JP2006265250A - ルテオリン６−ｃ−グルコシドの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
ササ及び／又はタケの葉を原料にして優れた抗酸化活性を有する組成物を製造する方法を提供する。
【解決手段】
ササ及び／又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、クロロフィルを除去した後、ジエチルエーテル等で液・液分配を行わせ、水層の液を取り出し、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液を採取し、上記ジエチルエーテル等で液・液分配後の水層又は上記酢酸エチル層からルテオリン６−Ｃ−グルコシドを得る。低級脂肪族アルコール抽出液又は分画液を加水分解することで収率を上げることができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、ササの葉を原料として、優れた抗酸化活性を有するルテオリン６−Ｃ−グルコシドを製造する方法に関するものである。

植物由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシド（イソオリエンチン）が肝細胞増殖因子や神経成長因子等の成長因子産生増強効果があることは、例えば、国際特許公開ＷＯ０１／０７６６１４号公報（特許文献１）に記載されており、同公報には、タケの葉粉末に対し抽出溶媒（たとえば、水）を加えて抽出し、抽出物の凍結乾燥物を調製し、アルコール含有飲料を調製するに当り、当該乾燥物を０．１μｇ／ｍｌとなるように添加することにより、イソオリエンチンを１００μｇ／ｍｌ含むアルコール含有飲料を調製できる旨記載されている。しかしながら、イソオリエンチンを単離することについては記載がない。

また、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド（イソオリエンチン）等のＣ−グリコシルフラボン類がソバの芽生えから採取し得ることが、「日本食品科学工学会誌」第５０巻第１号（２００３年１月）３２−３４頁（非特許文献１）に記載されている。しかし、この方法では４種のＣ−グリコシルフラボン類の混合物が取得されるに過ぎない。また、ソバの芽生えという特殊な原料を使用するためコストがかさむという問題がある。

国際特許公開 ＷＯ０１／０７６６１４号公報 「日本食品科学工学会誌」第５０巻第１号（２００３年１月）３２〜３４頁

本発明は、ササ又はタケの葉を原料にして、卓越した抗酸化活性を有する化合物であるルテオリン６−Ｃ−グルコシドを製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドを製造するための植物としてササ又はタケ類に注目した。ササの仲間は、オカメザサ属、ササ属、アズマザサ属等から成り、タケの仲間は、マダケ属、ナリヒラダケ属、トウチク属から成っている。中でもササ類は、温帯や亜寒帯に広く分布する植物で、ササ属は日本を分布の中心とし、全国に種類、量ともに広く分布する。

本発明によれば、ササ又はタケの葉からルテオリン６−Ｃ−グルコシドを製造する方法として、
（１）ササ又はタケの葉の低級脂肪族アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール等の炭素数３以下のアルコールをいう、以下同じ）、アセトン、アセトニトリル、熱水又は希酸溶液による抽出液から、当該溶液を蒸発するとともに水に置換又は加水して濾過するか又は石油エーテルで液・液分配を行わせて水層の液を取り出すことでクロロフィルを除去した後、該水層の液に酢酸エチルを添加して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液ならびに水層、ジエチルエーテル層を採取しササ葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドを得ることを特徴とする製造方法、
（２）ササ又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配して水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを配合して液・液分配を行い、水層の液を採取し、該層からルテオリン６−Ｃ−グルコシドを得ることを特徴とするルテオリン６−Ｃ−グルコシドの製造方法
（３）ササ葉及び／又はタケ葉を低級脂肪族アルコールで抽出し、前記抽出液を濃縮し、水に置換又は加水して濾過することによりクロロフィルを濾去し、濾去後の水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層からルテオリン６−Ｃ−グルコシドを採取することを特徴とするルテオリン６−Ｃ−グルコシドの製造方法、並びに、
（４）ササ又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液を加水分解した液、又は分画した液を加水分解してルテオリン６−Ｃ−グルコシドの含量を増大させた液からルテオリン６−Ｃ−グルコシドを採取する上記（１）〜（３）のルテオリン６−Ｃ−グルコシドの製造方法、
が提供される。

本発明の製造方法における目的化合物は、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド（イソオリエンチンとも称される）である。ルテオリン６−Ｃ−グルコシド自体は、下記の化学式で表される既知の化合物ではあるが、後述する実施例に示すとおり、ササ又はタケの葉から製造することは知られていない。また、ササ又はタケの葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、良好なＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性を有するのに加え、脂質過酸化物抑制活性にも優れているだけでなく、驚くべきことに、極めて優れた褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害活性を有する。しかも、その活性は、一般に知られているＰＰＯ阻害剤、他のフラボノイド類とは比較にならないほどに優れたものである。ササ又はタケの葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドがこのような優れた特性を有することは、従来全く知見がなく、誰もが予想し得ないところであった。

上記化合物の１Ｈ−ＮＭＲの値は、δ＝３．４１（ｍ，１Ｈ，５’’−Ｈ），３．４４−３．４９（ｍ，２Ｈ，３’’，４’’−Ｈ），３．７２（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６’’−ＣＨＨ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６’’−ＣＨＨ），４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２’’−Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ，１’’−Ｈ），６．４９（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）である。

以下、本発明の製造方法に関し、原料及び各工程、並びに得られるルテオリン６−Ｃ−グルコシドについて、以下に順次詳述する。

（原料）
本発明方法において好適な原料となるササは、クマイザサ、チマキザサ、クマザサ、チシマザサ、ミヤコザサ、ヤクシマダケ、スズタケ等その種類は問わない。これらのササの葉の部分を、水洗した後、必要に応じて適当な大きさに細断し乾燥（水分除去）して使用する。ササ葉は、粉末にしてもよく、枯れさせてもよい。本発明方法ではササのほかタケの葉も同様に使用可能であるが、以下はササ葉を使用する場合について説明する。

本発明方法では、上記の原料を用いて、図１に例示するようなフローで抽出及び液・液分配を行う。各工程の具体例は、以下のとおりである。
（第１工程：アルコール抽出・蒸発乾固・粗抽出液の調製）
ササ葉１ｇに対して１０倍容の低級脂肪族アルコールで抽出する。抽出は暗所で２４時間放置し、２４時間後濾過する。この操作を４回繰り返し、得られた濾液をあわせ、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、試料重量の２倍容の純水に溶解する。このようにして得られた溶液を粗抽出液とする。

（第２工程：石油エーテルによる液・液分配）
上記の粗抽出液に対して同量の石油エーテルを加え、分液ロートにて水・石油エーテル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、石油エーテル層と水層とを得る。石油エーテル層にはクロロフィルが含まれるので廃棄する。

（第３工程：ジエチルエーテルによる液・液分配）
次に、得られた水層に該水層と同量のジエチルエーテルを添加し、分液ロートにて水・ジエチルエーテル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、ジエチルエーテル層、水層を得る。そして、ジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターで乾固する。

（第４工程：酢酸エチルによる液・液分配）
第３工程で得られた水層に、該水層と同量の酢酸エチルを加え、分液ロートにて、水・酢酸エチル溶媒の液・液分配を行う。この操作を２〜３回繰り返し行い、酢酸エチル層、水層を得る。各層をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、メタノールに置換する。

（組成物に含まれる有効成分）
上述のようにして得たジエチルエーテル層には、主にトリシンが含まれ、酢酸エチル層には、主にルテオリン６−Ｃ−アラビノシド、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド及びトリシンが含まれる。一方、水層には、主にルテオリン６−Ｃ−グルコシドが含まれる。

（ルテオリン６−Ｃ−グルコシドの単離・精製方法）
したがって、水層から目的のルテオリン６−Ｃ−グルコシドを得るには以下に述べる方法が採用される。また、酢酸エチル層からルテオリン６−Ｃ−グルコシドを得るには水層と同様に以下の方法が採用される。ここで、各層に含まれるルテオリン６−Ｃ−グルコシド単離・精製及び同定について詳細に説明する。

メタノールに置換した上記水層又は酢酸エチル層２ｍｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０をガラス管（内径２ｃｍ、高さ９０ｃｍ）に充填したカラムクロマトグラフィーにアプライする。溶離液に６０％メタノールを用い、フラクションコレクターで８ｍｌずつ分画する。それぞれのフラクションについて波長３５０ｎｍ、３３０ｎｍ及び２５０ｎｍにおける吸光度に従い分画し、ピークを得たら、該当ピークを濃縮しフォトダイオードアレイ検出器を用いたＨＰＬＣによる分取を行う。
この際のＨＰＬＣの条件は下記のとおりである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ）
移動相：水／アセトニトリル／メタノール＝７／２／１（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：６．０ｍｌ／ｍｉｎ
オーブン温度：４０℃

なお、水層、酢酸エチル層から後述する加水分解によっても、目的物質を得ることができる。すなわち、各層を加水分解後ジエチルエーテルで液・液分配した水層について、酸や遊離糖を除くためにＸＡＤカラムに供し、水洗後メタノールで回収し、これを濃縮し上記の単離・精製手順を行う方法でもササ葉を原料として目的物質を製造することができる。

（物質の同定）
得られる組成物に含まれる有効成分の化合物は、吸収スペクトル分析、質量分析及びＮＭＲ分析等により同定することが出来る。以下、本発明者らが実施した同定法について詳述する。
＜吸収スペクトル法＞
精製物をメタノールに溶解し、４５０〜２３０ｎｍにおけるＵＶ・ＶＩＳ吸収スペクトルを測定する。すなわち、試料のメタノール溶液を測定した後、ナトリウムメチラート（ＮａＯＭｅ）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ_３）、１２％塩酸（１２％ＨＣｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、ホウ酸（Ｈ_３ＢＯ_３）の各種試薬を添加し吸収スペクトルを測定する。
その結果は、下記の表１に示すとおりである。なお、表１には、ルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）のほか、参照例として、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）及びトリシン（Ｔｒｉｃｉｎ）のデータも併記している。

吸収スペクトルによるルテオリン６−Ｃ−グルコシドの同定は、次のような手順による。すなわち、ＮａＯＭｅ添加によってＢｄ．Ｉが４５〜６５ｎｍの深色移動することから、３位の遊離水酸基の欠如又は酸素化（ＯＲ）が示唆され、また、Ｂｄ．Ｉの極大吸収が増大することより、４’位に遊離水酸基の存在することがわかる。
ＡｌＣｌ_３添加によってＢｄ．Ｉが深色移動することより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基ないしは隣接する遊離水酸基が存在する。ＡｌＣｌ_３＋ＨＣｌ添加によってＡｌＣｌ_３のＢｄ．Ｉより浅色移動するが元のＢｄ．Ｉに戻りきらないことより、３位又は５位又はその両方に遊離水酸基が存在し、さらにＢ環中に隣接する遊離水酸基の存在する。そして、ＮａＯＡｃ添加によりＢｄ．ＩＩが５〜２０ｎｍの深色移動することから７位に遊離水酸基が存在する。ＮａＯＡｃ＋Ｈ_３ＢＯ_３添加によってＢｄ．Ｉから１２〜３６ｎｍの深色移動することより、３’，４’位に遊離水酸基が存在することがわかる。
以上のことより、３’，４’，５，７位に遊離水酸基が存在するフラボン骨格のルテオリンであることが、そして、Ｂｄ．ＩＩに２つの極大が見られることから６位又は８位に結合糖が存在することがわかる。

＜質量分析＞
精製した試料について、パーセプティブ社製質量分析計Ｍａｒｉｎｅｒを用い、分子量を正イオンモード（ＰＯＳ）で測定する。条件は下記の表２に示すとおりである。（なお、表２でも参照例として、ルテオリン６−Ｃ−アラビノシド及びトリシンのデータも併記している。）
［質量分析条件］
内部標準：４−ａｃｅｔａｍｉｄｏｐｈｅｎｏｌ（ｍ／ｚ１５２．０７），ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ（ｍ／ｚ６０９．２８）
インターフェイス：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）
温度：室温（２５℃）

質量分析によるルテオリン６−Ｃ−グルコシドの同定では、上記吸収スペクトルで糖の結合が示唆されたが、ルテオリン骨格であることを考慮するとｍ／ｚから結合糖はヘキソース１つであることがわかる。またイオン化の際に断片化を生じていないことから、糖とアグリコンの結合はＣ結合であることがわかる。

＜ＮＭＲ分析＞
それぞれ、十分に乾燥した試料を２〜１０ｍｇ計量採取し、ＮＭＲ測定管に移して重メタノールもしくは重ジメチルスルホキシド０．７ｍｌに溶解する。^１Ｈ−ＮＭＲをＪｅｏｌＪＮＭ−Ａ４００（４００ＭＨｚ）にて測定する。（内部標準：ＣＤ３ＯＤ，３．３０，ＤＭＳＯ−ｄ６，２．４９）

^１Ｈ−ＮＭＲによるルテオリン６−Ｃ−グルコシドの測定値は以下のとおりである。
δ＝３．４１（ｍ，１Ｈ，５’’−Ｈ），３．４４−３．４９（ｍ，２Ｈ，３’’，４’’−Ｈ），３．７２（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６’’−ＣＨＨ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ，１Ｈ，６’’−ＣＨＨ），４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ，２’’−Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ，１’’−Ｈ），６．４９（ｓ，１Ｈ，８−Ｈ），６．５６（ｓ，１Ｈ，３−Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，５’−Ｈ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ，２’−Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ，６’−Ｈ）．

芳香族由来と思われるシグナルが５種類それぞれ１Ｈ観測される。そのうちδ＝６．８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３６（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．４Ｈｚ）の３種のシグナルの結合定数から、３置換ベンゼンの存在が推定され、置換位置は、オルト及びパラであると考えられる。また、その他２種の芳香族プロトンδ＝６．４９（ｓ），６．５６（ｓ）は一重線であるが、その化学シフトと前述の３種の化学シフトを既知化合物であるルテオリンと比較すると、かなりよい一致を示すので、アグリコン部はルテオリンであると推定される。ただし、ルテオリンの６位に相当するシグナルは観測されないので、６位に何らかの置換基の存在が示唆され先の吸収スペクトルの結果によく一致する。

次に、δ＝３．４１（ｍ，１Ｈ），３．４４−３．４９（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ）のシグナルにより、糖の存在が示唆される。アノマー位（１’’位）のプロトン４．９０（ｍ）に隣接すると考えられるプロトン４．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６，９．６Ｈｚ）の結合定数より、２’’位は二つの隣接するプロトンとアキシアル−アキシアルの関係にあると考えられる。すなわち、糖部分はβ結合にてアグリコン部に結合していると推定される。また、その化学シフトがＯ−グルコシドよりも高磁場シフトしていることから、Ｃ−グリコシル化しているものと考えられ、先の質量分析の結果に一致する。糖部分のシグナルの化学シフトと結合定数はグルコースのものとよい対応を示すことから糖部分はグルコースであると推定される。
以上、アグリコン部、糖部を総合し、先の吸収スペクトルと質量分析結果とをあわせて考慮した結果、この化合物はルテオリン６−Ｃ−グルコシドと決定することができる。

本発明のルテオリン６−Ｃ−グルコシドの製造方法によれば、日本各地に生育し容易に入手できるササ又はタケの葉を原料とするため、原料のコストが安いという利点がある。さらに、得られたルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、ＤＰＰＨラジカル消去活性、スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性（ＳＯＤ様活性）、脂質過酸化抑制効果等に優れており、しかも、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害効果が極めて大きいという利点を有する。
したがって、本発明方法により製造されるルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、医薬品、化粧品、食品等の分野で有用である。また、一般に、ルテオリン配糖体には、抗酸化の他に、抗炎症、ガン予防、抗不整脈作用等が報告されており、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドにも、本発明者らが確認した抗酸化活性のほかに、抗炎症、ガン予防、抗不整脈作用等も期待される。

以下に、本発明方法の実施例及び比較例を詳述する。ただし、本発明はこれらの実施例によってその範囲が限定されるものではない。なお、例中の％は特に断らない限り重量％を意味する。
なお、抗酸化活性の測定は次のように実施した。

１．ＤＰＰＨラジカル消去活性
安定なラジカルであるＤＰＰＨラジカルに対するラジカル消去活性について検討した。
０．５ｍＭのＤＰＰＨラジカル・エタノール溶液１００μｌ、試料１００μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。それぞれを下記条件のＥＳＲに供し、ラジカルの消去率を（１−試料値／ブランク値）×１００として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｗｉｄｔｈ：４０μＴ
Ｓｗｅｅｐ Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ ｃｏｎｓｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２５０

２．スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性（ＳＯＤ様活性）
ヒポキサンチンを基質とし、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の反応によるスーパーオキシドアニオンラジカル発生系を用い、ＳＯＤ様活性を測定した。この測定では、原液ＤＭＰＯ（ラボテックＮＨ−６８７）１５μｌ、５ｍＭのＨｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ Ｈ−９３７７）５０μｌ、５．５ｍＭのＤＴＰＡ（同仁化学３４７−０１１４１）３５μｌ、試料５０μｌ、０．４Ｕ／ｍｌのＸＯＤ（ＳＩＧＭＡ Ｘ−４３７６）５０μｌの順に小ワッセルマンに採取し混合した。すばやく攪拌し、偏平セルに吸い上げてキャビティに挿入し、一定時間後（４５秒）にＥＳＲ装置（ＪｅｏｌＪＥＳ−ＦＲ３０）に装填し測定を開始した。ブランクには超純水又はアセトニトリルを用いた。それぞれを下記条件のＥＳＲに供し、スーパーオキシドアニオンラジカルの消去率を（１−試料値／ブランク値）×１００（％）として求めた。
Ｆｉｅｌｄ：３３５±５ｍＴ
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｗｉｄｔｈ：０．０７９ｍＴ
Ｓｗｅｅｐ Ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｔｉｍｅ ｃｏｎｓｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｍｐ：２５０

３．脂質過酸化抑制効果
４％リノール酸メチル・メタノール溶液１０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを遠沈管に採取し、試料１ｍｌ加え、オーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。試料はササ葉１ｇ／１００ｍｌの濃度になるように調製した。ブランクとしてメタノール、対象として２０ｐｐｍトコフェロールを試料の代わりに加え、同様にオーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。
生じた過酸化脂質の過酸化物価（ＰＯＶ）を常法にしたがって測定し、抗酸化剤が無い状態のコントロールのＰＯＶを０％とし、試料の脂質過酸化抑制率を求めた。

（１）組成物の調製
原料のササ葉として北海道に自生しているクマイザサ（Ｓａｓａ ｓｅｎａｎｅｎｓｉｓ）の葉（採取地：網走市葉八坂）を用い、これを図１に示すような手順で、以下のように処理し、液状の組成物を得た。まず、水洗したササ葉１ｇに５倍容のメタノールを加え浸漬、抽出した。暗所で２４時間放置して抽出した後、濾過した。次いで、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、ササ葉重量の２倍容の純水に溶解した。得られた水溶液を粗抽出液とした。
上記の粗抽出液に対して、等量の石油エーテルを加え、水・石油エーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、石油エーテル層及び水層を得た。得られた水層を用い、水・ジエチルエーテル溶媒の液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、ジエチルエーテル層と水層とを得た。得られた水層を採取してこれに酢酸エチルを加え、水・酢酸エチルの液・液分配を行った。この操作を２〜３回繰り返し行い、酢酸エチル層及び水層を得た。
置換した各層の液状組成物を用い、フェノール物質の定量及び抗酸化活性の測定を行った。

（２）ルテオリン６−Ｃ−グルコシドの単離・精製
上記の組成物から、次のようにしてルテオリン６−Ｃ−グルコシドを単離し精製した。
水層及び酢酸エチル層をロータリーエバポレーターでそれぞれ濃縮し、メタノールに置換した各層２ｍｌを、カラムクロマトグラフィー（セファデックスＬＨ−２０）をガラス管（内径２ｃｍ、高さ９０ｃｍ）に充填したカラムクロマトグラフィーにアプライした。溶離液に６０％メタノールを用い、フラクションコレクターで８ｍｌずつ分画した。それぞれのフラクションについて波長３５０、３３０及び２５０ｎｍにおける吸光度に従い分画し、ピークを得たら、該当ピークを濃縮し、フォトダイオードアレイ検出器を用いたＨＰＬＣによる分取を行い目的物質を得た。このときのＨＰＬＣの条件は下記のとおりである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ）
移動相：水／アセトニトリル／メタノール＝７／２／１（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：６．０ｍｌ／ｍｉｎ
オーブン温度：４０℃

上記のごとく、ササ葉から抽出し同定したルテオリン６−Ｃ−グルコシドの安定性を調べる目的で、耐熱性及び耐光性の試験を行った。耐熱性試験は１００℃の条件で行い、耐光性試験は紫外線照射により行った。それぞれの試験において、比較試料としてルテオリン７−Ｏ−グルコシドを用いた。
耐熱性試験の結果を図２及び図４に、耐光性試験の結果を図３及び図５に示す。その結果、図２及び図４に示すように、１００℃における耐熱性では、時間経過と共に残存率の減少傾向がみられたが、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドはルテオリン７−Ｏ−グルコシドに比べても安定性が高かった。抗酸化活性は両試料ともに大幅な低下は見られなかった。また、耐光性についても、図３及び図５に示すように、紫外線照射による大きな変化は認められなかった。

この結果より、ササ葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドは１００℃では壊れにくく、実用上十分な熱安定性を有すること、紫外線に対する安定性が高く耐光性にも優れていること、がわかった。下記の表３に、上記化合物とその他の類似化合物の精製品の抗酸化活性をまとめて示す。

なお、表３中の油脂過酸化抑制率の測定は次のように行った。
＜油脂過酸化抑制率の測定＞
（１）試料油脂の調整
４％リノール酸メチル・メタノール溶液１０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを遠沈管に採取し、試料１ｍｌ加え、オーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。試料はササ葉１ｇ／１００ｍｌの濃度になるように調製した。ブランクとしてメタノール、対象として２０ｐｐｍトコフェロールを試料の代わりに加え、同様にオーブンで５５℃、４８時間加熱処理し、過酸化脂質を生成させた。
（２）ＰＯＶ検定
ＰＯＶ検定は、日本油脂学会による酸化油脂中の過酸化物価の測定法に従い、過酸化脂質（ヒドロペルオキシド）が酸性条件下で還元される反応に基づき、遊離されるヨウ素をチオ硫酸ナトリウムで滴定する方法で行った。
重クロム酸カリウムを純水に溶解し、０．０１Ｎ重クロム酸カリウム溶液を作成する。このとき、重クロム酸カリウム溶液のファクター（ｆ＝採取量／理論値）を求めておいた。ヨウ化カリウム１ｇを純水５ｍｌに溶解させた。そこに０．０１Ｎ重クロム酸カリウム溶液２０ｍｌ、塩酸５ｍｌを加え、撹拌後栓をして５分間暗所に放置した。５分後、純水３００ｍｌを加え、遊離ヨウ素を０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。褐色が消えかかったら、１％澱粉指示薬を加え、青色が完全に消失するまで滴定した。滴定値がＶｍｌのとき、０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液のファクターは、Ｆ＝２０×ｆ／Ｖで求め、滴定を行った。
上述のように調製した試料油脂１ｇを採取し、クロロホルム−氷酢酸混液（３：２）２５ｍｌ、飽和ヨウ化カリウム溶液１ｍｌを加え、すぐに撹拌し、１分間暗所に放置した。反応を止めるために純水７５ｍｌを加えた。２層に分かれる上層の赤紫色の消失を終点とし、遊離ヨウ素を０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。空試験には純水１ｇを用いて行った。

表３に示す結果から、本発明によるササ葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、良好なＤＰＰＨラジカル消去活性、ＳＯＤ様活性を有するのに加えて、脂質過酸化物抑制活性に優れていることがわかった。

次に、ササ葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドについて、褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）の阻害効果を調べる目的で、一般に知られているＰＰＯ活性阻害剤、他のフラボノイド類との比較測定を行った。その測定方法は以下のとおりであり、測定結果は下掲の表４に示すとおりである。

＜ＰＰＯ（褐変酵素ポリフェノールオキシダーゼ）阻害活性の測定＞
０．０５Ｍクロロゲン酸を基質とし酵素液としてタマネギ鱗茎より抽出・部分精製を行った酵素液を用いた。すなわち、１．３ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に１ｍＭ濃度、２ｍＭ濃度、１０ｍＭ濃度に調製した阻害剤を０．１ｍｌ、酵素液を０．１ｍｌ添加し混合、３０℃に１０分間予備加温後、０．０５Ｍクロロゲン酸基質溶液を０．１ｍｌ加え混合し、３０℃、３０分間加温後の波長４２０ｎｍにおける褐変度を求めた。阻害剤添加の代わりに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えたものをコントロールとし、活性を１００％として阻害効果を相対活性で示した。

この結果、ササの葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、一般のＰＰＯ活性阻害剤や他のフラボノイド類と比べて卓越したＰＰＯ阻害活性を有し、少量の使用でも褐変を防止できることがわかった。したがって、本発明方法によるルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、例えば、食品類の褐変防止剤として有効に利用することができる。

さらに、前記ササの葉から抽出単離したルテオリン６−Ｃ−グルコシド及びルテオリン、ルテオリン７−Ｏ−グルコシドについても、同様の方法でヒト白血病細胞の増殖抑制効果を測定した。その結果は図６に示すとおりであり、ササの葉由来のルテオリン６−Ｃ−グルコシドは、卓越した高い増殖抑制効果を有することが確認された。

本実施例では、クマイザサ抽出液を加水分解した場合について説明する。試料葉にはトリシンアグリコンを含まないもの（採取地：北海道津別町相生）を使用した。
クマイザサの葉をメタノールで抽出した液（メタノール溶液）に塩酸（最終濃度が０．２〜０．７Ｎ）を加えて（抽出液と塩酸の比率は１：１になるようにする）、混合後、１００℃のウォーターバスで３０分間加熱して加水分解を行わせ、３０分後、氷中で冷却した。加水分解後、ＬＨ−２０カラムに供し、精製工程で、各加水分解物（無処理を含む）はＸＡＤカラムに吸着させ、加水分解物から酸を洗い流し、メタノールに溶媒置換後、ＬＨ−２０カラムに供し、精製後、ＨＰＬＣで定量分析した。

まず、図７にササ葉抽出液の非加水分解物のＬＨ−２０溶出パターンを示す。そして、ササ葉抽出液を０．２Ｎ塩酸で１００℃、３０分間、加水分解した後のＬＨ−２０溶出パターンを図８に、０．７Ｎ塩酸で１００℃、３０分間加水分解した後のＬＨ−２０溶出パターンを図９に示す。
図７のＢＩＩはルテオリン６−Ｃ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ ６−Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）の溶出ピーク、ＢＩＩＩはルテオリン６−Ｃ−アラビノシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ６−Ｃ−ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）のピークであり、トリシンアグリコンは図８では２ＨＩＩＩのピークである。それぞれの処理によって得られるルテオリン６−Ｃ−グルコシドの結果を、図１０に示す。なお、ＨＰＬＣやＸＡＤカラム、ＬＨ−２０カラムの条件は既に述べた条件と同じである。

図７、図８、図９より、加水分解前の図７のＢＩピークが減少し、加水分解前により図８の２ＨＩＩＩ及び図９の７ＨＩＩＩが新たに検出することが確認できる。図７のＢＩＩピーク、図８の２ＨＩピーク及び図９の７ＨＩピークは溶出位置から同じ成分であることがわかる。これらのピークはルテオリン６−Ｃ−グルコシドである。

また、図１０より酸加水分解処理を行うことでルテオリン６−Ｃ−グルコシドの含量が約１．７倍多くなったことがわかる。したがって、最終濃度０．２〜０．７Ｎの塩酸で１００℃、３０分間加熱処理することでルテオリン６−Ｃ−グルコシドの収量を上げることが出来る。

本実施例では、クマイザサ抽出液を分画した液を加水分解した場合について説明する。
クマイザサのメタノール抽出液のＬＨ−２０カラム分画液（メタノール溶液）に塩酸（最終濃度が０．２〜０．７Ｎ）を加えて（分画抽出液と塩酸の比率は１：１になるようにする）、混合後、１００℃のウォーターバスで３０分間加熱して加水分解を行わせ、３０分後、氷中で冷却した。

図１１に、上記図７の無処理ササ葉抽出液をＬＨ−２０カラム分画結果の配糖体が含まれていると考えられるフラクション（ＢＩ）を上記のように加水分解して得られるルテオリン６−Ｃ−グルコシド量の定量結果を示す。この図１１から明らかなように、クマイザサの低級脂肪族アルコール抽出液をカラムクロマトグラフィー（セファデックスＬＨ−２０カラム）で分画した後でも、加水分解処理を行うことにより、高収率でルテオリン６−Ｃ−グルコシドを得ることが出来ることが確認された。

以上より、ルテオリン６−Ｃ−グルコシドの収量を上げる方法として、
（１）クマイザサ抽出液（粗抽出液、水層及び酢酸エチル層）の酸加水分解による方法、及び
（２）分画後ピークの酸加水分解による方法、
の２つの方法があることが確認された。

本実施例では、クマイザサ葉（採取地：北海道津別町相生）約２００ｇを切り刻み、メタノールに一晩浸し、これを２回繰り返した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し水に置換した。これに等量の石油エーテルを加え液・液分配し、残存するクロロフィルを石油エーテル層に移行させて除去した。残った水に等量のジエチルエーテルを加え、液・液分配し得られる水層をカラムクロマトグラフィー（セファデックスＬＨ−２０カラム）に供することにより、図１２に示すルテオリン６−Ｃ−グルコシドの画分を得た。この画分のルテオリン６−Ｃ−グルコシドの純度は約９８％を示した。この画分を先に述べた分取ＨＰＬＣを１回実施することで、高純度のルテオリン６−Ｃ−グルコシドを得ることができた。

本発明の方法の工程概略図 ルテオリン６−Ｃ−グルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐熱性測定結果を示すグラフ ルテオリン６−Ｃ−グルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐光性測定結果を示すグラフ ルテオリン６−Ｃ−グルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐熱試験における時間経過によるＤＰＰＨラジカル消去活性の変化を示すグラフ ルテオリン６−Ｃ−グルコシドとルテオリン７−Ｏ−グルコシドの耐光試験における時間経過によるＤＰＰＨラジカル消去活性の変化を示すグラフ ルテオリン６−Ｃ−グルコシド、ルテオリン及びルテオリン７−Ｏ−グルコシドについてヒト白血病細胞の増殖抑制を測定した結果を示すグラフ クマイザサ抽出液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画のチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２１．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、ＢＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．６６〜９４、ＢＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．９５〜１１５、ＢＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１１６〜１４３に分画） クマイザサ抽出液を加水分解（最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱）処理した抽出液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画のチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２１．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、２ＨＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．９１〜１１２、２ＨＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１１３〜１３２、２ＨＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１９９〜２２０に分画） クマイザサ抽出液を加水分解（最終濃度０．７Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱）処理した抽出液のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画のチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２１．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ、７ＨＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．８８〜１０８、７ＨＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１０９〜１３２、２ＨＩＩＩ：Ｆｒａｃ．Ｎｏ．１８９〜２１２に分画） ルテオリン６−Ｃ−グルコシド含量を示すグラフであって、図７のＢＩＩピーク、図１８２の２ＨＩピーク及び図９の７ＨＩピークの各ピークに含まれるルテオリン６−Ｃ−グルコシドを定量したときの結果を示すデータ（ＢＩＩピークを未処理、２ＨＩピークを０．２Ｎ塩酸処理、７ＨＩピークを０．７Ｎ塩酸処理としてそれぞれＸ軸表記） ＢＩピークの酸加水分解によるルテオリン６−Ｃ−グルコシド含量の変化を示すグラフであって、図７のＢＩピークの画分に加水分解（最終濃度０．２Ｎ塩酸、１００℃、３０分間加熱）処理を施したときのデータ（酸加水分解無処理前のものを「水解前」、酸加水分解処理したものを「水解後」とＸ軸に表記） ジエチルエーテルによる分配で得られる水層のセファデックスＬＨ−２０カラムによる分画のチャート（ＬＨ−２０カラム条件＝カラム径：２１．Ｄ．×８０ｃｍ、移動相：６０％メタノール、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、分画サイズ：８ｍｌ）（試料ササ葉採取地：北海道津別町相生）

Claims (4)

1. ササ又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換して濾過するか又は石油エーテルで液・液分配することによりクロロフィルを除去し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配して水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを配合して液・液分配を行い、酢酸エチル層の液を採取し、該層からルテオリン６−Ｃ−グルコシドを得ることを特徴とするルテオリン６−Ｃ−グルコシドの製造方法。
2. ササ又はタケの葉の低級脂肪族アルコール抽出液から、該アルコールを蒸発するとともに水に置換して濾過するか又は石油エーテルで液・液分配することによりクロロフィルを除去し、石油エーテル及び／又はジエチルエーテルで液・液分配して水層の液を採取し、該水層の液に酢酸エチルを配合して液・液分配を行い、水層の液を採取し、該層からルテオリン６−Ｃ−グルコシドを得ることを特徴とするルテオリン６−Ｃ−グルコシドの製造方法。
3. ササ葉及び／又はタケ葉を低級脂肪族アルコールで抽出し、前記抽出液を濃縮し、水に置換又は加水して濾過することによりクロロフィルを濾去し、濾去後の水層にジエチルエーテルを添加し液・液分配を行い、得られる水層からルテオリン６−Ｃ−グルコシドを採取することを特徴とするルテオリン６−Ｃ−グルコシドの製造方法。
4. ササ又はタケの葉の抽出液を加水分解した液、又は、分画した液を加水分解してルテオリン６−Ｃ−グルコシドの含量を増大させた液からルテオリン６−Ｃ−グルコシドを採取することを特徴とする請求項１、請求項２又は請求項３記載のルテオリン６−Ｃ−グルコシドの製造方法。

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