JP2019156743A - Fabp5産生抑制用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
哺乳類では9種類のFABPが知られており、一般には脂肪酸の代謝活性が高い組織、心筋、骨格筋、腸、肝臓、脂肪細胞などにFABPが豊富に存在する。FABPは最初に単離された組織あるいは細胞の名称を冠して、心臓型(H−)、脳型(B−)、肝臓型(L−)、腸型(I−)などと命名されているが、各FABPは多様な組織や細胞に発現することから,最近はFABP3(H−FABP)、FABP5(E−FABP)、FABP7(B−FABP)など番号で示されるようになっている。本願明細書においてもこの名称にしたがうものとする。
また、皮膚において脂肪酸自体が肌にダメージを与え、炎症を起こすが、これは皮膚上に多く存在するFABP5が核内受容体を介してバリア機能低下や炎症など肌状態を悪化させるためである。過剰な脂肪酸の存在は、皮膚上のFABP5を増加させ、皮膚の炎症を増強させることが分かっている。炎症を惹起させる脂肪酸としてパルミチン酸、ラウリン酸、オレイン酸が、このような挙動を示すことも分かっている。
特許文献6には、小豆の水抽出物や、これを吸着剤や担体に吸着させて、メタノール、エタノール等の溶媒で溶出して得たものを有効成分として、癌の転移抑制剤やFABP5遺伝子活性抑制剤、癌の増殖抑制剤等の抗癌剤として利用する発明が記載されている。
すなわち、本発明は、FABP5産生抑制作用を有する組成物を提供することを課題とする。
(1)ノビレチン、ナリンギン、スルフォラファン、ホモオリエンチン、ジャスモン酸メチルから選択される1以上の物質を有効成分として含むFABP5産生抑制用組成物。
(2)ノビレチンを含む組成物が柑橘類の果皮抽出物である(1)に記載のFABP5産生抑制用組成物。
(3)柑橘類の果皮抽出物がチンピエキス及び/又はキッピエキスである(2)に記載のFABP5産生抑制用組成物。
(4)スルフォラファンを含む組成物がブロッコリー抽出物である(1)に記載のFABP5産生抑制用組成物。
(5)ブロッコリー抽出物がブロッコリースプラウト抽出物である(4)に記載のFABP5産生抑制用組成物。
本願明細書において使用する「FABP5」なる用語は、Fatty acid−binding protein5の略語であって、脂肪酸結合性タンパク質5を意味する。
またFABP5産生抑制とは、FABP5遺伝子の転写抑制、FABP5遺伝子の発現抑制、FABP5のタンパク質量及び/又はFABP5活性の抑制を意味している。
ノビレチン(Nobiletin)は、ポリメトキシフラボノイド(O−メチル化フラボノイド)であり、柑橘類の果皮等に多く含まれている。下記化学式1で表される構造を有しており、柑橘類の果皮や果汁から抽出したものを本発明に用いることができる。
ノビレチンのIUPAC名称は、2−(3,4−Dimethoxyphenyl)−5,6,7,8−tetramethoxychromen−4−one、CAS番号が478−01−3である化合物として特定できる。
(化学式1)
ナリンギン (Naringin) は、グレープフルーツやはっさくなどの果実の果皮付近に多く含まれるフラバノンの配糖体で、柑橘類の苦味や刺激感の元になっている。
ナリンギン(ナリンジンとも呼ばれることがある)は、下記化学式2で表される構造を有しており、柑橘類の果皮や果汁から抽出したものを本発明に用いることができる。
スルフォラファン(Sulforaphane)は、イソチオシアネートの一種でアブラナ科野菜に多く含まれており、中でもブロッコリーには多く含まれている。下記化学式3で表される構造を有しており、ブロッコリー又はブロッコリーの新芽(ブロッコリースプラウト)から抽出したものを本発明に用いることができる。
スルフォラファンのIUPAC名称は、1−isothiocyanato−4−(methylsulfinyl)−butane、CAS番号が4478−93−7である化合物として特定できる。
ホモオリエンチン(Homoorientin)は、別名をイソオリエンチンとも言う。パッションフルーツの花エキス中に含有されていることが知られている化合物である。下記化学式4で表すことができる。IUPAC名称は、2−(3,4−Dihydroxyphenyl)−6−β−D−glucopyranosyl−5,7−dihydroxy−4H−1−benzopyran−4−one、CAS番号が4261−42−1の化合物として特定できる。
ジャスモン酸メチル(methyl jasmonate)は、植物防御や、種子発芽、根の伸長、開花、果実の熟成、老化といった種々の発生経路において、植物ホルモンとして用いられる揮発性有機化合物の一つである。ジャスミン油から香気成分として単離されている化合物であり、下記化学式5で表すことができる。IUPAC名称は、Methyl(1R,2R)−3−Oxo−2−(2Z)−2−pentenyl−cyclopentaneacetate、CAS番号が39924−52−2の化合物として特定できる。
1.天然化合物ライブラリーを用いた1次スクリーニング試験
出願人保有の天然化合物ライブラリーの480化合物を対象に試験を行った。
1)試験に用いた細胞
正常ヒト表皮角化細胞(Normal Human Epidermal Keratinocytes:NHEK passage4 / Thermo Fisher Scientific)。
細胞は37℃、5%二酸化炭素、95%雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清(FBS)(Hyclone Laboratories)10%、Penicillin−Streptomycin(Sigma Aldrich)1%を添加した培地DMEM(GIBCO/11995−073)を用いた。通常培養には75cmフラスコに細胞を播種し80〜90%コンフルエント時に0.05%Trypsin−EDTA(Sigma Aldrich)を加えて細胞を剥離し、継代を行った。
ライブラリーの化合物は、100%ジメチルスルホキシド(Dimethyl sulfoxide:DMSO)に0.4mg/mlの濃度に溶解させて試験を行った。
24well plateにNHEK細胞を4×104cells/wellになるように播種し、24時間前培養を行った。そして試験試料の添加は100%DMSOに溶解させた溶液を、培地により最終濃度が0.1〜1μg/mlになるように希釈して添加した。
細胞をCell Lysis Bufferに溶解し、20分間振とうした後、細胞溶解液を回収した。回収した細胞溶解液はBCA protein kitを用いてタンパク質量を測定した。なおタンパク質量の測定は、キット添付のプロトコールに従った。
96well EIA/RIA plateにPBSで希釈した抗FABP5抗体(Bio Vender)100μlを添加し、4℃で保存し、抗体を固定化させた。
翌日300μl Wash bufferで3回洗浄し、次いで余分な液を除き、Reagent Diluent(R&D)を添加し、25℃で1時間ブロッキングを行った。300μlのPBS−T(0.05%)で3回洗浄し、余分な液を除いた後、Cell Lysis Bufferで希釈したFABP5(フナコシ株式会社)と試験試料を各100μl添加した。
37℃で1.5時間反応させた後、300μlのPBS−T(0.05%)で3回洗浄し、次いで余分な液を除き、PBS−T(0.05%)で希釈した抗FABP5抗体(R&D)を100μl添加し、37℃で1時間反応させた。
反応終了後300μlのPBS−T(0.05%)で3回洗浄し、余分な液を除き、PBS−T(0.05%)で希釈した抗Streptavidin−HRP2を100μl添加し、37℃で30min反応させた。300μlのPBS−T(0.05%)で3回洗浄し、余分な液を除き、TMB One solution(promega)を100μl添加し、色が変わるまで室温で反応させた。次いで、2N硫酸(和光純薬工業株式会社)を50μl添加し、反応を停止させた後、450nmの吸光度を測定した。予め作成した検量線と対比してFABP5の産生量を測定した。得られたFABP5の測定値を細胞タンパク量で除して標準化し、FABP5の生産量とした。
上記の480化合物のうち、FABP5産生が無添加の場合と比較して変動が観察されたものは、次の表1に示す12化合物であった。
1次試験で陽性(FABP5の産生を変動させた)となった化合物について、LPSと脂肪酸刺激によるFABP5の産生を抑制する機能を評価した。
1)細胞の培養条件
細胞は37℃、5%二酸化炭素、95%雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清(FBS)(Hyclone Laboratories)10%、Penicillin−Streptomycin(Sigma Aldrich)1%を添加した培地DMEM(GIBCO/11995−073)を用いた。通常培養には75cmフラスコに細胞を播種し80〜90%コンフルエント時に0.05%Trypsin−EDTA(Sigma Aldrich)を加えて細胞を剥離し、継代を行った。
1次スクリーニングと同様に、試験試料は、いずれもジメチルスルホキシド(Dimethyl sulfoxide:DMSO)に溶解させて試験を行った。
24well plateにNHEKを4×104cells/wellになるように播種し、24時間前培養を行った。そして、10μg/ml LPS(リポポリサッカリド 大腸菌026:B6由来:Sigma Ardrich)を添加した培地で8時間培養した。その後、パルミチン酸400μM、またはオレイン酸800μMを添加した培地に試験試料を加え20時間培養を行った。試験試料の添加は100%DMSOに溶解させた溶液を、培地により最終濃度がノビレチンは40μg/ml、ナリンギンは0.25μg/ml、スルフォラファンは0.025μg/ml、ホモオリエンチンは2.5μg/ml、ジャスモン酸メチルは1μg/mlになるように希釈して添加した。
細胞をCell Lysis Bufferに溶解し、20分間振とうした後、細胞溶解液を回収した。回収した細胞溶解液はBCA protein kitを用いてタンパク質量を測定した。なおタンパク質量の測定は、キット添付のプロトコールに従った。
96well EIA/RIA plateにPBSで希釈した抗FABP5抗体(Bio Vender)100μlを添加し、4℃で保存し、抗体を固定化させた。
翌日300μl Wash bufferで3回洗浄し、次いで余分な液を除き、Reagent Diluent(R&D)を添加し、25℃で1時間ブロッキングを行った。300μlのPBS−T(0.05%)で3回洗浄し、余分な液を除いた後、Cell Lysis Bufferで希釈したFABP5(フナコシ株式会社)と試験試料を各100μl添加した。
37℃で1.5時間反応させた後、300μlのPBS−T(0.05%)で3回洗浄し、次いで余分な液を除き、PBS−T(0.05%)で希釈した抗FABP5抗体(R&D)を100μl添加し、37℃で1時間反応させた。
反応終了後300μlのPBS−T(0.05%)で3回洗浄し、余分な液を除き、PBS−T(0.05%)で希釈した抗Streptavidin−HRP2を100μl添加し、37℃で30min反応させた。300μlのPBS−T(0.05%)で3回洗浄し、余分な液を除き、TMB One solution(promega)を100μl添加し、色が変わるまで室温で反応させた。次いで、2N硫酸(和光純薬工業株式会社)を50μl添加し、反応を停止させた後、450nmの吸光度を測定した。予め作成した検量線と対比してFABP5の産生量を測定した。得られたFABP5の測定値を細胞タンパク量で除して標準化し、FABP5の生産量とした。
上記の12試料のうち、FABP5産生を抑制した化合物は、ノビレチン、ナリンギン、スルフォラファン、ホモオリエンチン、ジャスモン酸メチルの5試料であった。
FABP5産生を抑制できる最低濃度を確認した試験結果を図1〜5に示す。
図1〜図5に示すように、ノビレチンは40μg/ml、ナリンギンは0.25μg/ml、スルフォラファンは0.025μg/ml、ホモオリエンチンは2.5μg/ml、ジャスモン酸メチルは1μg/mlの濃度でFABP5の産生を抑制した。
ノビレチンを含む抽出物としてタチバナ果皮エキス(「チンピエキスK65B」日油株式会社)、スルフォラファンを含む抽出物として発芽ブロッコリー抽出物(「ブロッコリースプラウトエキスPC」オリザ油化株式会社)を用いて、1.の試験と同様に試験を行った。なおチンピエキスは、ノビレチンを0.8%含有しているものを用いた。またブロッコリー抽出物は、スルフォラファンを2%含有しているものを用いた。
チンピエキスは0.4μg/ml、ブロッコリースプラウトエキスは0.00025%以上の濃度でFABP5の産生を抑制することがわかった。
Claims (5)
- ノビレチン、ナリンギン、スルフォラファン、ホモオリエンチン、ジャスモン酸メチルから選択される1以上の物質を有効成分として含むFABP5産生抑制用組成物。
- ノビレチンを含む組成物が柑橘類の果皮抽出物である請求項1に記載のFABP5産生抑制用組成物。
- 柑橘類の果皮抽出物がチンピエキス及び/又はキッピエキスである請求項2に記載のFABP5産生抑制用組成物。
- スルフォラファンを含む組成物がブロッコリー抽出物である請求項1に記載のFABP5産生抑制用組成物。
- ブロッコリー抽出物がブロッコリースプラウト抽出物である請求項4に記載のFABP5産生抑制用組成物。
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