WO2015002279A1 - グルタチオン生成促進用組成物 - Google Patents

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WO2015002279A1
WO2015002279A1 PCT/JP2014/067836 JP2014067836W WO2015002279A1 WO 2015002279 A1 WO2015002279 A1 WO 2015002279A1 JP 2014067836 W JP2014067836 W JP 2014067836W WO 2015002279 A1 WO2015002279 A1 WO 2015002279A1
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WO
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isothiocyanate
glutathione
compound
sulfur
salt
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PCT/JP2014/067836
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健三 野村
瀧野　嘉延
冬美恵 大倉
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味の素株式会社
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the antioxidant capacity in vivo is known to be related to various diseases, and intake of polyphenols such as catechins and vitamin C is recommended.
  • these components are a transient antioxidant effect by a meal, the continuous intake is calculated
  • glutathione an antioxidant component
  • this component decreases with age, and it has been confirmed that the immunity is reduced and the incidence of cancer is increased. . Therefore, it is considered that promoting the production of glutathione and increasing the amount of glutathione is an important factor for maintaining health, and various materials for promoting the production of glutathione have been found so far. .
  • isothiocyanates For isothiocyanates, many usefulnesses have been reported, including induction of detoxification enzymes in the body, immunostimulatory action, anticancer action, etc., and development of pharmaceuticals based on their structure, etc. Industrial utility value is large (Non-patent Document 1). In addition, as a result of functional studies, it has been found that glutathione production in vivo is promoted in relation to detoxification enzyme induction, and is expected as a component having multiple functions. However, isothiocyanates such as sulforaphane have unstable properties such as reaction with moisture even in a steady state, are oily substances, and have an odor and irritation peculiar to isothiocyanate. Use as cosmetics and foods has been difficult.
  • isothiocyanates in natural products are accumulated in a stable structure called glucosinolate, which is a glycoside structure.
  • glucosinolate which is a glycoside structure.
  • the intracellular myrosinase enzyme is And isothiocyanate is produced from glucosinolate. That is, if it is a glucosinolate structure, it exists very stably. Therefore, in order to inhibit the enzyme reaction in consideration of the production process for industrial use, the enzyme is deactivated by heat treatment during the crushing process at the time of extraction, and the extraction contains the structure of the precursor. Ingenuity has been made such as obtaining things.
  • the present invention is effective in preventing or improving pigmentation or wrinkles (anti-bacterial skin and whitening), has anti-oxidant action and cell detoxification, promotes the production of glutathione that is safe and free of odors and irritation and has high in-vivo utilization efficiency. It aims at providing an agent and its manufacturing method.
  • the present inventors react an isothiocyanate contained in a natural product such as arugula seed with a yeast extract containing a sulfur-containing compound such as cysteine, ⁇ -glutamylcysteine, glutathione, etc., and extract with a specific solvent.
  • a sulfur-containing compound such as cysteine, ⁇ -glutamylcysteine, glutathione, etc.
  • the present invention is as follows.
  • [1] A method for producing a compound in which an isothiocyanate and a sulfur-containing compound are bonded in a dithiocarbamate structure, wherein a plant material containing an isothiocyanate and a yeast extract containing a sulfur-containing compound are reacted in an aqueous medium.
  • [2] The production method according to [1], wherein the aqueous medium is an aqueous medium containing ethanol.
  • a composition for promoting the production of glutathione comprising, as an active ingredient, a compound in which an isothiocyanate and a sulfur-containing compound are bonded by a dithiocarbamate structure or a salt thereof.
  • composition for promoting glutathione production according to [10] or [11], wherein the sulfur-containing compound is at least one selected from glutathione, cysteine, ⁇ -glutamylcysteine and salts thereof.
  • a whitening composition comprising a compound in which an isothiocyanate and a sulfur-containing compound are bonded in a dithiocarbamate structure or a salt thereof as an active ingredient.
  • An antioxidant composition comprising, as an active ingredient, a compound in which an isothiocyanate and a sulfur-containing compound are bonded with a dithiocarbamate structure or a salt thereof.
  • a method for promoting glutathione production comprising administering to a subject an effective amount of a compound in which isothiocyanate and a sulfur-containing compound are bound by a dithiocarbamate structure or a salt thereof.
  • a whitening method comprising administering to a subject an effective amount of a compound in which an isothiocyanate and a sulfur-containing compound are bonded by a dithiocarbamate structure or a salt thereof.
  • a method for suppressing oxidative stress comprising administering to a subject an effective amount of a compound or a salt thereof in which an isothiocyanate and a sulfur-containing compound are bonded in a dithiocarbamate structure.
  • stimulation containing the compound couple
  • the composition for promoting glutathione production containing components bonded with a dithiocarbamate structure is highly stable, has no specific odor and irritation derived from isothiocyanates and sulfur-containing compounds, and differs from oily isothiocyanates mainly. Since it is in powder form, it has excellent workability and is advantageous for formulation.
  • the present invention by increasing the amount of glutathione in the living body, it is possible to prevent diseases such as arteriosclerosis, diabetes, drug addiction, ischemic heart disease, immune disease, cancer, Alzheimer's disease, etc. On the other hand, it can be prevented and treated. Further, since it has a whitening effect such as prevention and improvement of pigmentation such as spots and freckles, and a skin beautifying effect such as prevention and improvement of wrinkles by eliminating active oxygen, it can be effectively applied to the cosmetics field.
  • the LC chromatogram of UV254nm of the erucine-cysteine conjugate and the fractionated erucine-glutathione conjugate is shown.
  • the upper figure shows the UV spectrum with a retention time of 7.93 minutes, and the lower figure shows the UV spectrum with a retention time of 9.38 minutes.
  • the upper figure shows an MS spectrum with a retention time of 7.93 minutes, and the lower figure shows an MS spectrum with a retention time of 9.38 minutes.
  • a comparison of the content of erucine-glutathione conjugates by the amount of yeast extract added is shown.
  • the vertical axis represents the area value (unit: ⁇ V seconds).
  • the erucic acid and erucine-glutathione conjugate content relative to the ethanol content of the extraction solvent is shown.
  • the vertical axis represents the area value (unit: ⁇ V seconds).
  • the comparative examination result of the erucine-glutathione conjugate content by heating temperature and reaction time is shown.
  • the vertical axis represents the area value (unit: ⁇ V seconds).
  • the comparative examination result of the erucine-glutathione conjugate content by the amount of extraction solvents is shown.
  • the vertical axis represents the area value (unit: ⁇ V seconds).
  • the amount of black melanin released from cells by erucine-cysteine conjugate and kojic acid is shown.
  • the change in the content of the erucine-cysteine conjugate during storage at 25 ° C. is shown.
  • the present invention is characterized in that a plant material containing isothiocyanate and a yeast extract containing a sulfur-containing compound are mixed and the mixture is reacted in an aqueous medium, wherein the isothiocyanate and sulfur-containing compound have a dithiocarbamate structure.
  • the present invention relates to a method for producing a bonded compound (hereinafter sometimes abbreviated as the production method of the present invention).
  • the present invention also relates to a composition for promoting the production of glutathione, characterized in that it comprises (A) an isothiocyanate and (B) a compound in which a sulfur-containing compound is bound by a dithiocarbamate structure or a salt thereof as an active ingredient (hereinafter referred to as the present invention). It may be abbreviated as glutathione production promoter of the invention).
  • An isothiocyanate is an animal or plant natural product containing an isothiocyanate, which is obtained by dry crushing or an extract extracted with a solvent, a chemical synthesis method, a fermentation method, or a genetic recombination method. Either may be used.
  • isothiocyanate examples include sulforaphane, erucine, benzyl isothiocyanate, allyl isothiocyanate, 6-methylsulfinylhexyl isothiocyanate, and salts thereof.
  • Preferred are sulforaphane, erucine, benzyl isothiocyanate, allyl isothiocyanate, 6-methylsulfinyl hexyl isothiocyanate, and more preferred are sulforaphane and erucine.
  • Plant materials containing isothiocyanate include the Brassicaceae Brassica genus (Brassica sp.), The Brassicaceae Brassica genus (Erucca sp.), The Brassicaceae Levidium genus (Lepidium sp.), And the Papaya family Papaya (Carica sp.). And plants such as Brassicaceae (Wasabia sp.).
  • Brassica Brassica (Brassica oleracea var. Italica), cabbage (Brassica oleracea var.capitata), cauliflower (Brassica oleraceavar.botrytis), rape (Brassia rapa var. Nippo-oleifera), taasai (Brassica camp var. .chinensis), Komatsuna (Brassica rapa var. peruviridis) and the like, preferably broccoli.
  • Examples of the plant-derived component such as Brassica sp. Include sulforaphane or a salt thereof.
  • Examples of the plants of the Brassicaceae genus Evanaceae include Arugula (Erucca sativa), Erucca vesicaria, and preferably Arugula.
  • Examples of the plant-derived component such as Brassicaceae (Erucca sp.) Include erucin represented by the following chemical formula (I) or a salt thereof.
  • the plants of the Brassicaceae Levidium genus include Maca (Lepidium meyenii), Pepper (Lepidium sativum), Himegunbaina (Lepidium apetalum), preferably Maca (Lepidium meyenii),
  • papaya Carica papaya
  • the plant-derived component of the Papaya Family Carica sp. include benzylisothiocyanate or a salt thereof.
  • Examples of plants of the Brassicaceae genus Wasabi sp. Include wasabi (Wasabia japonica) and the like, with wasabi being preferred.
  • Examples of plant-derived components such as Brassicaceae (Wasabia sp.) Include allyl isothiocyanate, 6-methylsulfinyl hexyl isothiocyanate, and salts thereof.
  • sulfur-containing compounds examples include glutathione, cysteine, ⁇ -glutamylcysteine, and salts thereof.
  • the sulfur-containing compound may be a natural product as it is, dried and crushed, or an extract extracted with a solvent, a chemical synthesis method, peptide synthesis, or a synthesized product of Escherichia coli.
  • (B) When (B) is derived from a natural product, those derived from fermentation products such as Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida and the like can be mentioned. Of these, those derived from fermentation products of the genus Saccaromyces are preferred. Examples of those derived from fermented products of the genus Saccaromyces include yeast extract and yeast extract with a high content of ⁇ -glutamylcysteine.
  • yeast extracts containing sulfur-containing compounds yeast extracts belonging to the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae, yeasts belonging to the genus Candida such as Schizosaccharomyces pombe, etc. Yeast extracts derived from yeast are preferred.
  • cysteine used in the present invention any of L-form, D-form, and a mixture thereof (for example, racemate) can be used, but L-form is preferably used.
  • the active ingredient is a compound or a salt thereof in which (A) and (B) are bound by a dithiocarbamate structure.
  • the method for producing the compound include a method of synthesizing by a method known per se and a method of using natural products (A) and (B).
  • the seeds of arugula Eruca sativa
  • an aqueous solution usually adjusted to pH 6-11, preferably pH 7-9.
  • Add Preferably, a 1/2 to 2 times amount, preferably an equal amount of solvent is then added to the aqueous solution.
  • the mixture is filtered through a 100-200 mesh filter cloth to obtain a reaction solution.
  • the product obtained by the reaction can be purified by a conventional method such as chromatography.
  • aqueous medium may be used as long as it belongs to the category known as an aqueous medium, and examples thereof include distilled water, ion-exchanged water, industrial water, and clean water. Further, it may contain an organic solvent.
  • Organic solvents include lower alcohols such as methanol, ethanol, propanol and isopropanol, polyhydric alcohols such as 1,3-butanediol, propanediol, dipropanediol and glycerin, ethers such as diethyl ether and dipropyl ether, ethyl acetate , Esters such as butyl acetate, ketones such as acetone and ethyl methyl ketone, and organic solvents such as chloroform, dichloromethane, acetonitrile and hexane can be used, and one or more of these can be selected and used.
  • physiological saline phosphate buffer, phosphate buffered physiological saline, or the like
  • the organic solvent is preferably lower alcohol, 1,3-butanediol, glycerin, ethers, ethyl acetate, acetone, chloroform, dichloromethane, acetonitrile and hexane, more preferably lower alcohol, ethers, etc., methanol, ethanol, Diethyl ether is particularly preferred.
  • aqueous media from the viewpoint of removing erucic acid from the reaction product, 30 to 60% (v / v) aqueous ethanol is preferable, and 30 to 50% (v / v) aqueous ethanol is more preferable. Particularly preferred is 40-50% (v / v) hydrous ethanol.
  • natural products containing isothiocyanates can be used as they are, or dried and crushed, and extracted with a solvent or the like. Further, a powder obtained by crushing or grinding natural products such as arugula seeds and an extract extracted with a solvent can be used as an isothiocyanate. Generally, it is prepared by the following method. A powder obtained by pulverizing or grinding a natural product containing isothiocyanates is prepared, and extraction is performed by immersing in an extraction solvent. In order to increase the extraction efficiency, the mixture may be stirred or homogenized in an extraction solvent. The extraction temperature can be performed at room temperature or under heating, and is suitably from about 1 ° C.
  • the boiling point of the extraction solvent usually 1 ° C. to 100 ° C., preferably 20 ° C. to 90 ° C. .
  • the extraction time varies depending on the plant to be extracted, the type of extraction solvent, and the extraction temperature, but it is appropriate that the extraction time be about 4 hours to 14 days. Examples of the extraction solvent are the same as those described above.
  • the raw material which heat-processed the natural product containing isothiocyanates can also be used. Since the heat-treated raw material can be stored for a long time, it is useful in industrial production.
  • the heating method is not particularly limited, but natural products such as arugula seeds are immersed in hot water at 80 ° C. to 100 ° C.
  • the natural product thus heat-treated is pulverized or ground to prepare a powder, which can be used, or extracted from the powder with an extraction solvent.
  • a heat-treated raw material a non-heat-treated natural product having a myrosinase enzyme source is crushed or ground and mixed with water, or mixed with a myrosinase enzyme and mixed under the conditions described above.
  • a compound bonded with a dithiocarbamate structure can be obtained by adding and reacting an extract.
  • Examples of the compound include erucine-cysteine conjugate, erucine-glutathione conjugate, erucine- ⁇ -glutamylcysteine conjugate, sulforaphane-cysteine conjugate, sulforaphane-glutathione conjugate, sulforaphane- ⁇ -glutamylcysteine conjugate, benzylisothiocyanate -Cysteine conjugate, benzylisothiocyanate-glutathione conjugate, benzylisothiocyanate- ⁇ -glutamylcysteine conjugate, allyl isothiocyanate-cysteine conjugate, allyl isothiocyanate-glutathione conjugate, allyl isothiocyanate- ⁇ -glutamylcysteine conjugate 6-methylsulfinylhexyl isothiocyanate-cysteine conjugate, 6-methylsulfinylhexyl is
  • Particularly preferred specific examples of the compound include erucine-cysteine conjugate, erucine-glutathione conjugate, and erucine- ⁇ -glutamylcysteine conjugate.
  • the above compounds or salts thereof are contained as active ingredients.
  • the above compound can be used in the form of a salt.
  • salts include salts with inorganic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and the like, and it is preferable to select salts that are acceptable for pharmaceuticals, foods and drinks, and the like.
  • the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium, potassium and lithium, alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium, and ammonium salts.
  • Examples of the salt with an inorganic acid include salts with hydrohalic acid (hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, etc.), sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like.
  • salt with an organic acid include salts with formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, and citric acid.
  • the compound bound with the dithiocarbamate structure may be the extract obtained from the natural product such as the plant as it is, or the concentrated and dried solid may be dissolved again in water or an organic solvent, or decolorized or deodorized. Further, it may be subjected to a purification treatment such as desalting or a fractionation treatment by column chromatography using an ion exchange resin or the like. For storage, it can be freeze-dried after purification and dissolved in a solvent before use.
  • a purification treatment such as desalting or a fractionation treatment by column chromatography using an ion exchange resin or the like. For storage, it can be freeze-dried after purification and dissolved in a solvent before use.
  • any of those obtained by the above method, chemical synthesis methods, natural products derived from animals and plants, those obtained by fermentation methods or gene recombination methods may be used.
  • a compound bound with a dithiocarbamate structure in the glutathione production promoter of the present invention, as an active ingredient, a compound bound with a dithiocarbamate structure, the extract of the plant or the treated product as it is, or an aqueous carrier such as water or lower alcohol, emulsion, gel, cream It can also be contained in a base such as, powdered or granulated, or encapsulated in vesicles such as liposomes or microcapsules.
  • the glutathione production accelerator of the present invention includes cellulose and derivatives thereof such as crystalline cellulose and hydroxypropylcellulose, starch and derivatives thereof such as wheat starch, corn starch, sodium carboxymethyl starch and dextrin, natural gums such as gum arabic and sodium alginate.
  • Excipients such as high molecular weight compounds, sugars such as glucose, maltose, sorbitol, maltitol, mannitol and derivatives thereof, inorganic salts such as sodium chloride, calcium carbonate, magnesium silicate; guar gum, synthetic aluminum silicate, stearic acid, High molecular weight polyvinyl pyrrolidone, binders such as lactose; lubricants such as talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 6000; disintegrants such as adipic acid, calcium stearate, sucrose; Surfactants such as sucrose fatty acid ester, soybean lecithin, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene monostearate ester; thickeners such as sodium carboxymethylcellulose, carboxyvinyl polymer, xanthan gum, gelatin; ethyl acrylate / methacrylic acid Acid methyl copolymer dispersions, caramel, carnauba wax, shellac,
  • the glutathione production promoter of the present invention may further contain other active ingredients.
  • active ingredients include cystine, theanine, cysteine, glutamic acid, coenzyme Q10, ⁇ -lipoic acid, flavonoids, polyphenols, plant extracts and the like, and cystine is preferred.
  • the administration form (or food intake form) of the glutathione production promoter of the present invention may be oral administration, intravenous administration, injection administration (intravenous administration), parenteral administration (ingestion) such as external use, and is not particularly limited. .
  • a solution containing the active ingredient can be sprayed nasally or administered as an injection.
  • the active ingredient may be dispersed in various bases and formulated by conventional methods. Examples of such bases include petrolatum, liquid paraffin, and myristin.
  • fatty acid esters such as isopropyl acid and octyldodecyl myristate, higher alcohols such as squalane, lanolin and cetanol, oily bases such as silicone oil and animal and vegetable oils, lower alcohols such as ethanol, polyethylene glycol, propylene glycol and many others Monohydric alcohols, ⁇ -monoglyceryl ether, lecithin, sorbitan fatty acid ester, dextrin fatty acid ester, fatty acid monoglyceride, fatty acid metal salt, emulsifier or stabilizer such as magnesium sulfate, fragrance, preservative, pigment, thickener, oxidation Inhibitor, UV protection Agents, wound healing agents, anti-inflammatory agents, various medicinal agents such as humectants, and water.
  • the glutathione production promoter of the present invention can be added to an external preparation as an antioxidant in the skin and provided as an external medicine, quasi-drug, cosmetic or the like.
  • the glutathione production promoter of the present invention is human, non-human animals [eg, non-human mammals (domestic animals such as pigs, cows, horses, dogs, pets), birds (poultry such as turkeys, chickens, etc.) Etc.] is useful. It can also be added to veterinary drugs and animal feed.
  • the content of the active ingredient is one or more of the above-mentioned compounds or salts thereof, as well as plant extraction conditions, addition forms, dosage forms, and administration forms based on the total weight of the promoter.
  • the content is usually 0.01% by weight or more, preferably 0.1% by weight or more, more preferably 1% by weight or more, and usually 100% by weight or less, preferably 10% by weight or less, more preferably 5% by weight. % Or less.
  • the erucic acid content is usually 10 ppm or less, preferably 5 ppm or less, more preferably 1 ppm or less, based on the total weight of the accelerator.
  • the glutathione production promoter of the present invention is used for the prevention and treatment of diseases such as antioxidant use, arteriosclerosis deeply related to antioxidant action, diabetes, drug addiction, ischemic heart disease, immune disease, cancer, Alzheimer's disease, etc. It can be used for skin whitening such as prevention and improvement of pigmentation such as buckwheat, and skin care such as prevention and improvement of wrinkles by eliminating active oxygen.
  • Antioxidant use means elimination of active oxygen and protection from cell damage caused by active oxygen.
  • the daily dose is usually in the range of 1 ⁇ g / kg body weight to 100 mg / kg body weight, and 1 mg / kg body weight to 100 mg / kg when administered orally.
  • the range of body weight is preferable, and the range of 3 mg / kg body weight to 60 mg / kg body weight is more preferable.
  • the oral dose is usually in the range of 0.01 mg / kg body weight to 2 mg / kg body weight per adult day, and 0.05 mg / kg body weight to 0 A range of .5 mg / kg body weight is preferred.
  • the oral dose when the active ingredient is an erucine-glutathione conjugate, the oral dose is usually in the range of 0.01 mg / kg body weight to 2 mg / kg body weight per adult day, and 0.05 mg / kg body weight to 0 mg / kg body weight. A range of .6 mg / kg body weight is preferred.
  • the oral dose when the active ingredient is erucine- ⁇ -glutamylcysteine conjugate, the oral dose is usually in the range of 0.01 mg / kg body weight to 2 mg / kg body weight per adult, 0.05 mg / kg A range of body weight to 0.6 mg / kg body weight is preferred.
  • the daily dose can be administered at once or divided into several times. The administration period is not particularly limited. The amount per adult can be appropriately changed in consideration of body conditions such as sex, age, and disease.
  • the daily dose is usually 1 ⁇ g / kg body weight to 100 mg of the active ingredient in the case of oral administration.
  • / Kg body weight preferably 1 mg / kg body weight to 100 mg / kg body weight, more preferably 3 mg / kg body weight to 60 mg / kg body weight.
  • the specific dose of the erucine-cysteine conjugate and the like is the same as the above dose.
  • generation promoter of this invention Although it does not specifically limit as a foodstuff which added the glutathione production
  • the above “food” means food in general, but also includes foods for specified health and functional nutritional foods defined in the Health Functional Food System of the Consumer Affairs Agency, in addition to general foods including so-called health foods.
  • dietary supplements are also included.
  • the glutathione production promoter of the present invention can also be applied to feed applications, and can be added to poultry, livestock, etc. and added to normal feed.
  • the amount of the glutathione production promoter of the present invention contained in food is not particularly limited, but the amount of food per day is within the same range as the above dose of the active ingredient of the glutathione production promoter of the present invention. It is preferable to do this.
  • the glutathione production promoter of the present invention When using the glutathione production promoter of the present invention as a food, in addition to health foods that are ingested by paying attention to the specific functions of the present invention, foods for specific health and nutritional functional foods defined in the health functional food system And dietary supplements are also included.
  • the amount of the active ingredient contained in the food is not particularly limited, but it is preferable that the amount of food / drink per day be in the same range as the above dose in the glutathione production promoter of the present invention.
  • the form of the health functional food of the glutathione production promoter of the present invention is not particularly limited.
  • the food in the present application is a form in which the active ingredient is packaged in the form of an ingested unit amount per meal, a form in which a drink in which the active ingredient is suspended or dissolved is filled in a bottle or the like in the form of a drink per meal Is mentioned.
  • the dose per meal may be the daily dose shown above.
  • the intake amount of the active ingredient of the unit is usually preferably 6 mg to 120 mg, 9 mg to 90 mg, more preferably 12 mg to 60 mg, and more preferably 12 mg to 40 mg. Particularly preferred.
  • the intake amount of the active ingredient in the unit is usually preferably 3 mg to 60 mg, 4.5 mg to 45 mg, more preferably 6 mg to 30 mg, particularly preferably 6 mg to 20 mg. preferable.
  • a glutathione production promoter comprising a unit packaging form per serving, and containing 3 mg to 60 mg of erucine-cysteine conjugate as an active ingredient and 6 mg to 120 mg of an active ingredient as a single intake in the unit. preferable.
  • a method for producing a compound in which an isothiocyanate and a sulfur-containing compound are bonded in a dithiocarbamate structure characterized in that a plant material containing an isothiocyanate and a yeast extract containing a sulfur-containing compound are reacted in an aqueous solvent.
  • the starting material in the production method of the present invention is a plant material containing the above isothiocyanate, a yeast extract containing the above (A) and a sulfur-containing compound, or a natural product described in the above (B), or J. Med. Chem. 1997, 40, 1186-1194 and Chem. Biol. Interaction, 84 (1992) 277-290 may be prepared by known processes.
  • the raw material compound (A) or (B) may be used as a salt, and examples of such a salt include the same salts as those of the compound.
  • the compound obtained in each of the following steps may be used in the next reaction as a reaction solution or as a crude product, or may be used in a known separation and purification means, for example, concentration, concentration under reduced pressure, solvent extraction, crystallization, It may be isolated and purified from the reaction solution by recrystallization, transfer dissolution, chromatography, etc. and used in the next reaction. Moreover, when the following compounds are marketed, a commercial item can also be used as it is.
  • an isothiocyanate-containing plant material or a natural product-derived isothiocyanate as (A), use a plant material containing an isothiocyanate or a natural product as it is, or a material obtained by drying and crushing, and using an extract extracted with a solvent or the like. I can do it. For example, arugula (Eruca sativa) seeds are crushed as they are, and water is added and mixed. The amount of the necessary solvent (water) relative to the seed weight is usually 2.5 to 20 times, preferably 2.5 to 10 times, more preferably 2.5 to 5 times the seed weight. Add water and mix. The resulting mixture (aqueous solution) is usually adjusted to pH 6-11, preferably pH 7-9.
  • the pH may be adjusted after adding yeast extract or the like.
  • a yeast extract containing a sulfur-containing compound or (B) a sulfur-containing compound, such as a yeast extract derived from a natural product is added, and a 1/2 to 2-fold amount, preferably an equivalent amount of solvent is added to the reaction product.
  • the solvent the above-mentioned aqueous solvent, organic solvent, water, or a mixed solvent thereof can be preferably used. From the viewpoint of reducing the undesired erucic acid content, 30 to 60% (v / v) water-containing ethanol is preferable, 30 to 50% (v / v) is preferable, and 40 to 50% (v / v) water content is preferable.
  • Ethanol is more preferred.
  • the standing or stirring is usually carried out at 10 to 80 ° C., preferably 20 to 40 ° C., usually for 1 hour to 12 hours, preferably 3 hours to 5 hours. More preferably, at 20 ° C., 2 hours to 9 hours, particularly preferably 5 hours to 9 hours, and at 30 ° C., 1 hour to 5 hours, particularly preferably 3 hours to 4 hours, 40 ° C.
  • the reaction is carried out for 0.5 to 3 hours, particularly preferably for 0.5 to 2 hours.
  • a reaction solution is obtained by a method such as filtration with a 100-200 mesh filter cloth.
  • each reactant can be obtained as a single product by a separation method known per se such as chromatography.
  • A) derived from a plant body and (B) derived from a fermentation product of the genus Saccaromyces.
  • Particularly preferred plants and the definitions of (A) and (B) are the same as above.
  • a glutathione production promoting method comprising administering to a subject an effective amount of a compound in which an isothiocyanate and a sulfur-containing compound are bonded in a dithiocarbamate structure or a salt thereof.
  • Examples include methods for suppressing oxidation in the body.
  • the whitening method means a method for preventing or improving spots and freckles due to melanin production.
  • the method of suppressing oxidative stress is a state in which the balance between the biological action in which active oxygen is produced and exerts a disordered action and the biological action in which the biological system directly detoxifies active oxygen or repairs the disorder that has occurred That is, it is a method for suppressing oxidative stress, which means a state in which the normal redox state of biological tissue is disturbed, and a method for suppressing the production of peroxides and free radicals.
  • arteriosclerosis, diabetes, drug addiction, ischemic heart disease characterized in that an effective amount of a compound in which isothiocyanate and a sulfur-containing compound are bonded with a dithiocarbamate structure or a salt thereof is administered to a subject.
  • a method for preventing or treating a disease selected from the group consisting of immune disease, cancer and Alzheimer's disease, a method for suppressing skin photoaging, a method for suppressing melanin release, a method for preventing or improving pigmentation such as spots and freckles, and a method for preventing wrinkles Or the improvement method etc. are mentioned.
  • a disease selected from the group consisting of immune disease, cancer and Alzheimer's disease a method for suppressing skin photoaging, a method for suppressing melanin release, a method for preventing or improving pigmentation such as spots and freckles, and a method for preventing wrinkles Or the improvement method etc.
  • a disease selected from the group consisting of immune disease, cancer and Alzheimer's disease
  • a method for suppressing skin photoaging a method for suppressing melanin release
  • a method for preventing or improving pigmentation such as spots and freckles
  • a method for preventing wrinkles Or the improvement method etc. are mentioned.
  • Example 1 Elsine (50 mg) and L-cysteine (100 mg) were dissolved in 100 mL of purified water and 100 mL of acetonitrile, adjusted to pH 8 with an aqueous sodium hydroxide solution, allowed to stand at 25 ° C. for 60 minutes, and then 200 mL of acetonitrile was added. A sample obtained by concentrating and drying this reaction solution under reduced pressure was dissolved in 50% acetonitrile aqueous solution and purified by preparative HPLC under the following conditions to obtain an erucine-cysteine conjugate (molecular weight 282) having the following structure. It was.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, erucine (50 mg) and glutathione (300 mg) were dissolved in 50 mL of purified water and 50 mL of acetonitrile, adjusted to pH 8 with an aqueous sodium hydroxide solution, and allowed to stand at 25 ° C. for 60 minutes. The solution was concentrated to dryness under reduced pressure, dissolved in a small amount of 50% aqueous acetonitrile, and purified by preparative HPLC under the following conditions to obtain an erucine-glutathione conjugate (molecular weight 468) having the following structure. It was.
  • the compound was identified by preparing a solution in which the erucine-cysteine conjugate prepared in Example 1 and the fractionated erucine-glutathione conjugate were mixed and analyzed by LC / DAD / MS. As a result, as shown in FIGS. 1, 2, and 3, the erucine-cysteine conjugate was confirmed at a retention time of 7.93 minutes, and the component presumed to be an erucine-glutathione conjugate was confirmed at a retention time of 9.38 minutes.
  • the component having a retention time of 9.38 minutes shows a UV spectrum having absorption at ⁇ max of about 250 nm and 267 nm, which is characteristic of the dithiocarbamate structure as in the case of the erucine-cysteine conjugate, and the molecular ion peak [M + H] + m / z 469 As a result, it was identified that the fractionated component was an erucine-glutathione conjugate.
  • Example 3 After grinding 1 g of arugula seeds in a mortar, add 7 mL of purified water, and further add 0.25 g of yeast extract powder (alomolyd UG-8) and mix. After adjusting the pH to 8 with an aqueous sodium hydroxide solution, 7 mL of ethanol was added and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 3 hours. The reaction solution was filtered through a filter paper (Toyo No. 2) and then freeze-dried to obtain 250 mg of powder.
  • yeast extract powder alomolyd UG-8
  • Example 4 After grinding 1 g of arugula seeds in a mortar, 7 mL of purified water is added, and 0.5 mL of a ⁇ -glutamylcysteine-containing yeast extract solution (Ajinomoto Co., Inc.) is added and mixed. After adjusting the pH to 8 with an aqueous sodium hydroxide solution, 7 mL of ethanol was added and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 3 hours. The reaction solution was filtered through a filter paper (Toyo No. 2) and then freeze-dried to obtain 270 mg of powder.
  • a filter paper Toyo No. 2
  • Example 2 10 mg of the powder was weighed and dissolved in 0.1 mL, and a sample solution obtained by diluting 1 ⁇ L of the solution with 99 ⁇ L of pure water was analyzed under the same LC / DAD / MS conditions as in Example 2 to obtain erucine and cysteine.
  • a conjugate (molecular weight 282), erucine and ⁇ -glutamylcysteine conjugate (molecular weight 411), erucine and glutathione conjugate (molecular weight 468) were detected, and the erucine-cysteine conjugate prepared in Example 1 was used as a standard reagent.
  • Quantitative analysis was performed using a wavelength of UV254 nm, and the erucine-cysteine conjugate content was 0.59%, the erucine- ⁇ -glutamylcysteine conjugate content was 0.28%, and the erucine-glutathione conjugate content was 0.28%. confirmed.
  • Example 5 As a study for setting the amount of yeast extract to be added to arugula seeds containing about 1% of erucin, 0.5 g of arugula seeds (erucin content 30 ⁇ mol) was ground in a mortar and then purified water. 2 mL was added, and 0.060 g (glutathione content: 10 ⁇ mol), 0.125 g (glutathione content: 20 ⁇ mol), 0.25 g (glutathione content: 40 ⁇ mol), 0.02 g of yeast extract powder (aromiled UG-8, glutathione content: 5%).
  • Samples were prepared by adding 5 g (glutathione content 80 ⁇ mol) and 1.0 g (glutathione content 160 ⁇ mol) and mixed. After adding 2 mL of ethanol, the mixture was adjusted to 10 mL with a 50% ethanol-containing solvent. Then, it adjusted to pH 8 with sodium hydroxide aqueous solution, and left still at 25 degreeC for 4 hours. The solution obtained by centrifugal filtration of this solution was analyzed under the following LC conditions, and the erucine and glutathione-binding substance was qualitatively used as an index with a standard product of erucine-glutathione conjugate synthesized in the same manner as in Example 1, Content was compared using the area value about a component.
  • Example 6 As a study of the solvent for avoiding the inclusion of erucic acid, a harmful substance, 0.5 g of arugula seeds were ground in a mortar, 2 mL of purified water was added, and yeast extract powder (alomolyd UG-8) 0 Add 125 g and mix.
  • the amount of ethanol added is 1 mL (ethanol content 33% v / v), 1.5 mL (43%), 2 mL (50%), 4 mL (60%), 5 mL ( 71%) and 8 mL (80%) were divided into 6 types, and after addition, each solution was adjusted to 10 mL with a hydrous ethanol solvent prepared to have the same ratio. Then, it left still at 25 degreeC for 3 hours. The solution obtained by centrifugal filtration of this solution was analyzed under the following LC conditions.
  • Example 7 In order to measure the erucic acid content, a sample solution was prepared by adding 100 ⁇ L of 80% ethanol to 10 mg of the extract powder prepared from arugula seeds and yeast extract prepared in Example 2, and the erucic acid content was determined under the following conditions. It was measured. As a standard solution, an erucic acid reagent (Tokyo Kasei) was dissolved in 80% ethanol to prepare 5 ⁇ g / mL, and 1, 2, 4 ⁇ L were injected to prepare a calibration curve and quantified. As a result of the measurement, erucic acid was found to be 0.8 ppm in the powder prepared from arugula and yeast extract prepared in Example 2, and the harmful erucic acid content was an unaffected concentration. I was able to confirm.
  • an erucic acid reagent Tokyo Kasei
  • Example 8 As a study for setting the temperature in the process of preparing the arugula seeds and yeast extract preparation, 0.5 g of arugula seeds (erucin content 30 ⁇ mol) were ground in a mortar, then 5 mL of purified water was added, Further, 0.25 g (glutathione content 40 ⁇ mol) of yeast extract powder (aromild UG-8, glutathione content of about 5%) was added and mixed, and 5 mL of ethanol was added. Thereafter, the pH is adjusted to 8 with an aqueous sodium hydroxide solution at 20 ° C., 30 ° C., 40 ° C. and 50 ° C. for 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 hours.
  • Example 9 As a study for setting the amount of solvent required for the preparation of arugula seeds and yeast extract, 0.5 g of arugula seeds (erucin content 30 ⁇ mol) were ground in a mortar and then 2.5 times the seed weight. 1.25 mL, 1.7 mL, 2.5 mL, 5 mL, and 10 mL of purified water are added so that the amount is 3.4, 5, 10, and 20 times, and the yeast extract powder (allo is added to each sample. Mild UG-8, glutathione content 5%) 0.25 g (glutathione content 40 ⁇ mol) was added to prepare a mixed sample, and a sample solution to which the same amount of ethanol as purified water was added was prepared.
  • Results are shown in FIG.
  • the content of the erucine-glutathione conjugate is almost the same up to 5 mL, which is 10 times the amount of the solvent with respect to the seed weight, but when the amount is 20 times, 1.1 times and 40 times the amount, The amount has increased by about 1.2 times. It was suggested that the required minimum amount can be sufficiently reacted with a solvent 5 times the amount of the seed weight.
  • Test Example 1 In order to evaluate the glutathione-producing ability of the samples prepared in Examples 2 and 3 and the samples prepared in the same manner as in Examples 2 and 3 including the conjugate, the following materials were examined. It was. Note that cystine was used as a positive control.
  • B16 melanoma was cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (high glucose, containing 10% serum). Confluent cells were detached with trypsin and seeded in a 96-well plate. The next day, after the cells adhered to the plate, the sample shown in Table 2 was replaced with the DMEM medium added to the indicated concentration and cultured for 3 days. As a control, no sample was added. After incubation, the medium is discarded, and 200 ⁇ L of PBS buffer is added per well of the plate, washed and discarded.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Test Example 2 In order to confirm the combined effect of the samples prepared in Examples 2 and 3 and cystine, the evaluation of glutathione production ability was performed.
  • B16 melanoma was cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (high glucose, containing 10% serum). Confluent cells were detached with trypsin and seeded in a 96-well plate. On the next day, after the cells adhered to the plate, the samples shown in Table 3 were added so as to have the indicated concentrations, and further replaced with DMEM medium added to all samples to 0.15 mM cystine and cultured for 3 days. . The control was a sample to which only cystine was added.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Example 3 In order to confirm the whitening effect of the erucine-cysteine conjugate prepared in Example 1, the following test was conducted. B16 melanoma was cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (high glucose, containing 10% serum). Confluent cells were detached with trypsin and seeded in a 96-well plate. On the next day, after the cells adhered to the plate, the medium was replaced with each sample (control (no sample added), erucine-cysteine conjugate, and DMEM supplemented with kojic acid at a concentration shown in FIG. 8), and cultured for 3 days.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Example 4 The erucine-cysteine conjugate prepared in Example 1 was confirmed to change in content when stored at 25 ° C. in a cool and dark place. A 1 mg sample was weighed out, and a solution made up with 5 mL of 50% acetonitrile aqueous solution was subjected to LC analysis under the following conditions to confirm the change in the content. As shown in FIG. 9, the result was detected as an increasing tendency due to the content error. However, no decrease in content was confirmed even at about 24 weeks (6 months).

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Abstract

　本発明は、生体内における酸化ストレス防御及び解毒作用を有するグルタチオン生成促進作用を有する化合物の製造方法を提供することを目的とする。　イソチオシアネートを含有する植物素材及び含硫化合物を含有する酵母エキスを水性媒体中で反応させることを特徴とする、イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物の製造方法。

Description

グルタチオン生成促進用組成物
　本発明は、イソチオシアネートを含有する植物素材及び含硫化合物を含有する酵母エキスとの反応物を水性媒体中で反応させることを特徴とするジチオカーバメート構造で結合した化合物の製造方法に関する。また当該化合物を有効成分とするグルタチオン生成促進用組成物、美白用組成物および抗酸化用組成物に関する。
　従来より、生体内の抗酸化能は、様々な疾患との関連性が知られており、カテキンを始めとするポリフェノールやビタミンＣなどの摂取が推奨されている。一方で、これらの成分は、食事による一過性の抗酸化作用であるため、継続的な摂取が求められている。本来、生体内にはグルタチオンという抗酸化作用を担う成分が多量に含まれているが、この成分は加齢とともに減少し、それに伴い免疫力の低下、癌の発症率上昇などが確認されている。その為、グルタチオンの生成を促進させ、グルタチオン量を増加させることは、健康を維持するために重要な要因であると考えられており、これまでに様々なグルタチオン産生促進素材が見出されている。
　イソチオシアネート類については、生体内での解毒酵素の誘導、免疫賦活作用、抗癌作用などをはじめ、数多くの有用性が報告されており、その構造をベースとした医薬品の開発が行われるなど、産業的利用価値は大きい（非特許文献１）。また、機能性研究の結果、解毒酵素誘導に関連して、生体内のグルタチオン産生を促進することが見出されており、マルチな機能を有する成分として期待されている。
　しかしながら、スルフォラファンなどのイソチオシアネート類は、定常状態でも水分等と反応するなど不安定な性質を有すること、油状物質であること、さらにイソチオシアネート特有の匂いと刺激があることなど、そのままの状態では化粧料や食品としての利用は困難であった。
　また、天然物中のイソチオシアネート類は、配糖体構造であるグルコシノレートと呼ばれる安定な構造で蓄積されており、植物体の細胞が破砕などを受けることにより、細胞内のミロシナーゼという酵素が働き、グルコシノレートからイソチオシアネートが生成されてくる。すなわち、グルコシノレート構造であれば、非常に安定に存在している。そこで産業的な利用を行う為に、その生成過程を考慮し、酵素反応を阻害する為に、抽出時の破砕工程時に加熱処理を行って酵素を失活させ、前駆体の構造を含有する抽出物等を得るなどの工夫がなされている。しかしながら、イソチオシアネートそのものに比べてグルコシノレートの生体内での利用効率は約20～30%程度とも言われ、より根本的で有効な解決手段が求められていた。
　また、イソチオシアネート類を利用するにあたり、天然物中では種子に高含有されていることが知られている。しかし種子中には心臓疾患に関わると推測されているエルカ酸が含まれている関係上、直接的に利用することが困難であった。これまでは、天然物中のエルカ酸は、発芽過程で減少することが知られていることから、発芽後に抽出するなどの工夫がされており、産業利用上、製法を含めたさらなる改善が求められている。
　一方で、化粧料の分野に関しては、美白効果等を付与することを目的として、乳液、クリーム、化粧水、パック、液剤、エアゾール等の化粧料にはアスコルビン酸、コウジ酸、グルタチオン、ハイドロキノン、システイン等の美白剤が加えられているが、近年、スルフォラファンなどのイソチオシアネートを含む発芽ブロッコリーにも美白作用、細胞賦活作用によるシワ、タルミなどの抗老化作用を有することが明らかになり、注目されている（特許文献１、２、３）。
　他方、化粧料などで使用されているシステインは、抗酸化作用を示し、かつ美白成分として長い使用実績のある機能性成分であるが、チオール基を有することから特有の硫黄臭があり、かつジスルフィド結合により酸化型に変化してしまうので成分の安定性が悪いことが課題であった。その為、経口投与や塗布する化粧料等の外用としての使用は困難であり、改良が求められている。
特開2003-155221号公報 特開2007-31297号公報 特開2009-114152号公報
Mutation Research (2004),555 173-190
　本発明では、抗酸化作用及び細胞解毒性を有し色素沈着又はしわの予防又は改善（美肌及び美白）に有効であり、匂いや刺激がなく安全で生体内での利用効率が高いグルタチオン生成促進剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ルッコラの種子などの天然物に含有するイソチオシアネート類と、システイン、γ－グルタミルシステイン、グルタチオン等の含硫化合物を含む酵母エキス等を反応させ、特定の溶媒で抽出することにより、イソチオシアネートに対し、含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物を効率的に製造することができ、さらに当該化合物が高いグルタチオン生成促進作用を有することを見出し、これらの知見に基づいて更に研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］イソチオシアネートを含有する植物素材及び含硫化合物を含有する酵母エキスを水性媒体中で反応させることを特徴とする、イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物の製造方法。
［２］水性媒体がエタノールを含む水性媒体である［１］に記載の製造方法。
［３］イソチオシアネートが、スルフォラファン、エルシン、ベンジルイソチオシアネート、アリルイソチオシアネート、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート又はその塩である［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］イソチオシアネートを含有する植物素材がアブラナ科キバナスズシロ属（Erucca sp.）の植物体由来である［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］アブラナ科キバナスズシロ属（Erucca sp.）の植物体がルッコラ（Erucca sativa）である［４］に記載の製造方法。
［６］含硫化合物がグルタチオン、システイン、γ－グルタミルシステイン及びその塩から選択される少なくとも一種である［１］～［５］のいずれか１項に記載の製造方法。
［７］酵母エキスがサッカロマイセス属（Saccharomyces属）又はキャンディダ属（Candida属）に属する酵母由来である［１］～［６］のいずれか１項に記載の製造方法。
［８］エタノールを含む水性媒体が含水エタノールである［２］～［７］のいずれか１項に記載の製造方法。
［９］含水エタノールのエタノール濃度が３０～６０％（ｖ／ｖ）である［８］に記載の製造方法。
［１０］イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする、グルタチオン生成促進用組成物。
［１１］イソチオシアネートが、スルフォラファン、エルシン、ベンジルイソチオシアネート、アリルイソチオシアネート、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート又はその塩である［１０］に記載のグルタチオン生成促進用組成物。
［１２］含硫化合物がグルタチオン、システイン、γ－グルタミルシステイン及びその塩から選択される少なくとも一種である［１０］又は［１１］に記載のグルタチオン生成促進用組成物。
［１３］イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする、美白用組成物。
[１４]イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする、抗酸化用組成物。
[１５]イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩の有効量を対象に対して投与することを特徴とする、グルタチオン生成促進方法。
[１６]イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩の有効量を対象に対して投与することを特徴とする、美白方法。
[１７]イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩の有効量を対象に対して投与することを特徴とする、酸化ストレス抑制方法。
[１８]［１］～［９］のいずれか１項に記載の製造方法で得られた化合物又はその塩。
　本発明によれば、有害と考えられているエルカ酸含量が低く安全性の高いジチオカーバメート構造で結合した化合物及び当該化合物を含有する生成促進用組成物を提供することができる。
　またジチオカーバメート構造で結合した成分を含むグルタチオン生成促進用組成物は、安定性が高く、イソチオシアネートや含硫化合物に由来する特有の匂いと刺激がなく、主に油状のイソチオシアネート類とは異なって粉末形態であるので作業性に優れ、製剤化に有利である。
　さらに本発明によれば、生体内のグルタチオン量を増加させることで、抗酸化作用に関連の深い動脈硬化、糖尿病、薬物中毒、虚血性心疾患、免疫疾患、癌、アルツハイマー病等などの疾患に対して予防及び治療することができる。またシミ、ソバカス等の色素沈着の予防や改善等の美白効果及び活性酸素を消去することによるシワの予防や改善等の美肌効果を有するので化粧品分野にも有効に適用できる。
エルシン－システイン結合体及び分取したエルシン－グルタチオン結合体のUV254nmのLCクロマトグラムを示す。 上図は保持時間7.93分のUVスペクトル、下図は保持時間9.38分のUVスペクトルを示す。 上図は保持時間7.93分のMSスペクトル、下図は保持時間9.38分のMSスペクトルを示す。 酵母エキス添加量によるエルシン－グルタチオン結合体含量の比較を示す。縦軸は面積値（単位はμＶ秒）を示す。 抽出溶媒のエタノール含量に対するエルカ酸及びエルシン－グルタチオン結合体含量を示す。縦軸は面積値（単位はμＶ秒）を示す。 加温温度と反応時間によるエルシン－グルタチオン結合体含量の比較検討結果を示す。縦軸は面積値（単位はμＶ秒）を示す。 抽出溶媒量によるエルシン－グルタチオン結合体含量の比較検討結果を示す。縦軸は面積値（単位はμＶ秒）を示す。 エルシン－システイン結合体とコウジ酸による細胞から放出される黒色メラニン量を示す。 エルシン－システイン結合体の25℃保存時の含量変化を示す。
　本発明は、イソチオシアネートを含有する植物素材及び含硫化合物を含有する酵母エキスを混合し、該混合物を水性媒体中で反応させることを特徴とする、イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物の製造方法に関する（以下本発明の製造方法と略することもある）。
　また本発明は、（Ａ）イソチオシアネートならびに（Ｂ）含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする、グルタチオン生成促進用組成物に関する（以下本発明のグルタチオン生成促進剤と略することもある）。
　（Ａ）イソチオシアネートは、イソチオシアネート類を含む動物や植物の天然物などをそのまま、乾燥破砕したもの又は溶媒等で抽出した抽出物、化学合成法、発酵法又は遺伝子組換法によって得られるもののいずれを使用してもよい。
　イソチオシアネートとしては、スルフォラファン、エルシン、ベンジルイソチオシアネート、アリルイソチオシアネート、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート又はそれらの塩が挙げられる。好ましくは、スルフォラファン、エルシン、ベンジルイソチオシアネート、アリルイソチオシアネート、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートであり、スルフォラファン、エルシンがより好ましい。
　イソチオシアネートを含有する植物素材としては、アブラナ科アブラナ属（Brassica sp.）、アブラナ科キバナスズシロ属（Erucca sp.）、アブラナ科レビディウム属（Lepidium sp.）、パパイヤ科パパイヤ属（Carica sp.）、アブラナ科ワサビ属（Wasabia sp.）等の植物体が挙げられる。
　アブラナ科アブラナ属の植物体としてはブロッコリー（Brassica oleracea var. italica）、キャベツ（Brassica oleracea var.capitata）、カリフラワー（Brassica oleraceavar.botrytis）、アブラナ（Brassia rapa var. nippo-oleifera）、タアサイ（Brassica campestris var. narinosa）、セイヨウカラシナ（Brassica juncea）、タカナ（Brassica juncea var.intelifolia）、ミズナ（Brassica nipposinca）、ケール（Brassica oleracea var.acephala）、メキャベツ（Brassica oleracea var.gemmifera）、チンゲンサイ（Brassica rapa var.chinensis）、コマツナ（Brassica rapa var.peruviridis）等が挙げられ、好ましくはブロッコリーが挙げられる。
　アブラナ科アブラナ属（Brassica sp.）等の植物体由来成分として、スルフォラファン又はその塩が挙げられる。
　アブラナ科キバナスズシロ属の植物体としては、ルッコラ（Erucca sativa）、キバナスズシロ（Erucca vesicaria）等が挙げられ、好ましくはルッコラが挙げられる。
　アブラナ科キバナスズシロ属（Erucca sp.）等の植物体由来成分として、以下の化学式（Ｉ）で示されるエルシン又はその塩が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　アブラナ科レビディウム属の植物体としては、マカ（Lepidium meyenii）、コショウソウ（Lepidium sativum）、ヒメグンバイナズナ（Lepidium apetalum）、好ましくはマカ（Lepidium meyenii）が挙げられ、パパイヤ科パパイヤ属の植物体としては、好ましくはパパイヤ（Carica papaya）が挙げられる。
　アブラナ科レビディウム属（Lepidium sp.）の植物体由来成分又はパパイヤ科パパイヤ属（Carica sp.）等の植物体由来成分として、ベンジルイソチオシアネート又はその塩が挙げられる。
　アブラナ科ワサビ属（Wasabia sp.）の植物体としては、ワサビ（Wasabia japonica）等が挙げられ、ワサビが好ましい。
　アブラナ科ワサビ属（Wasabia sp.）等の植物体由来成分として、アリルイソチアシアネート、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート又はそれらの塩が挙げられる。
　（Ｂ）含硫化合物としては、グルタチオン、システイン、γ－グルタミルシステイン又はそれらの塩等が挙げられる。当該含硫化合物は、天然物をそのまま、乾燥破砕したもの又は溶媒等で抽出した抽出物、化学合成法、ペプチド合成や大腸菌による合成品を用いることが出来る。
　（Ｂ）が天然物由来のものである場合に、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Candida属等の発酵生産物由来のものが挙げられる。なかでもSaccaromyces属の発酵生産物由来のものが好ましい。Saccaromyces属の発酵生産物由来のものとして、酵母エキス、γ－グルタミルシステイン高含有酵母エキス等が挙げられる。
　含硫化合物を含有する酵母エキスとしては、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属、Schizosaccharomyces pombe等のSchizosaccharomyces属、Candida utilis等のCandida属に属する酵母由来の酵母エキスが通常使用され、Saccharomyces属又はCandida属に属する酵母由来の酵母エキスが好ましい。
　本発明において使用するシステインは、Ｌ－体、Ｄ－体、これらの混合物（例えば、ラセミ体）の何れも使用可能であるが、好ましくは、Ｌ－体が用いられる。
　本発明のグルタチオン生成促進剤において、有効成分は（Ａ）及び（Ｂ）がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩である。
　当該化合物を製造する方法としては、自体公知の方法で合成する方法や天然物由来の（Ａ）及び（Ｂ）を使用する方法が挙げられる。
　例えば、天然物由来のイソチオシアネートを用いる場合では、ルッコラ（Eruca sativa）の種子をそのまま粉砕し、水を加えて混合し、通常ｐＨ６～１１、好ましくはｐＨ７～９に調整した水溶液に、酵母エキスを加える。好ましくは、その後その水溶液に対して1／２～２倍量、好ましくは等量の溶媒を加える。そして通常１０～６０℃、好ましくは２０～４０℃にて、通常１時間～１２時間、好ましくは３時間～５時間静置又は攪拌する。その後、１００～２００メッシュのろ布にてろ過し反応液を得る。更に、反応によって得られた生成物は、クロマトグラフィー等の常法で精製することが出来る。
　使用する水性媒体としては、水性媒体として知られている範疇に属するものであれば如何なるものを用いることも可能であり、例えば、蒸留水、イオン交換水、工業用水、上水等を挙げることができ、さらに、有機溶媒を含有したものであってもよい。
　有機溶媒としてはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール、1,3-ブタンジオール、プロパンジオール、ジプロパンジオール、グリセリン等の多価アルコール、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル等のエーテル類、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル、ヘキサンなどの有機溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以上を選択して用いることができる。また、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水等を用いてもよい。
　なかでも有機溶媒としては低級アルコール、1,3-ブタンジオール、グリセリン、エーテル類、酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル及びヘキサンが好ましく、低級アルコール、エーテル類等がより好ましく、メタノール、エタノール、ジエチルエーテルが特に好ましい。
　上記水性媒体の中でも、反応物からエルカ酸を除去するという観点からは、３０～６０％（ｖ/ｖ）の含水エタノールが好ましく、３０～５０％（ｖ/ｖ）の含水エタノールがより好ましく、４０～５０％（ｖ/ｖ）の含水エタノールが特に好ましい。
　イソチオシアネートを含有する植物素材としては、イソチオシアネート類を含む天然物をそのまま、もしくは乾燥破砕したもの及び溶媒等で抽出した抽出物を用いることが出来る。
　また、ルッコラ種子等の天然物を破砕もしくは磨砕した粉末及び溶剤にて抽出した抽出物をイソチオシアネートとして用いることが出来る。一般的には、以下の手法によって調製される。
　イソチオシアネート類を含む天然物を粉砕もしくは磨砕した粉末を調製し、抽出は、抽出溶媒に浸漬して行う。抽出効率を上げるため撹拌したり、抽出溶媒中でホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、室温又は加熱下で行うことができ、１℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切であり、通常１℃～１００℃、好ましくは２０℃～９０℃である。抽出時間は抽出対象となる植物、抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、４時間～１４日間程度とするのが適切である。
　抽出溶媒としては上述したものと同じものが挙げられる。
　また、イソチオシアネート類を含む天然物を加熱処理した原料を用いることもできる。加熱処理した原料は、長期の保存が可能なため、工業的な生産において有用である。加熱方法としては、特に限定はないが、ルッコラ種子等の天然物を、８０℃～１００℃の熱水中に１分～６０分程度浸漬するか、もしくは加熱水蒸気により1分から６０分程度処理する等の方法が挙げられる。こうして加熱処理した天然物を粉砕もしくは磨砕して粉末を調製し、これを用いることができ、また、この粉末から抽出溶媒で抽出して用いることもできる。
　加熱処理した原料を用いる場合には、ミロシナーゼ酵素源を有する加熱処理をしていない天然物を破砕又は磨砕したものと水を加えて混合又はミロシナーゼ酵素を加えて混合し、上述した条件で酵母エキスを加え反応させることによりジチオカーバメート構造で結合した化合物を得ることができる。
　前記化合物としては、エルシン－システイン結合体、エルシン－グルタチオン結合体、エルシン－γ－グルタミルシステイン結合体、スルフォラファン－システイン結合体、スルフォラファン－グルタチオン結合体、スルフォラファン－γ－グルタミルシステイン結合体、ベンジルイソチオシアネート－システイン結合体、ベンジルイソチオシアネート－グルタチオン結合体、ベンジルイソチオシアネート－γ－グルタミルシステイン結合体、アリルイソチオシアネート－システイン結合体、アリルイソチオシアネート－グルタチオン結合体、アリルイソチオシアネート－γ－グルタミルシステイン結合体、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート－システイン結合体、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート－グルタチオン結合体、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート－γ－グルタミルシステイン結合体等が挙げられる。前記化合物の特に好適な具体例としては、エルシン－システイン結合体、エルシン－グルタチオン結合体、エルシン－γ－グルタミルシステイン結合体が挙げられる。
　本発明においては有効成分として上記の１種以上の化合物又はその塩を含有する。
　また上記化合物は塩の形態で使用することもできる。このような塩としては、無機塩基との塩、無機酸との塩及び有機酸との塩等が挙げられ、医薬又は飲食品等にとして許容される塩を選択することが好ましい。無機塩基との塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。無機酸との塩としては、ハロゲン化水素酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸等）、硫酸、硝酸、リン酸等との塩が挙げられる。有機酸との塩としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、クエン酸との塩が挙げられる。
　本発明において上記ジチオカーバメート構造で結合した化合物は、上述の植物等の天然物から得られた抽出物そのままでも、濃縮、乾固したものを水や有機溶媒に再度溶解したり、或いは脱色、脱臭、脱塩等の精製処理を行ったり、イオン交換樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーによる分画処理を行ったものでもよい。また保存のため、精製処理の後凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。前記化合物又はその塩は、上記の方法で得られたもの、化学合成法、動物や植物に由来する天然のもの、発酵法又は遺伝子組換法によって得られるもののいずれを使用してもよい。
　本発明のグルタチオン生成促進剤では、有効成分としてジチオカーバメート構造で結合した化合物として上記植物の上記溶媒による抽出物又は前記処理物をそのまま、或いは水、低級アルコール等の水性担体、乳剤、ゲル、クリーム等の基剤に含有させたり、粉末化或いは顆粒化させたり、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させることもできる。
　本発明のグルタチオン生成促進剤には、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース及びその誘導体、コムギデンプン、トウモロコシデンプン、カルボキシメチルスターチナトリウム、デキストリン等のデンプン及びその誘導体、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等の天然高分子化合物、ブドウ糖、マルトース、ソルビトール、マルチトール、マンニトール等の糖及びその誘導体、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム等の無機塩類などの賦形剤；グアーガム、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、高分子ポリビニルピロリドン、乳糖などの結合剤；タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール6000などの滑沢剤；アジピン酸、ステアリン酸カルシウム、白糖などの崩壊剤；ショ糖脂肪酸エステル、大豆レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンモノステアリン酸エステルなどの界面活性剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、ゼラチンなどの増粘剤；アクリル酸エチル・メタクリル酸メチルコポリマー分散液、カラメル、カルナウバロウ、セラック、白糖、プルラン等のコーティング剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどのｐＨ調整剤；アスコルビン酸、酢酸トコフェロール、天然ビタミンＥ、没食子酸プロピル等の抗酸化剤；アスパルテーム、カンゾウエキス、サッカリン等の嬌味剤；安息香酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の防腐剤；ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、カルミン、食用青色１号、食用黄色４号、食用黄色４号アルミニウムレーキ、食用赤色２号、銅クロロフィリンナトリウムなどの着色剤といった添加剤を含有させることができる。
　本発明のグルタチオン生成促進剤には、さらに他の有効成分を含有していてもよい。例えば、シスチン、テアニン、システイン、グルタミン酸、コエンザイムＱ１０、α－リポ酸、フラボノイド、ポリフェノール、植物抽出物などが挙げられ、シスチンが好ましい。
　本発明のグルタチオン生成促進剤の投与形態（又は食品としての摂取形態）は、経口投与、又は点滴投与、注射投与（経静脈投与）、外用等の非経口投与（摂取）でも良く、特に限定されない。
　経口投与的に投与する場合には、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、散剤、（マイクロ）カプセル剤、チュアブル剤、シロップ、ジュース、液剤、懸濁剤、乳濁液等、活性物質の放出を延長する製剤等の医薬製剤一般の剤型を採用することができる。さらに、各種担体又は基剤や添加剤等を使用して製剤化し、糖衣錠やフィルムコーティング剤を含む錠剤、丸剤、カプセル剤、アンプル剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤、ドロップス剤、トローチ剤、チュアブル剤、散剤、顆粒剤等の形状で投与することもできる。経口的に投与する場合には、食前、食後、食間を問わない。
　非経口的に投与する場合には、例えば、有効成分を含有する溶液を点鼻噴霧することや注射剤として投与すること等ができる。又は本発明のグルタチオン生成促進剤を皮膚外用剤とする場合には、有効成分を種々の基剤に分散させて常法により製剤化すればよく、かかる基剤としては、ワセリン、流動パラフィン、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシルなどの高級脂肪酸エステル、スクワラン、ラノリン、セタノールなどの高級アルコール、シリコーン油、動植物油脂などの油脂性基剤、エタノールなどの低級アルコール類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどの多価アルコール類、α－モノグリセリルエーテル、レシチン、ソルビタン脂肪酸エステル、デキストリン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸金属塩、硫酸マグネシウムなどの乳化又は乳化安定剤、芳香剤、防腐剤、色素、増粘剤、酸化防止剤、紫外線防御剤、創傷治癒剤、抗炎症剤、保湿剤などの各種薬効剤、水などが挙げられる。また、本発明のグルタチオン生成促進剤を皮膚における抗酸化剤として外用剤に添加し、外用医薬品、医薬部外品、香粧品等として提供することができる。
　本発明のグルタチオン生成促進剤は、ヒト、ヒト以外の動物〔例えば、ヒト以外の哺乳類（ブタ、ウシ、ウマ、イヌ等の家畜及び愛玩動物）、鳥類（シチメンチョウ、ニワトリ等の家禽及び愛玩動物）等〕等に適用することが有用である。また動物用医薬品や動物用の飼料に添加することもできる。
　本発明のグルタチオン生成促進剤において、有効成分の含有量としては、前記化合物又はその塩の１種以上を、当該促進剤の全重量に対して植物の抽出条件や添加形態、剤形、投与形態などにより異なるが、通常０．０１重量％以上、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは１重量％以上含有し、通常１００重量％以下、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは５重量％以下で含有する。
　またエルカ酸含量は、当該促進剤の全重量に対して、通常１０ｐｐｍ以下であり、好ましくは５ｐｐｍ以下であり、より好ましくは１ｐｐｍ以下である。
　本発明のグルタチオン生成促進剤は、抗酸化用途、抗酸化作用に関連の深い動脈硬化、糖尿病、薬物中毒、虚血性心疾患、免疫疾患、癌、アルツハイマー病等の疾患の予防や治療用途、シミ、ソバカス等の色素沈着の予防や改善などの美白用途、活性酸素を消去することによるしわの予防や改善などの美肌用途に用いることができる。
　抗酸化用途とは、活性酸素の消去、活性酸素による細胞障害からの保護を意味する。
　本発明のグルタチオン生成促進剤において、１日あたりの投与量は、経口投与の場合には、有効成分を通常１μｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましく、３ｍｇ／ｋｇ体重～６０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲がより好ましい。
　例えば、有効成分がエルシン－システイン結合体の場合の経口投与での投与量は、成人１日あたり通常０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重～０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましい。
　例えば、有効成分がエルシン－グルタチオン結合体の場合の経口投与での投与量は、成人１日あたり通常０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重～０．６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましい。
　例えば、有効成分がエルシン－γ－グルタミルシステイン結合体の場合の経口投与での投与量は、成人１日あたり通常０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重～０．６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましい。
　本発明のグルタチオン生成促進剤において、上記１日あたりの量を一度にもしくは数回に分けて投与することができる。また投与期間は特に限定されない。上記成人１回あたりの量は、性別、年齢、疾患等の体の状態を加味して適宜変更しうる。
　本発明のグルタチオン生成促進剤を美肌用組成物又は抗酸化用組成物として使用する場合には、１日あたりの投与量は、経口投与の場合には、有効成分を通常１μｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましく、３ｍｇ／ｋｇ体重～６０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲がより好ましい。具体的なエルシン－システイン結合体等の投与量は上記投与量と同様である。
　本発明のグルタチオン生成促進剤を加えた食品としては、特に限定されないが、例えば、有効成分を粉末飲料や飲料、菓子等の食品の中に添加したものが挙げられる。
　上記「食品」は、食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、消費者庁の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品や栄養機能食品をも含むものであり、さらにダイエタリーサプリメントも包含される。また、本発明のグルタチオン生成促進剤は、飼料用途にも適用することができ、家禽や家畜等には、通常の飼料に添加して投与することができる。
　また食品に含まれる本発明のグルタチオン生成促進剤の量は、特に限定されないが、１日あたりの飲食量が本発明のグルタチオン生成促進剤の有効成分の上記投与量と同様の範囲となるようにするのが好ましい。
　本発明のグルタチオン生成促進剤を食品として使用する場合には、本発明の特定の機能に着目して摂取される健康食品の他、保健機能食品制度に規定される特定保健用食品や栄養機能食品を意味し、さらにダイエタリーサプリメントも包含される。食品に含まれる有効成分の量は、特に限定されないが、１日あたりの飲食量が本発明のグルタチオン生成促進剤における上記の投与量と同様の範囲となるようにするのが好ましい。本発明のグルタチオン生成促進剤の保健機能食品の形態は、特に限定されない。
　本願における食品は、有効成分が１食当たりの摂取単位量の形態で包装された形態や、有効成分が懸濁あるいは溶解した飲料が１食あたりの飲み切りの形態で瓶等に充填された形態などが挙げられる。１食あたりの用量は上記に示した１日の投与量であってもよい。
　具体的には、１食当たりの単位包装形態において、該単位の有効成分の１回の摂取量としては、通常６ｍｇ～１２０ｍｇ、９ｍｇ～９０ｍｇが好ましく、１２ｍｇ～６０ｍｇがより好ましく、１２ｍｇ～４０ｍｇが特に好ましい。また例えば１日２回摂取の場合、該単位中の有効成分の１回の摂取量としては、通常３ｍｇ～６０ｍｇ、４．５ｍｇ～４５ｍｇが好ましく、６ｍｇ～３０ｍｇがより好ましく、６ｍｇ～２０ｍｇが特に好ましい。
　例えば、１食当たりの単位包装形態からなり、該単位中に、１回の摂取量として有効成分としてエルシン－システイン結合体を３ｍｇ～６０ｍｇ、及び有効成分を６ｍｇ～１２０ｍｇ含有するグルタチオン生成促進剤が好ましい。
　イソチオシアネートを含有する植物素材及び含硫化合物を含有する酵母エキスを水性溶媒中で反応させることを特徴とする、イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物の製造方法について説明する。
　本発明の製造方法における出発物質は、上記イソチオシアネートを含有する植物素材又は上記（Ａ）及び含硫化合物を含有する酵母エキス又は上記（Ｂ）で述べた天然物由来のものや、J. Med. Chem. 1997, 40, 1186-1194及びChem. Biol. Interaction, 84(1992) 277-290等に記載される方法や公知の工程によって調製できるものであってもよい。なお、以下の製造法において、原料化合物（Ａ）又は（Ｂ）は塩として用いてもよく、このような塩としては、例えば、前記化合物の塩と同様のものが挙げられる。
　以下の各工程で得られた化合物は、反応液のままか粗生成物として、次の反応に用いてもよいし、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶、クロマトグラフィーなどにより、反応液から単離精製して次の反応に用いてもよい。
　また以下の化合物が市販されている場合には、市販品をそのまま用いることもできる。
　イソチオシアネートを含有する植物素材又は（Ａ）として天然物由来のイソチオシアネートを用いる場合では、イソチオシアネートを含む植物素材又は天然物をそのまま、もしくは乾燥破砕したもの及び溶媒等で抽出した抽出物を用いることが出来る。例えば、ルッコラ（Eruca sativa）の種子をそのまま粉砕し水を加えて混合する。
　種子重量に対する必要な溶媒（水）の量は、種子重量に対して、通常２．５～２０倍量、好ましくは２．５～１０倍量、より好ましくは、２．５～５倍量の水を加えて混合する。
　得られた混合物（水溶液）は通常ｐＨ６～１１、好ましくはｐＨ７～９に調整する。又は酵母エキス等を加えてから前記ｐＨに調整してもよい。
　次に含硫化合物を含有する酵母エキス又は（Ｂ）含硫化合物、例えば天然物由来の酵母エキス等を加え、反応物に対して1／２～２倍量、好ましくは等量の溶媒を加え静置又は攪拌して反応させる。
　溶媒としては、上記に挙げられた水性溶媒、有機溶媒又は水、もしくはそれらの混合溶媒が好ましく使用できる。望ましくないエルカ酸含量を低減する観点からは、３０～６０％（v/v）の含水エタノールが好ましく、３０～５０％（v/v）が好ましく、４０～５０％（v/v）の含水エタノールがより好ましい。
　静置又は攪拌は、通常１０～８０℃、好ましくは２０～４０℃にて、通常１時間～１２時間、好ましくは３時間～５時間行う。
　より好ましくは、２０℃の場合には、２時間～９時間、特に好ましくは５時間～９時間、３０℃の場合には、１時間～５時間、特に好ましくは３時間～４時間、４０℃の場合には、０．５時間～３時間、特に好ましくは０．５時間～２時間反応させる。
　その後、１００～２００メッシュのろ布にてろ過等の方法により反応液を得る。更に、反応物は、クロマトグラフィー等自体公知の分離手法によりそれぞれを単品として得ることができる。
　また（Ａ）が植物体由来のものであり、（Ｂ）がSaccaromyces属の発酵生産物由来のものを使用したグルタチオン生成促進剤の製造方法が好ましく挙げられる。特に好ましい植物体や（Ａ）及び（Ｂ）の定義は上記と同様である。
　本発明の別の態様としては、イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩の有効量を対象に対して投与することを特徴とする、グルタチオン生成促進方法、美白方法および体内の酸化抑制方法が挙げられる。
　美白方法とは、メラニン生成によるしみ・そばかすの予防または改善方法を意味する。
　また酸化ストレス抑制方法とは、活性酸素が産生され障害作用を発現する生体作用と、生体システムが直接活性酸素を解毒したり、生じた障害を修復する生体作用との間で均衡が崩れた状態、すなわち生体組織の通常の酸化還元状態が乱れた状態を意味する酸化ストレスを抑制する方法であり、過酸化物やフリーラジカルの産生を抑制する方法を意味する。
　具体的には、イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩の有効量を対象に対して投与することを特徴とする、動脈硬化、糖尿病、薬物中毒、虚血性心疾患、免疫疾患、癌およびアルツハイマー病からなる群から選択される疾患の予防又は治療方法、皮膚光老化の抑制方法、メラニン放出抑制方法、シミやソバカス等の色素沈着の予防又は改善方法、しわの予防又は改善方法等が挙げられる。
　イソチオシアネート等の各定義や投与量等は上記と同様である。
　以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
　エルシン（５０ｍｇ）とＬ－システイン（１００ｍｇ）を精製水１００ｍＬとアセトニトリル１００ｍＬに溶解した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８に調整し、２５℃、６０分間静置した後、アセトニトリル２００ｍLを添加した。この反応液を減圧下で濃縮乾固した試料を５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、下記の条件で分取ＨＰＬＣを行って精製し、下記の構造を示すエルシン－システイン結合体（分子量２８２）を得た。なお、分子量２８２のエルシン－システイン結合体の定性はLC－DAD-MSにより行った。１Ｈ－ＮＭＲ（400MHz, DMSO-d6）、13Ｃ－ＮＭＲ（100MHz, DMSO-d6）：表１に示す。なお、プロトンの結合している炭素の帰属は２次元NMR（HSQC）を測定して帰属を行い、全体の推定構造は２次元ＮＭＲ（HMBC）によって帰属を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
＜分取ＨＰＬＣ条件＞
カラム：CAPCELL PAK AQ（２０x２５０mm、資生堂）
移動相：アセトニトリル／水（２５：７５）（０．０５％トリフルオロ酢酸）
流速：１４ｍＬ／ｍｉｎ
検出：210nm
＜ＬＣ／ＤＡＤ／MS条件＞
カラム：L-column ２（２．１x２５０mm、化学物質評価研究機構）
移動相：０－３０min　０－５０％アセトニトリル水溶液 
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＤＡＤ（２００－４００ｎｍ）
ＭＳ条件：ＥＳＩ＋ 
コーン電圧（Ｖ）：２０、キャピラリー電圧（ｋＶ）：３、コリジョンガス（Ｌ／ｈｒ）：６００、デゾルベーションガス（Ｌ／ｈｒ）：６００、ソース温度：１２０℃、デゾルベーション温度：３５０℃
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例２）
　実施例１と同様に、エルシン（５０ｍｇ）とグルタチオン（３００ｍｇ）を精製水５０ｍＬとアセトニトリル５０ｍＬに溶解した後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８に調整し、２５℃、６０分間静置した後、この反応液を減圧下で濃縮乾固した後、少量の５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、下記の条件で分取ＨＰＬＣを行って精製して下記の構造を示すエルシン－グルタチオン結合体（分子量４６８）を得た。本化合物の同定は、実施例１で調製したエルシン－システイン結合体と分取したエルシン－グルタチオン結合体を混合した溶液を調製し、ＬＣ／ＤＡＤ／ＭＳによる分析により行った。その結果は、図１、２、３に示すとおり、エルシン－システイン結合体は保持時間7.93分に確認され、エルシン－グルタチオン結合体と推測される成分は保持時間9.38分に確認された。保持時間9.38分の成分は、エルシン－システイン結合体と同じくジチオカーバメート構造に特徴的なλmax約 250nm及び267nmに吸収を示すＵＶスペクトルを示し、かつ分子イオンピーク[M+H]+m/z 469を確認出来たことで、分取した成分がエルシン－グルタチオン結合体であると同定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
＜分取ＨＰＬＣ条件＞
カラム：CAPCELL PAK AQ（２０x２５０mm、資生堂）
移動相：アセトニトリル／水（２５：７５）（０．０５％トリフルオロ酢酸）
流速：１４ｍＬ／ｍｉｎ
検出：210nm
＜ＬＣ／ＤＡＤ／MS条件＞
カラム：L-column ２（２．１x２５０mm、化学物質評価研究機構）
移動相：０－２０min　２０－５０％アセトニトリル水溶液 
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＤＡＤ（２００－４００ｎｍ）
ＭＳ条件：ＥＳＩ＋ 
コーン電圧（Ｖ）：２０、キャピラリー電圧（ｋＶ）：３、コリジョンガス（Ｌ／ｈｒ）：６００、デゾルベーションガス（Ｌ／ｈｒ）：６００、ソース温度：１２０℃、デゾルベーション温度：３５０℃
（実施例３）
　ルッコラの種子１gを乳鉢で磨砕した後、精製水７mLを加えて、更に酵母エキス粉末（アロマイルドＵＧ－８）０．２５ｇを加えて混合する。水酸化ナトリウム水溶液でpH 8に調整した後、７ｍLのエタノールを加えて２５℃、３時間静置した。この反応液をろ紙（Toyo No.2）でろ過した後、凍結乾燥し、２５０ｍｇの粉末を得た。その粉末１０ｍｇを量り取り０．１ｍＬに溶解し、更にその溶液１μLを９９μLの純水で希釈した試料溶液を、実施例１記載のＬＣ／ＤＡＤ／ＭＳ条件で分析を行い、エルシンとグルタチオン結合物質（分子量４６８）を検出し、実施例１で調製したエルシン－システイン結合体を標準試薬として用い、ＵＶ２５４ｎｍの波長を用いて定量分析を行い、エルシン－グルタチオン結合体含量が１．２％であることを確認した。
（実施例４）
　ルッコラの種子１gを乳鉢で磨砕した後、精製水７mLを加えて、更にγ－グルタミルシステイン含有酵母エキス溶液（味の素社製）０．５ｍLを加えて混合する。水酸化ナトリウム水溶液でpH 8に調整した後、７ｍLのエタノールを加えて２５℃、３時間静置した。この反応液をろ紙（Toyo No.2）でろ過後、凍結乾燥し、２７０ｍｇの粉末を得た。その粉末１０ｍｇを量り取り０．１ｍＬに溶解し、更にその溶液１μLを９９μLの純水で希釈した試料溶液を、実施例２の条件と同じＬＣ／ＤＡＤ／ＭＳ条件で分析を行い、エルシンとシステイン結合体（分子量２８２）、エルシンとγ-グルタミルシステイン結合体（分子量４１１）、エルシンとグルタチオン結合体（分子量４６８）を検出し、実施例１で調製したエルシン－システイン結合体を標準試薬として用い、ＵＶ２５４ｎｍの波長を用いて定量分析を行い、エルシン－システイン結合体含量０．５９％、エルシン－γ-グルタミルシステイン結合体含量０．２８％、エルシン－グルタチオン結合体含量０．２８％であることを確認した。
（実施例５）
　エルシンを約１％含有しているルッコラの種子に対して添加する酵母エキスの量を設定するための検討として、ルッコラの種子０．５g（エルシン含量３０μmol）を乳鉢で磨砕した後、精製水２mLを加えて、更に酵母エキス粉末（アロマイルドＵＧ－８、グルタチオン含量５％）０．０６０ｇ（グルタチオン含量１０μmol）、０．１２５ｇ（グルタチオン含量２０μmol）、０．２５ｇ（グルタチオン含量４０μmol）、０．５ｇ（グルタチオン含量８０μmol）、１．０ｇ（グルタチオン含量１６０μmol）を加えて混合した試料をそれぞれ調製し、エタノール２ｍＬを添加した後、含水５０％エタノール溶媒で１０ｍＬに調製した。その後、水酸化ナトリウム水溶液でpH 8に調整して２５℃、４時間静置した。この溶液を遠心ろ過した溶液を、下記のＬＣ条件で分析を行い、エルシンとグルタチオン結合物質については、実施例１と同様に予め合成したエルシン－グルタチオン結合体の標準品を指標として、定性し、成分についての面積値を用いて含有量を比較した。
　結果を図４に示す。エルシン－グルタチオン結合体の含量は、０．２５ｇ以上で最大となり、エルカ酸に対して当モル以上のグルタチオン量を含む酵母エキスを添加すれば、十分にエルシン－グルタチオン結合体が生成することが確認出来た。
＜ＬＣ条件＞
カラム：L-column 2（２．１x２５０mm、化学物質評価研究機構）
移動相：０－３０min　２０－７０％アセトニトリル水溶液（０．０５％トリフルオロ酢酸） 
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２５４nm
（実施例６）
　有害物質であるエルカ酸を含ませないための溶媒の検討として、ルッコラの種子０．５gを乳鉢で磨砕した後、精製水２mLを加えて、更に酵母エキス粉末（アロマイルドＵＧ－８）０．１２５ｇを加えて混合する。水酸化ナトリウム水溶液でpH 8に調整した後、エタノールを加える量を１ｍＬ（エタノール含量33%v/v）、１．５ｍＬ（43%）、２ｍＬ(50%)、４ｍＬ(60%)、５ｍＬ(71%)、８ｍＬ(80%)の６種類に分けて、添加した後、それぞれの溶液を同じ比率となるように調製した含水エタノール溶媒で１０ｍＬに調製した。その後、２５℃、３時間静置した。この溶液を遠心ろ過した溶液を、下記のＬＣ条件で分析を行い、エルシンとグルタチオン結合物質については、予め合成したエルシン－グルタチオン標準品を指標として定性し、エルカ酸含量については、下記のＬＣ－ＭＳ条件でエルカ酸試薬を指標として定性し、それぞれの成分についての面積値を用いて含有量を比較した。
　結果を図５に示す。エルシン－グルタチオン結合体の含量は４０～５０％エタノール含量で最大となり、エルカ酸含量もわずかであることが明らかになった。
＜ＬＣ条件＞
カラム：L-column 2（２．１x２５０mm、化学物質評価研究機構）
移動相：０－３０min　１０－６０％アセトニトリル水溶液（０．０５％トリフルオロ酢酸） 
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２５４nm
ＭＳ条件：ＥＳＩ＋ 
＜ＬＣ／MS条件＞
カラム：CAPCELL PAK MG2（２．０x１５０mm、資生堂）
移動相：A：H2O(0.025% ギ酸)、B:CH3CN(0.025% ギ酸)
グラジエント：0-20min 80%B-100%B
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＭＳ条件：ＥＳＩ－
コーン電圧（Ｖ）：２０、キャピラリー電圧（ｋＶ）：３、コリジョンガス（Ｌ／ｈｒ）：６００、デゾルベーションガス（Ｌ／ｈｒ）：６００、ソース温度：１２０℃、デゾルベーション温度：３５０℃
（実施例７）
　エルカ酸含量を測定するために、実施例２で調製したルッコラ種子と酵母エキスから調製したエキス粉末１０ｍｇに８０％エタノール１００μLを加えて抽出した試料溶液を調製し、下記の条件でエルカ酸含量を測定した。標準溶液として、エルカ酸試薬（東京化成）を８０％エタノールで溶解して５μg/mLになるように調製し、１、２、４μＬをインジェクションして検量線を作成して定量した。
　測定の結果、実施例２で調製したルッコラと酵母エキスから調製した粉末には、エルカ酸は0.8 ppmであることが明らかになり、有害とされるエルカ酸含量は影響の無い濃度であることを確認出来た。
＜ＬＣ／MS条件＞
カラム：CAPCELL PAK MG2（２．０x１５０mm、資生堂）
移動相：A：H2O(0.025% ギ酸)、B:CH3CN(0.025% ギ酸)
グラジエント：0-20min 80%B-100%B
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＭＳ条件：ＥＳＩ－
コーン電圧（Ｖ）：２０、キャピラリー電圧（ｋＶ）：３、コリジョンガス（Ｌ／ｈｒ）：６００、デゾルベーションガス（Ｌ／ｈｒ）：６００、ソース温度：１２０℃、デゾルベーション温度：３５０℃
（実施例８）
　ルッコラの種子と酵母エキスの調製物を調製する過程での温度を設定するための検討として、ルッコラの種子０．５g（エルシン含量３０μmol）を乳鉢で磨砕した後、精製水５mLを加えて、更に酵母エキス粉末（アロマイルドＵＧ－８、グルタチオン含量約５％）０．２５ｇ（グルタチオン含量４０μmol）を加えて混合した試料を調製し、エタノール５ｍＬを添加した。その後、水酸化ナトリウム水溶液でpH 8に調整して２０℃、３０℃、４０℃、５０℃で、０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９時間静置して、この溶液を遠心ろ過した溶液を、下記のＬＣ条件で分析を行った。なお、含量低下が認められた時点で測定は中止した。エルシンとグルタチオン結合物質については、予め合成したエルシン－グルタチオン結合体の標準品を指標として定性し、成分の面積値により比較した。
　結果を図６に示す。温度が上昇するに従い、エルシン－グルタチオン結合体の生成量が低下するが、最大生成量までの時間は短くなることが明らかになった。
　以上の結果より、２０℃の場合、６～９時間、３０℃の場合、２～４時間、４０度の場合、０．５～２時間の範囲設定が適切であり、５０℃を超えると生成量が大幅に低下することから不適切な条件であると判断した。
＜ＬＣ条件＞
カラム：L-column 2（２．１x２５０mm、化学物質評価研究機構）
移動相：０－３０min　２０－５０％アセトニトリル水溶液（０．０５％トリフルオロ酢酸）
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２５４nm
（実施例９）
　ルッコラの種子と酵母エキスの調製物に必要な溶媒量を設定するための検討として、ルッコラの種子０．５g（エルシン含量３０μmol）を乳鉢で磨砕した後、種子重量に対して２．５、３．４、５、１０、２０倍量となるように、１．２５ｍＬ、１．７ｍＬ、２．５ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬの精製水を添加し、更にそれぞれのサンプルに対して酵母エキス粉末（アロマイルドＵＧ－８、グルタチオン含量５％）０．２５ｇ（グルタチオン含量４０μmol）を加えて混合した試料を調製し、精製水と同じ量のエタノールを添加した試料溶液を調製した。その後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８に調整して３０℃、４時間静置した。この溶液を遠心ろ過した溶液を、下記のＬＣ条件で分析を行い、エルシンとグルタチオン結合物質については、予め合成したエルシン－グルタチオン結合体の標準品を指標としてUV254nmで定性し、成分についての面積値を１０ｍＬ溶媒中に換算して含有量を比較した。
　結果を図７に示す。エルシン－グルタチオン結合体の含有量は、種子重量に対して溶媒量が１０倍量の５ｍＬまでは、ほぼ同程度の量であるが、２０倍量で１．１倍、４０倍量になると、１．２倍程度量が増加している。必要最低量としては、種子重量に対して５倍量の溶媒でも十分に反応可能であることが示唆された。
＜ＬＣ条件＞
カラム：L-column２（２．１x２５０mm、化学物質評価研究機構）
移動相：０－３０min　２０－５０％アセトニトリル水溶液（０．０５％トリフルオロ酢酸） 
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２５４nm
（試験例１）
　結合体を含むことを特徴とする実施例２及び３で調製した試料と元の材料及び原料を実施例２及び３と同様に調製した試料のグルタチオン生成能を評価するために以下の検討を行った。なお、ポジティブコントロールとして、シスチンを用いた。
　Ｂ１６メラノーマをＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）（高グルコース、血清１０％含有）にて培養した。コンフルエントになった細胞を、トリプシンにて剥がし、９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞がプレートに接着後、表２に示す試料を表記の濃度になるように添加したＤＭＥＭ培地と交換し、３日間培養した。なお、コントロールはサンプル添加なしとした。培養後、培地を廃棄し、ＰＢＳ緩衝液をプレート１穴につき２００μＬ添加して洗浄して廃棄する。更に１ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加した１４％過塩素酸水溶液を２００μＬ添加して－３０℃で凍結してから室温で融解して細胞を破砕した後、２００μＬのエタノールを添加する。その溶液を１０Ｋの限外ろ過でろ過した後、更に１ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加した１４％過塩素酸水溶液で４倍希釈した溶液中の還元型グルタチオン量を下記のＬＣ－ＭＳ条件（SIMモード：m/z３０８）で定量分析をした。
　結果を表２に示す。当該試験濃度では、酵母エキスとルッコラの種から調製した試料及びγ－グルタミルシステイン含有酵母エキスとルッコラの種から調製した試料は、コントロールに比べて１．７～２倍近いグルタチオン量の増加が認められたが、ルッコラの種及び酵母エキス、γ－グルタミルシステイン含有酵母エキスにはグルタチオン量を増加させる効果は認められなかった。一方で、ポジティブコントロールとして用いたシスチンについてはコントロールに比べて２．４倍グルタチオン量を増加させる効果が認められた。
＜ＬＣ／MS条件＞
カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ　Ｃ３０（２．０x２５０mm、野村化学）
移動相：Ｈ２Ｏ（０．０２５％ＦＡ）
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＭＳ条件：ＥＳＩ＋ 
コーン電圧（Ｖ）：２０、キャピラリー電圧（ｋＶ）：３、コリジョンガス（Ｌ／ｈｒ）：６００、デゾルベーションガス（Ｌ／ｈｒ）：６００、ソース温度：１２０℃、デゾルベーション温度：３５０℃
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（試験例２）
　実施例２及び３で調製した試料とシスチンとの併用効果を確認するために、グルタチオン生成能評価の検討を行った。
　Ｂ１６メラノーマをＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）（高グルコース、血清１０％含有）にて培養した。コンフルエントになった細胞を、トリプシンにて剥がし、９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞がプレートに接着後、表３に示す試料を表記の濃度になるように添加し、更に全ての試料にシスチン０．１５ｍＭになるように添加したＤＭＥＭ培地と交換し、３日間培養した。なお、コントロールはシスチンのみを添加したサンプルとした。培養後、培地を廃棄し、ＰＢＳ緩衝液をプレート１穴につき２００μＬ添加して洗浄して廃棄する。更に１ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加した１４％過塩素酸水溶液を２００μＬ添加して－３０℃で凍結してから室温で融解して細胞を破砕した後、２００μＬのエタノールを添加する。その溶液を１０Ｋの限外ろ過でろ過した後、更に１ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加した１４％過塩素酸水溶液で４倍希釈した溶液中の還元型グルタチオン量を実施例４記載のＬＣ－ＭＳ条件（SIMモード：m/z３０８）により定量分析をした。
　結果を表３に示す。当該試験濃度では、酵母エキスとルッコラの種から調製した試料及びγ－グルタミルシステイン含有酵母エキスとルッコラの種から調製した試料は、シスチンをコントロールとしたときに比べて約１．３～１．４倍近いグルタチオン量の増加が認められたことから、シスチンとの併用により更にグルタチオン量を増加させる効果が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（試験例３）
　実施例１で調製したエルシン－システイン結合体の美白作用を確認するために、以下の試験を実施した。
　Ｂ１６メラノーマをＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（高グルコース、血清１０％含有）にて培養した。コンフルエントになった細胞を、トリプシンにて剥がし、９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞がプレートに接着後、各サンプル（コントロール（サンプル添加なし）、エルシン－システイン結合体、比較対象としてコウジ酸を図８記載の濃度で添加したＤＭＥＭと培地交換し、３日間培養した。３日後、プレートリーダー（ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ　ＦＣ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。コントロールの測定値（吸光度）を１００％と規定した場合の、各サンプル所定濃度添加３日後の吸光度を相対％にすることにより、コントロール中の黒色メラニン量を１００％とした場合の、各サンプルの黒色メラニン量を相対％として算出した。
　結果を図８に示す。エルシン－システイン結合体は、コントロールに比べ細胞から放出される黒色メラニン量を濃度依存的に抑制し、その抑制効果はコウジ酸より５～１０倍程度強いことが示唆された。
（試験例４）
　実施例１で調製したエルシン－システイン結合体について、２５℃、冷暗所にて保存した際の含量変化を確認した。試料１ｍｇを量りとり５ｍＬの５０％アセトニトリル水溶液でメスアップした溶液について、下記の条件でＬＣ分析を行い、含有量の変化を確認した。結果を図９に示すとおり、多少含量誤差によって増加傾向として検出されているが、約24週（6か月）においても含量低下は確認されなかった。
＜ＬＣ／ＤＡＤ／MS条件＞
カラム：L-column ２（２．１x２５０mm、化学物質評価研究機構）
移動相：０－３０min　１０－６０％アセトニトリル水溶液 
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２５４ｎｍ
　本出願は、日本で出願された特願２０１３－１４０２３１を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (17)

  1. 　イソチオシアネートを含有する植物素材及び含硫化合物を含有する酵母エキスを水性媒体中で反応させることを特徴とする、イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物の製造方法。
  2. 　水性媒体がエタノールを含む水性媒体である請求項１に記載の製造方法。
  3. 　イソチオシアネートが、スルフォラファン、エルシン、ベンジルイソチオシアネート、アリルイソチオシアネート、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート及びその塩から選択される少なくとも一種である請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　イソチオシアネートを含有する植物素材がアブラナ科キバナスズシロ属（Erucca sp.）の植物体由来である請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　アブラナ科キバナスズシロ属（Erucca sp.）の植物体がルッコラ（Erucca sativa）である請求項４に記載の製造方法。
  6. 　含硫化合物がグルタチオン、システイン、γ－グルタミルシステイン及びその塩から選択される少なくとも一種である請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　酵母エキスがサッカロマイセス属（Saccharomyces属）又はキャンディダ属（Candida属）に属する酵母由来である請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　エタノールを含む水性媒体が含水エタノールである請求項２～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　含水エタノールのエタノール濃度が３０～６０％（ｖ／ｖ）である請求項８に記載の製造方法。
  10. 　イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする、グルタチオン生成促進用組成物。
  11. 　イソチオシアネートが、スルフォラファン、エルシン、ベンジルイソチオシアネート、アリルイソチオシアネート、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート及びその塩から選択される少なくとも一種である請求項１０に記載のグルタチオン生成促進用組成物。
  12. 　含硫化合物がグルタチオン、システイン、γ－グルタミルシステイン及びその塩から選択される少なくとも一種である請求項１０又は１１に記載のグルタチオン生成促進用組成物。
  13. 　イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする、美白用組成物。
  14. 　イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする、抗酸化用組成物。
  15. 　イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩の有効量を対象に対して投与することを特徴とする、グルタチオン生成促進方法。
  16. 　イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩の有効量を対象に対して投与することを特徴とする、美白方法。
  17. 　イソチオシアネートと含硫化合物がジチオカーバメート構造で結合した化合物又はその塩の有効量を対象に対して投与することを特徴とする、酸化ストレス抑制方法。
     
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