）および前記１．工程３－２で調製したブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｇ）の添加によってＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５タンパク質の発現が顕著に抑制されることが確認できた。
４．ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験
　前記３．と同様に、前記１．工程３－１で調製した（３）酢酸エチル／メタノール溶液溶出物（粗抽出物Ｆ）および前記１．工程３－２で調製した（６）メタノール溶出物（粗抽出物Ｇ）を添加して、４８時間培養したＰＣ－３細胞から、前記実施例１と同様の方法で、ｍＲＮＡを回収し、ＲＴ－ＰＣＲによって、ＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子発現への影響を調べた。
　その結果、工程３－１で調製した（３）酢酸エチル／メタノール溶液溶出物（粗抽出物Ｆ）および前記１．工程３－２で調製した（６）メタノール溶出物（粗抽出物Ｇ）によって、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現が抑制されていることが確認できた。
　前記３．でウェスタンブロット法により検出したＦＡＢＰ５タンパク質のバンドをＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）のフリーソフト）により定量解析するとともに（図１３（Ａ））、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現量も定量解析したところ（図１３（Ｂ））、ｍＲＮＡとタンパク質レベルでいずも発現抑制量はほぼ同等であった。
　また、前記２－１等と同様の方法によって確認したところ、前記工程１で分離精製されたブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｃ）、前記工程２で分離精製されたブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｄ、粗抽出物Ｅ）、前記工程４で分離精製されたブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｈ）の添加によっても、ＰＣ－３細胞において、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現が抑制されることが確認できた。
ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｌ～Ｎ）の分離精製
　実施例２、１．工程１と同様に、ブドウの梗の熱水抽出物（粗抽出物Ａ）をＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎに吸着させ、メタノールで溶出したメタノール溶出物（粗抽出物Ｃ）を次の工程１および２により、分離精製した。ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｌ～Ｎ）の分離精製のスキームは図１４に示した。
工程１：
　メタノール溶出物（粗抽出物Ｃ）１．２７ｇを精製水３ｍｌに溶解した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０　２５ｇを精製水で十分湿潤させ、ガラスカラムに充填したものにこれをベットした。
　（１）精製水　２００ｍｌ、（２）５０％エタノール水溶液　３００ｍｌ、（３）５０％イソプロピルアルコール水溶液２００ｍｌ、（４）３０％アセトン水溶液１００ｍｌ、（５）４０％アセトン水溶液　７００ｍｌ、（６）５０％アセトン水溶液　５５０ｍｌまたは（７）６０％アセトン水溶液　２００ｍｌを溶出溶媒として順次溶出させ、それぞれ溶出液をエバポレーターで、４２℃で減圧下濃縮することで、（１）精製水溶出物　４１８ｍｇ、（２）５０％エタノール溶出物　７２ｍｇ（３）５０％イソプロピルアルコール溶出物　０ｇ、（４）３０％アセトン溶出物　０ｇ、（５）４０％アセトン溶出物　４６ｍｇ、（６）５０％アセトン溶出物（以下、粗抽出物Ｌと示すことがある）　５５７ｍｇ、（７）６０％アセトン溶出物　１９ｍｇを得た。
工程２：
　前記工程１で得た５０％アセトン溶出物（粗抽出物Ｌ）２２３ｍｇを精製水１ｍｌに溶解した。ＸＡＤ（登録商標）－１６００Ｎに吸着させた。このＸＡＤ（登録商標）－１６００Ｎは、あらかじめ、洗浄し、オープンガラスカラム（φ３×３０センチ）に８０ｍｌ入れ、精製水で十分置換した物であった。
　（１）精製水　３００ｍｌ、（２）２０％メタノール　２００ｍｌ、（３）４０％メタノール　３００ｍｌ、（４）６０％メタノール　３００ｍｌ、（５）１００％メタノール　２００ｍｌを溶出溶媒として順次溶出させ、それぞれ溶出液をエバポレーターにて４２℃で減圧下濃縮することで、（１）精製水溶出物　３ｍｇ、（２）２０％メタノール溶出物　１ｍｇ、（３）４０％メタノール溶出物（以下、粗抽出物Ｍと示すことがある）　１０８ｍｇ、（４）６０％メタノール溶出物（以下、粗抽出物Ｎと示すことがある）　１０７ｍｇ、（５）１００％メタノール溶出物　４ｍｇを得た。
　ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｌ、Ｍ、Ｎ）について、実施例１、４－１．等と同様の方法でＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現への影響を確認したところ、いずれもＦＡＢＰ５遺伝子の発現を抑制することが確認できた。
ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｏ、Ｐ）の分離精製
　実施例２、１．工程１と同様に、ブドウの梗の熱水抽出物（粗抽出物Ａ）をＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎに吸着させ、メタノールで溶出したメタノール溶出物（粗抽出物Ｃ）を次の工程１および２により、分離精製した。ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｏ、Ｐ）の分離精製のスキームは図１５（実施例４）に示した。
工程１：
　メタノール溶出物（粗抽出物Ｃ）１ｇを３０％メタノール４ｍｌに溶解し、３０％メタノールで湿潤、置換したＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ－２０（１００ｍｌ）にベットした。
　（１）３０％メタノール水溶液　３００ｍｌ、（２）４０％エタノール水溶液　３００ｍｌ、（３）３０％アセトン水溶液　１００ｍｌ、（４）４０％アセトン水溶液　５００ｍｌまたは（５）６０％アセトン水溶液　４００ｍｌを溶出溶媒として順次溶出させ、それぞれ溶出液をエバポレーターで、４０℃以下で減圧下濃縮することで、（１）３０％メタノール溶出物　４６ｍｇ、（２）４０％エタノール溶出物　１６２ｍｇ、（３）３０％アセトン溶出物　２０ｍｇ、（４）４０％アセトン溶出物　３１１ｍｇ、（５）６０％アセトン溶出物（以下、粗抽出物Ｏと示すことがある）　３４５ｍｇを得た。
工程２：
　前記工程１で得た粗抽出物Ｏ３４５ｍｇを、３０％メタノール水溶液（２ｍｌ）に溶解した。これを、３０％メタノール水溶液で湿潤させたＴＯＳＯＨ　ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　ＨＷ４０Ｆ（６３ｍｌ）にベットした。
　溶出溶媒として、（１）３０％メタノール水溶液　８０ｍｌ、（２）４０％エタノール水溶液　１００ｍｌ、（３）６０％アセトン水溶液　２００ｍｌにて順次溶出させ、それぞれ溶出液をエバポレーターにて４０℃以下で減圧下濃縮することで、（１）３０％メタノール溶出物　１１７ｍｇ、（２）４０％エタノール溶出物　７ｍｇ、（３）３０％アセトン溶出物（以下、粗抽出物Ｐと示すことがある）　２３６ｍｇを得た。
　ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｏ、Ｐ）について、比較例２、２．と同様の方法でＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現への影響を確認したところ、いずれもＦＡＢＰ５遺伝子の発現が強く抑制されることが確認できた。
ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｑ、Ｒ）の分離精製
１．ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｑ）の調製
　除梗破砕機（Ａ－８）（ＢＡＵＣＨ社製）で分離されたブドウ（シャルドネ　Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ（Ｂｅａｕｎｏｉｓ，Ｍｏｒｉｌｌｏｎ））の梗６５．２ｇを水で洗浄し、水切りした後、はさみで５ｍｍ～１０ｍｍ程度にカットした。カットした梗を６０％アセトン溶液４００ｍｌに浸漬した。これを室温にて１週間静置した後、ろ紙（アドバンテックＮ０．２）にてろ過した。得られた、ろ液を減圧濃縮し、アセトンを留去した。
　その後、油溶性物質を除去するため、酢酸エチル１００ｍｌで分液洗浄し、水層を濃縮し、ブドウ梗由来抽出物（以下、粗抽出物Ｑと示すことがある）４．５５ｇを得た。
２．ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｒ）の調製
　除梗破砕機（Ａ－８）（ＢＡＵＣＨ社製）で分離されたブドウ（シャルドネ　Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ（Ｂｅａｕｎｏｉｓ，Ｍｏｒｉｌｌｏｎ））の梗１０．５ｇを水で洗浄し、水切りした後、はさみで１０ｍｍ～２０ｍｍ程度にカットした。カットした梗を６０％アセトン溶液２００ｍｌに浸漬した。これを室温にて３日間静置した後、ろ紙（アドバンテックＮ０．２）にてろ過した。得られたろ液を減圧濃縮し、アセトンを留去し溶液を得た。
　この溶液を、あらかじめ洗浄したダイヤイオン（商標）ＨＰ－２０（三菱化学株式会社）１００ｍｌに吸着させ、精製水３００ｍｌで非吸着物を留去した。その後、溶出溶媒として（１）１００％酢酸エチル　３００ｍｌ、（２）１００％メタノール　３００ｍｌにて順次溶出させ、それぞれ溶出液をエバポレーターにて４０℃以下で減圧下濃縮することで、（１）１００％酢酸エチル溶出物　７８ｍｇ、（２）１００％メタノール溶出物（以下、粗抽出物Ｒと示すことがある）　１３５ｍｇを得た。
　ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｑ、Ｒ）について、比較例２、２．と同様の方法でＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現への影響を確認したところ、いずれもＦＡＢＰ５遺伝子の発現を抑制することが確認できた。
ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｓ）の分離精製
１．除梗破砕機（Ａ－８）（ＢＡＵＣＨ社製）で分離されたブドウ（シャルドネ　Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ（Ｂｅａｕｎｏｉｓ，Ｍｏｒｉｌｌｏｎ））の梗５２．８ｇを水で洗浄し、水切りした後、液体窒素を入れた乳鉢で凍結させてすりつぶし、粉砕した。
２．前記１．の粉砕した梗を６０％アセトン溶液５００ｍｌに浸漬した。これを２５℃（常温）にて２時間静置した後、ろ紙（アドバンテックＮ０．２）にてろ過した後、ろ過残渣に対し６０％アセトン溶液５００ｍｌを加えて、更に同様の操作を行なった。ろ過によって得られたろ過液をエバポレーターにて４０℃以下で濃縮乾固し、アセトン抽出物（図２４、２５：＃１）を４．２ｇ得た。
　ろ過により得られた残渣は、精製水１００ｍｌを加えて加熱し、一時間沸騰を保ち熱水抽出を行った。熱水抽出終了後、大型ブフナーロートにて熱時ろ過（アドバンテックＮ０．２）し、得られたろ過液を４０℃以下で濃縮乾固し、熱水抽出物（図２４、２５：＃２）を５７６ｍｇ得た。
３．前記２．のアセトン抽出物を精製水１００ｍｌに溶解した。この内７５ｍｌをとり、１００％酢酸エチルを加えて分液した。このうち、酢酸エチル層は、硫酸ナトリウム十水和物（芒硝）にて乾燥した後、４０℃以下で濃縮乾固し、１５３ｍｇ（図２４、２５：＃４）得た。

　水層は、水層中の酢酸エチルをエバポレーターで除去した後、そのまま１．５ＬのＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎに吸着させた。このＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎは、あらかじめ、洗浄し、オープンガラスカラム（φ６ｃｍ×５５ｃｍ）に入れ、精製水で十分置換した物であった。
　（１）精製水　３００ｍｌ、（２）１００％酢酸エチル　３００ｍｌ、（３）１００％メタノール　３００ｍｌを溶出溶媒として順次溶出させた。このうち、１００％酢酸エチルと１００％メタノールにて溶出した溶出液について、それぞれエバポレーターで、４２℃で減圧下濃縮することで、（１）１００％酢酸エチル溶出物（図２４、２５：＃５）　３７４ｍｇ、（２）１００％メタノール溶出物（図２４、２５：＃３）（以下、粗抽出物Ｓと示すことがある）　４４８ｍｇを得た。
　ブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｓ）について、比較例２、２．と同様の方法でＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現への影響を確認したところ、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現を抑制することが確認できた。
１．化合物の分離精製
１）ＨＰＬＣ
　実施例４において得られた、粗抽出物Ｐ（６０％アセトン溶出物）を、表８に示す条件にて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、図１６のチャートのうちピークＡの画分およびピークＢの画分をそれぞれイナートシルＯＤＳ－３（φ１４×２５０ｍｍ）分取用カラム（ＧＬサイエンス社）にて分取した。
　なお、分取して得られた画分について、粗抽出物Ｐ（６０％アセトン溶出物）の測定と同じ条件（表９）にて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析したところ、図１７（ピークＡ）および図１８（ピークＢ）のチャートに示されるように、それぞれ純度の高いピークであることが確認できた。
　これらの物質はいずれもＵＶ最大吸収波長が２８０ｎｍであり、カテキン類と一致した。しかし、前記の分取カラムによるＨＰＬＣにおいて、カテキン、エピカテキン、ＥＧＣＧ、プロシアニジンＢ３等の公知のカテキン類や、カテキンの３量体程度のカテキンの低分子オリゴマーと比べて保持時間が長かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
  
２）ＬＣ／ＭＳ分析およびＬＣＭＳ／ＭＳ分析
　前記１）において得た各成分について、表１０に示した条件によって、それぞれＬＣ／ＭＳ分析を行った。また、得られた結果より精密分子量を計算し、表１１に示した条件によって、校正をしたＬＣＭＳ／ＭＳ分析を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
  
３）ピークＡ由来成分
　前記１）のＨＰＬＣによって分取されたピークＡ由来の成分についてＬＣ／ＭＳ分析により図１９のチャートが得られた。
　図１９に示された２４７５、２１８７、１８９９、１６１１、１３２３、８６７、５７９等のフラグメントイオンから、ピークＡ由来の成分は、カテキンまたはエピカテキンの重合体であることが示唆された。さらに、１３２３、１６１１、１８９９、２１８７、２４７５のフラグメントイオンから、（エピ）ガロカテキン、ガロイル基を有することも示唆された。
　これらの結果から、化合物の候補として、（エピ）ガロカテキンが１分子、（エピ）カテキンが７分子、ガロイル基をひとつ持つ候補化合物Ａ－１と、これと分子量が近似する、（エピ）カテキン７分子に３分子のガロイル基を持つ候補化合物Ａ－２が推定された。
候補化合物Ａ－１：Ｃ１２７Ｈ１０２Ｏ５３　分子量：２４７４．５２８６　[Ｍ＋Ｈ]＋　２４７５．５３６４
候補化合物Ａ－２：Ｃ１２８Ｈ９８Ｏ５４　分子量：２４７４．４９２２　[Ｍ＋Ｈ]＋　２４７５．５０００
　ＬＣＭＳ／ＭＳ分析を行った結果、図２０に示された実測値が２４７５．５４２５であり誤差範囲が３ｐｐｍ以下に収まること、および、モノガレートを示す２４５９．５２３４が観察されたことから、ピークＡ由来の成分は、前記の候補化合物のうち、ガロカテキンまたはエピガロカテキンを１分子、カテキンまたはエピカテキンを７分子、およびガロイル基をひとつ持つ候補化合物Ａ－１であると推定できた。
　この候補化合物Ａ－１は、次の一般式（４）で示される新規な化合物であり、以下の理化学的性質を示すものであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
＜理化学的性質＞
（１）［Ｍ＋Ｈ］＋：２４７５．５４２５（実測値）
（２）分子式：Ｃ１２７Ｈ１０２Ｏ５３
（３）溶解性：水溶性であるがメタノールに溶解性が高く、ヘキサン、エーテル、クロロホルム等の極性の弱い溶媒にはほとんど溶けない
（４）紫外吸収スペクトル：λｍａｘ　２８０ｎｍ
（５）施光度：［α］２０ Ｄ＝＋１２１．４３°（ｃ　０．０００２８　ｍｅｔｈａｎｏｌ）
４）ピークＢ由来成分
　前記１）のＨＰＬＣによって分取されたピークＢ由来の成分についてＬＣ／ＭＳ分析により図２１のチャートが得られた。
　図２１に示された３０５１、３０３５、２４７５、１５９５等のフラグメントイオンから、ピークＢ由来の成分も、カテキンまたはエピカテキンの重合体であることが示唆された。さらに、２４７５、３０３５のデータから、（エピ）ガロカテキン、ガロイル基を有することも示唆された。
　これらの結果から、化合物の候補として、（エピ）ガロカテキンが１分子、（エピ）カテキンが９分子、ガロイル基をひとつ持つ候補化合物Ｂ－１と、これと分子量が近似する、（エピ）カテキンが９分子、ガロイル基を３つ持つ候補化合物Ｂ－２が推定された。
候補化合物Ｂ－１：Ｃ１５７Ｈ１２６Ｏ６５　分子量：３０５０．６５５４（同位体の分子量）
候補化合物Ｂ－２：Ｃ１５６Ｈ１２２Ｏ６６　分子量：３０５０．６１９０（同位体の分子量）
　ＬＣＭＳ／ＭＳ分析を行った結果、図２２に示された実測値が３０５１．６５８７であり誤差範囲が３ｐｐｍ以下に収まること、および、モノガレートを示す３０３５．６７８０が観察されたことから、ピークＢ由来の成分は、前記の候補化合物のうち、ガロカテキンまたはエピガロカテキンを１分子、カテキンまたはエピカテキンを９分子、およびガロイル基をひとつ持つ候補化合物Ｂ－１であると推定できた。
　この候補化合物Ｂ－１は、次の一般式（５）で示される新規な化合物であり、以下の理化学的性質を示すものであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
＜理化学的性質＞
（１）［Ｍ＋Ｈ］＋：３０５１．６５８７（実測値）
（２）分子式：Ｃ１５７Ｈ１２６Ｏ６５
（３）溶解性：水溶性であるがメタノールに溶解性が高く、ヘキサン、エーテル、クロロホルム等の極性の弱い溶媒にはほとんど溶けない
（４）紫外吸収スペクトル：λｍａｘ　２８０ｎｍ
１．試料の調製
１）マスカット・べリーＡ（梗）
　マスカット・ベリーＡ（以下、ベリーＡと示す場合がある）由来の梗を使用して、実施例１、１．と同様の方法によって得た、ベリーＡ由来のブドウ梗由来抽出物（図２３、Ｂ）と、実施例２、１．工程１と同様の方法により、これをそのままＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎに吸着させ、精製水で非吸着物を洗浄後、１００％酢酸エチル、または１００％メタノールで順次溶出させて得た１００％酢酸エチル溶出物（図２３、Ｃ）、および１００％メタノール溶出物（図２３、Ｄ）をそれぞれ試料とした。
　これらの溶出物をそれぞれ６０％エタノールに溶解し０．０１ｍｇ／ｍｌとした。これをＰＣ－３細胞の培地に対し濃度が１％（１００μｇ／ｍｌ）となるようにそれぞれ添加した。
２）シャルドネ（梗）
　実施例１、１．と同様の方法によって得た、シャルドネ由来のブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）（図２３、Ｅ）と、実施例２、１．工程１と同様の方法により、これをそのままＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎに吸着させ、精製水で非吸着物を洗浄後、１００％酢酸エチル、または１００％メタノールで順次溶出させて得た１００％酢酸エチル溶出物（図２３、Ｆ）、および１００％メタノール溶出物（図２３、Ｇ）をそれぞれ試料とした。
　これらの溶出物をそれぞれ６０％エタノールに溶解し０．０１ｍｇ／ｍｌとした。これをＰＣ－３細胞の培地に対し濃度が１％（１００μｇ／ｍｌ）となるようにそれぞれ添加した。
３）シャルドネ（枝）
　剪定し、水で洗浄したシャルドネの枝５０ｇを１０センチ程度にカットし、１Ｌの三角フラスコに４００ｍｌの精製水と共に入れ、口にアルミホイルをした。その後、この三角フラスコを、お湯をはったステンレスのバットに入れ、ガスコンロで沸騰させた。４０分沸騰後、冷却し綿濾過した。
　このろ液（図２３、Ｈ）をＸＡＤ（登録商標）－１１８０Ｎ１６０ｍｌに吸着させ、非吸着物を精製水３００ｍｌで除去した後、酢酸エチル　３００ｍｌ、または１００％メタノール　３００ｍｌで順次溶出させて得た酢酸エチル溶出物７０．８ｍｇ（図２３、Ｉ）、および（２）１００％メタノール溶出物５５．１ｍｇ（図２３、Ｊ）をそれぞれ試料とした。
　これらの溶出物をそれぞれ６０％エタノールに溶解し０．０１ｍｇ／ｍｌとした。これをＰＣ－３細胞の培地に対し濃度が１％（１００μｇ／ｍｌ）となるようにそれぞれ添加した。
４）化合物（１）
　一般式（４）にて示される化合物（１）（図２３、Ｋ）を試料とした。
　化合物（１）を６０％エタノールに溶解し０．０１ｍｇ／ｍｌとした。これをＰＣ－３細胞の培地に対し濃度が１％（１００μｇ／ｍｌ）となるように添加した。
５）化合物（２）
　一般式（５）にて示される化合物（２）（図２３、Ｌ）を試料とした。
　化合物（２）を６０％エタノールに溶解し０．０１ｍｇ／ｍｌとした。これをＰＣ－３細胞の培地に対し濃度が１％（１００μｇ／ｍｌ）となるように添加した。
２．ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験
　前記１．で調製したブドウ梗由来抽出物、ブドウの枝由来抽出物、および化合物について、ＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性を調べた。
　このＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性は、表１２に示したＦＡＢＰ５遺伝子を増幅するプライマー（配列表配列番号１２、１３）、または内因性コントロールとしてＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅するプライマー（配列表配列番号１４、１５）を使用した以外は、比較例２、２．と同様の方法で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　その結果、図２３に示したように、ベリーＡの梗由来の１００％メタノール溶出物（図２３、Ｄ）やシャルドネの梗由来の１００％メタノール溶出物（図２３、Ｇ）を添加したＰＣ－３細胞では、顕著にＦＡＢＰ５遺伝子の発現が低下することが確認できた。一方、シャルドネの枝由来の１００％メタノール溶出物（図２３、Ｊ）では、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現の低下が確認できなかった。
　また、一般式（４）にて示される化合物（１）（図２３、Ｋ）や一般式（５）にて示される化合物（２）（図２３、Ｌ）を添加した場合にも、ＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現が低下したことから、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制には、ブドウ梗由来抽出物や、これらの化合物が有用であることが確認できた。
ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験
１．試料の調製
１）６０％ＥｔＯＨ（図２４、２５：ＥｔＯＨ）
　溶媒をそのままコントロール試料とした。
２）化合物（１）（図２４、２５：Ｓ６）
　一般式（４）にて示される化合物（１）を試料とした。
　化合物（１）を６０％エタノールに溶解し０．０１ｍｇ／ｍｌとした。これをＰＣ－３細胞の培地に対し濃度が１％（１００μｇ／ｍｌ）となるように添加した。
３）化合物（２）（図２４、２５：＃１０）
　一般式（５）にて示される化合物（２）を試料とした。
　化合物（２）を６０％エタノールに溶解して０．５％または１％の濃度に調製した。これをＰＣ－３細胞の培地に対し濃度が１％（１００μｇ／ｍｌ）となるようにそれぞれ添加した。
４）＃１～＃５（図２４、２５：＃１、＃２、＃３、＃４、＃５）
　実施例６のブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｓ）の分離精製と同様の方法によって得られた溶出物（＃１～＃５）をそれぞれ６０％エタノールに溶解し０．０１ｍｇ／ｍｌとした。これをＰＣ－３細胞の培地に対し濃度が１％（１００μｇ／ｍｌ）となるようにそれぞれ添加した。
２．ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験

　培養後のＰＣ－３細胞から得られる各試料について、実施例８と同様の方法によりＦＡＢＰ５遺伝子の発現の有無および程度を調べた。
　その結果、図２４に示したように、化合物（２）を１％と添加して培養したＰＣ－３細胞（図２４、＃１０－１％）やブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ｓ）を１％と添加して培養したＰＣ－３細胞（図２４、＃３－１％）では、特に強くＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子の発現レベルが低下することが確認できた。これは、増幅したＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色してＵＶ照射することにより、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現の有無および程度を調べた結果（図２５）でも同様であった。
　したがって、これらの実施例、比較例の結果から、本発明のブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ）が、いずれもＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ５タンパク質の発現を抑制する能力を有することが確認できた。また、一般式（４）で示される化合物や一般式（５）で示される化合物もＰＣ－３細胞におけるＦＡＢＰ５遺伝子およびＦＡＢＰ５タンパク質の発現を抑制する能力を有することが確認できた。
　したがって、これらの化合物、該化合物を含むブドウ梗由来抽出物、およびブドウ梗由来抽出物はいずれも、抗腫瘍作用、腫瘍の転移抑制作用を有し、前立腺癌等の腫瘍に対する抗腫瘍剤や腫瘍の転移抑制剤や、その有効成分として使用することができることが確認できた。
　本発明の化合物、該化合物を含むブドウ梗由来抽出物、またはブドウ梗由来抽出物を抗腫瘍剤や腫瘍の転移抑制剤や、その有効成分とすることにより、腫瘍、特に前立腺癌の予防や、また、前立腺肥大の改善等を目的する剤を幅広く提供できる。
　本発明の化合物を含むブドウ梗由来抽出物や、ブドウ梗由来抽出物自体を活用することはブドウ残渣の有用利用にも役立つ。

Claims (23)

  1. 下記一般式（１）で示される化合物。
    （Ａ）ｎ１－（Ｂ）ｎ２　　　・・・一般式（１）
    （前記一般式（１）中、
    ｎ１は６～２０のいずれかの整数を示し；
    ｎ２は１～２０のいずれかの整数を示し；
    Ａは下記一般式（２）で示される基であり；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     前記一般式（２）中、
    Ｒ１－１は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒを示し；
    Ｒ１－２は同一または異なっていてもよく、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒを示し；
    Ｒ１－３は同一または異なっていてもよく、－ＯＨ、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒ、－Ｇａｌｌａｔｅを示し；
    Ｒ１－４は同一または異なっていてもよく、－Ｃａｔｅｃｈｉｎ、－Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎを示し；
    Ｒ１－５は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨを示し；
    Ｂは下記一般式（３）で示される基であり；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     前記一般式（３）中、
    Ｒ２は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－Ｏ－Ｇｌｕ、－Ｏ－Ｇａｌ、－Ｏ－Ｓｕｇａｒを示す。）
  2. 前記一般式（２）がガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンまたはエピカテキンからなる群より選ばれるいずれか一種以上である請求項１に記載の化合物。
  3. 下記の一般式（４）で示される請求項１または２に記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （前記一般式（４）中、
    Ｒ３は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨを示し、少なくとも一つは－ＯＨを示す。）
  4. 下記の一般式（５）で示される請求項１または２に記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （前記一般式（５）中、
    Ｒ４は同一または異なっていてもよく、－Ｈ、－ＯＨを示し、少なくとも一つは－ＯＨを示す。）
  5. 請求項１～４のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む抗腫瘍剤。
  6. 腫瘍が前立腺癌である請求項５に記載の抗腫瘍剤。
  7. 請求項１～４のいずれかに記載の化合物を有効成分として含む腫瘍の転移抑制剤。
  8. 腫瘍が前立腺癌である請求項７に記載の腫瘍の転移抑制剤。
  9. 請求項１～４のいずれかに記載の化合物を含むブドウ梗由来抽出物。
  10. ブドウの梗を熱水、含水アルコール、含水アセトン、または親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒で抽出して得られるブドウ梗由来抽出物。
  11. ブドウの梗をそのまま、または凍結した後、熱水、含水アルコール、含水アセトン、または親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒で抽出して得られる請求項１０に記載のブドウ梗由来抽出物。
  12. 次の１）～１４）のいずれかである請求項１０または１１に記載のブドウ梗由来抽出物。
    １）ブドウの梗を熱水抽出して得られる抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物
    ２）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、酢酸エチル／メタノール溶液で溶出して得られる抽出物
    ３）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物
    ４）前記２）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、酢酸エチル／メタノール溶液で溶出して得られる抽出物
    ５）前記３）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物
    ６）前記５）の抽出物のうち水可溶物をＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、水で溶出して得られる抽出物
    ７）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、精製水で溶出して得られる抽出物
    ８）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、５０％エタノール水溶液で溶出して得られる抽出物
    ９）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、イソプロピルアルコールで溶出して得られる抽出物
    １０）前記１）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、５０％アセトン水溶液で溶出して得られる抽出物
    １１）前記１０）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、４０％メタノール水溶液で溶出して得られる抽出物
    １２）前記１０）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％メタノール水溶液で溶出して得られる抽出物
    １３）前記１）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％アセトン水溶液で溶出して得られる抽出物
    １４）前記１３）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％アセトン水溶液で溶出して得られる抽出物
  13. 次の１）または２）のいずれかである請求項１０または１１に記載のブドウ梗由来抽出物。
    １）ブドウの梗を６０％アセトンで抽出して得られる抽出物
    ２）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物
  14. ブドウの梗が、ヴィニフェラ種（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）のシャルドネ、ソービニオンブラン、リースリング、ケルナー、カベルネ・ソーヴィニヨン、カベルネ・フラン、メルローピノノアール、あるいはヤマブドウ、またはヴィニフェラ系交雑種の甲州、マスカット・ベリーＡ、ナイアガラ、キャンベルアーリー、マスカット・アレキサンドリア、巨峰、あるいはコンコードからなる群より選ばれるいずれか一種以上のブドウ由来である請求項１０～１３のいずれかに記載のブドウ梗由来抽出物。
  15. 請求項１０～１４のいずれかに記載のブドウ梗由来抽出物を有効成分として含む抗腫瘍剤。
  16. 腫瘍が前立腺癌である請求項１５に記載の抗腫瘍剤。
  17. 請求項１０～１４のいずれかに記載のブドウ梗由来抽出物を有効成分として含む腫瘍の転移抑制剤。
  18. 腫瘍が前立腺癌である請求項１７に記載の腫瘍の転移抑制剤。
  19. ブドウの梗を熱水、含水アルコール、含水アセトン、または親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒で抽出する工程を含む請求項１０～１４のいずれかに記載のブドウ梗由来抽出物の製造方法。
  20. ブドウの梗をそのまま、または凍結した後、熱水、含水アルコール、含水アセトン、または親水性溶媒と親油性溶媒を混合した両親媒性溶媒で抽出して得られる請求項１９に記載のブドウ梗由来抽出物の製造方法。
  21. 次の１）～１４）のいずれかに記載の工程を含む請求項１９または２０に記載のブドウ梗由来抽出物の製造方法。
    １）ブドウの梗を熱水抽出して得られる抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して抽出物を得る工程
    ２）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、酢酸エチル／メタノール溶液で溶出して抽出物を得る工程
    ３）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して抽出物を得る工程
    ４）前記２）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、酢酸エチル／メタノール溶液で溶出して抽出物を得る工程
    ５）前記３）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して抽出物を得る工程
    ６）前記５）の抽出物のうち水可溶物をＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、水で溶出して抽出物を得る工程
    ７）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、精製水で溶出して抽出物を得る工程
    ８）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、５０％エタノール水溶液で溶出して抽出物を得る工程
    ９）前記６）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、イソプロピルアルコールで溶出して抽出物を得る工程
    １０）前記１）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、５０％アセトン水溶液で溶出して抽出物を得る工程
    １１）前記１０）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、４０％メタノール水溶液で溶出して抽出物を得る工程
    １２）前記１０）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％メタノール水溶液で溶出して抽出物を得る工程
    １３）前記１）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％アセトン水溶液で溶出して抽出物を得る工程
    １４）前記１３）の抽出物をさらにセルロース系、あるいはその誘導体または親水性化合物のポリマーで分画し、６０％アセトン水溶液で溶出して抽出物を得る工程
  22. 次の１）または２）のいずれかに記載の工程を含む請求項１９または２０に記載のブドウ梗由来抽出物の製造方法。
    １）ブドウの梗を６０％アセトンで抽出して抽出物を得る工程
    ２）前記１）の抽出物をさらにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅａｌｓ力による吸着を利用した合成吸着剤で分画し、メタノールで溶出して得られる抽出物
  23. ブドウの梗が、ヴィニフェラ種（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）のシャルドネ、ソービニオンブラン、リースリング、ケルナー、カベルネ・ソーヴィニヨン、カベルネ・フラン、メルローピノノアール、あるいはヤマブドウ、またはヴィニフェラ系交雑種の甲州、マスカット・ベリーＡ、ナイアガラ、キャンベルアーリー、マスカット・アレキサンドリア、巨峰、あるいはコンコードからなる群より選ばれるいずれか一種以上のブドウ由来である請求項１９～２２のいずれかに記載のブドウ梗由来抽出物の製造方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017155012A (ja) * 2016-03-03 2017-09-07 国立大学法人信州大学 小豆抽出物
JP2019151583A (ja) * 2018-03-02 2019-09-12 国立大学法人信州大学 エピガロカテキンを含むオリゴマーおよびその製造方法
JP2019156743A (ja) * 2018-03-12 2019-09-19 株式会社ファンケル Ｆａｂｐ５産生抑制用組成物

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02187433A (ja) * 1989-01-14 1990-07-23 Sekisui Chem Co Ltd 防臭性合成樹脂発泡体の製造方法
WO2000018416A1 (en) * 1998-09-30 2000-04-06 Industrial Research Limited Antioxidant compositions and process for their preparation
JP2001097872A (ja) * 1999-09-30 2001-04-10 Api Co Ltd 赤ブドウ抽出物及びその製造方法
JP2008508252A (ja) * 2004-07-27 2008-03-21 ゲンプロファイラー エス．アール．エル． 前立腺癌発病予防および前立腺肥大（ｂｐｈ）の総合的症状の効果的な治療のための、化学的な予防効果を有する、中国緑茶またはその他の野菜から抽出したカテキン、さらに正確にはポリフェノールの混合物
WO2010108410A1 (zh) * 2009-03-25 2010-09-30 Zhao Yali 儿茶素在制备逆转录病毒整合酶抑制剂中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02187433A (ja) * 1989-01-14 1990-07-23 Sekisui Chem Co Ltd 防臭性合成樹脂発泡体の製造方法
WO2000018416A1 (en) * 1998-09-30 2000-04-06 Industrial Research Limited Antioxidant compositions and process for their preparation
JP2001097872A (ja) * 1999-09-30 2001-04-10 Api Co Ltd 赤ブドウ抽出物及びその製造方法
JP2008508252A (ja) * 2004-07-27 2008-03-21 ゲンプロファイラー エス．アール．エル． 前立腺癌発病予防および前立腺肥大（ｂｐｈ）の総合的症状の効果的な治療のための、化学的な予防効果を有する、中国緑茶またはその他の野菜から抽出したカテキン、さらに正確にはポリフェノールの混合物
WO2010108410A1 (zh) * 2009-03-25 2010-09-30 Zhao Yali 儿茶素在制备逆转录病毒整合酶抑制剂中的应用

Non-Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AOKI K. ET AL.: "Novel inhibitors of poly(ADP- ribose) glycohydrolase", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1158, no. 3, 1993, pages 251 - 256, XP025492665 *
FUKUCHI K. ET AL.: "Inhibition of herpes simplex virus infection by tannins and related compounds", ANTIVIRAL RESEARCH, vol. 11, no. 5-6, 1989, pages 285 - 297, XP023893379 *
HATANO T. ET AL.: "Effects of interaction of tannins with co-existing substances. VII. Inhibitory effects of tannins and related polyphenols on xanthine oxidase", CHEMICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN, vol. 38, no. 5, 1990, pages 1224 - 1229, XP009085886 *
HATANO,T. ET AL.: "Effects of the interaction of tannins with co-existing substances. VI. Effects of tannins and related polyphenols on superoxide anion radical, and on 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl radical", CHEMICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN, vol. 37, no. 8, 1989, pages 2016 - 2021, XP000907239 *
ISMAILOV A.E. ET AL.: "Oligomeric proanthocyanidin glycosides of Rhodiola pamiroalaica. II", CHEMISTRY OF NATURAL COMPOUNDS, vol. 35, no. 1, 1999, pages 33 - 38, XP055075799 *
KAKIUCHI,N. ET AL.: "Effect of condensed tannins and related compounds on reverse transcriptase", PHYTOTHERAPY RESEARCH, vol. 5, no. 6, 1991, pages 270 - 272, XP055075808 *
KARVELA,E. ET AL.: "Deployment of response surface methodology to optimise recovery of grape (Vitis vinifera) stem polyphenols", TALANTA, vol. 79, no. 5, 2009, pages 1311 - 1321, XP026374920 *
KIDERLEN,A.F. ET AL.: "Tannins and related compounds: killing of amastigotes of Leishmania donovani and release of nitric oxide and tumour necrosis factor alpha in macrophages in vitro", Z NATURFORSCH C, vol. 56, no. 5-6, 2001, pages 444 - 454, XP009116790 *
KULIEV Z.A. ET AL.: "Oligomeric proanthocyanidin glycosides of Clementsia semenovii and their biological activity. III", CHEMISTRY OF NATURAL COMPOUNDS, vol. 36, no. 1, 2000, pages 60 - 67, XP008144771 *
MAKHMATKULOV,A.B. ET AL.: "Proanthocyanidins of Polygonum coriarium. II", KHIMIYA PRIRODNYKH SOEDINENII, 1994, pages 233 - 244 *
MAKRIS, D.P. ET AL.: "Characterisation of certain major polyphenolic antioxidants in grape (Vitis vinifera cv. Roditis) stems by liquid chromatography-mass spectrometry", EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY, vol. 226, no. 5, 2008, pages 1075 - 1079, XP019585021 *
MATAMAROVA K.N. ET AL.: "Oligomeric proanthocyanidin glycosides of Clementsia semenovii", CHEMISTRY OF NATURAL COMPOUNDS, vol. 34, no. 6, 1998, pages 676 - 682, XP055075800 *
MATAMAROVA K.N. ET AL.: "Oligomeric proanthocyanidin glycosides of Clementsia semenovii. II", CHEMISTRY OF NATURAL COMPOUNDS, vol. 35, no. 1, 1999, pages 39 - 45, XP055075797 *
NAKASHIMA H. ET AL.: "Inhibition of human immunodeficiency viral replication by tannins and related compounds", ANTIVIRAL RESEARCH, vol. 18, no. 1, 1992, pages 91 - 103, XP023794887 *
NISHANBAEV S.Z. ET AL.: "New oligomeric proanthocyanidin glycosides platanoside-A and platanoside-B from Platanus orientalis trunk bark", CHEMISTRY OF NATURAL COMPOUNDS, vol. 46, no. 3, 2010, pages 357 - 362, XP055075794 *
NISHANBAEV S.Z. ET AL.: "New Oligomeric Proanthocyanidins from Bark of Platanus orientalis", CHEMISTRY OF NATURAL COMPOUNDS, vol. 41, no. 4, 2005, pages 404 - 409, XP019276759 *
PENA-NEIRA A. ET AL.: "A survey of phenolic compounds in Spanish wines of different geographical origin", EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY, vol. 210, no. 6, 2000, pages 445 - 448, XP055075792 *
PIRNIYAZOV A.Z. ET AL.: "Polyphenols from Vitis vinifera seeds", CHEMISTRY OF NATURAL COMPOUNDS, vol. 39, no. 4, 2003, pages 349 - 354, XP055075789 *
PUSSA T. ET AL.: "Survey of grapevine Vitis vinifera stem polyphenols by liquid chromatography-diode array detection-tandem mass spectrometry", J AGRIC FOOD CHEM, vol. 54, no. 20, 2006, pages 7488 - 7494, XP055075823 *
SAKAGAMI,H. ET AL.: "Stimulation of granulocytic cell iodination by tannins and related compounds", ANTICANCER RES, vol. 10, no. 6, 1990, pages 1523 - 1531 *
SAKAGAMI,H. ET AL.: "Stimulation of monocyte iodination and IL-1 production by tannins and related compounds", ANTICANCER RES, vol. 12, no. 2, 1992, pages 377 - 387 *
ZGA N. ET AL.: "Preparative purification of antiamyloidogenic stilbenoids from Vitis vinifera (Chardonnay) stems by centrifugal partition chromatography", J CHROMATOGR B ANALYT TECHNOL BIOMED LIFE SCI, vol. 877, no. 10, 2009, pages 1000 - 1004, XP026010978 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017155012A (ja) * 2016-03-03 2017-09-07 国立大学法人信州大学 小豆抽出物
JP2019151583A (ja) * 2018-03-02 2019-09-12 国立大学法人信州大学 エピガロカテキンを含むオリゴマーおよびその製造方法
JP7089274B2 (ja) 2018-03-02 2022-06-22 国立大学法人信州大学 エピガロカテキンを含むオリゴマーおよびその製造方法
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