CN113387988A - 一种白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本说明书一个或多个实施例提供一种白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法及用途，将白扁豆花除杂洗净干燥后粉碎，提取及初富集，AB‑8大孔树脂柱分离获得Fr.II，再经半制备高效液相色谱法(semi‑preparative HPLC)纯化，C18柱、乙腈和0.5％的乙酸‑水的流动相的梯度洗脱，收集各峰流出物，获得具有清除自由基、抑制α‑葡萄糖苷酶的活性的7个白扁豆花黄酮化合物，能用于药品、保健营养品的原料或添加剂。本发明制备的白扁豆花黄酮化合物，具有抗氧化、降血糖活性，制备方法简单，安全好，白扁豆花原料资源丰富，具有良好的开发应用前景。

Description

一种白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法及用途
技术领域
本说明书一个或多个实施例涉及白扁豆花黄酮的分离提纯技术领域，尤其涉及一种白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法及用途。
背景技术
白扁豆为药食两用植物，又名扁豆，沿篱豆，蛾眉豆，系豆科植物扁豆Dolichoslablab L成熟种子。在我国大部分地区都有栽培。白扁豆花为扁豆属植物的干燥花。现代药理研究表明，白扁豆花具有消暑，化湿之功效。
体内自由基过多，可导致细胞和组织器官损伤、诱发各种疾病、加速机体衰老等。黄酮类化合物是一类广泛存在于植物界的重要的生物活性物质，现代医学研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗病毒、抗肿瘤、抑菌、保护心脑血管、调节免疫等方面的作用。随着人们生活水平的提高，工作节奏的加快，饮食结构的改变，我国患有糖尿病和高血脂症者日渐增多。长期服用治疗药物，多会产生各种不同程度的副作用。因此，从天然产物中寻找抗氧化、降血糖活性成分，或将其主结构作为先导化合物进而研发新药，或开发功能性食品，具有毒性小、研发费用低、周期短和全民保健的优势。
发明人在研究植物成分的提取过程中发现白扁豆花黄酮成分具有不同于其他植物黄酮成分的性质，在提取过程中现有的植物成分的提取、纯化的方法，无法适用于白扁豆花黄酮成分的提取、纯化，采用现有的提取方法，获取的白扁豆花黄酮成分的生物活性很低，导致无法进行白扁豆花黄酮成分的生物活性的研究。
发明内容
有鉴于此，本说明书一个或多个实施例的目的在于提出一种白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法及用途，以解决现有技术中白扁豆花黄酮类化合物分离提纯存在的技术壁垒问题。
基于上述目的，本说明书一个或多个实施例提供了一种白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法，包括如下步骤：
粉碎：将白扁豆花进行烘干，然后用粉碎机粉粹，过筛，得白扁豆花粉；
提取及初富集：用乙醇对白扁豆花粉进行回流萃取，然后用石油醚洗涤萃取液并收集下层水相，石油醚洗涤萃取液具有除去鞣制、皂苷类杂质，然后对收集的水相进行旋转蒸发，并用正丁醇萃取富集黄酮类化合物，对提取的黄酮类化合物减压旋转蒸发至浸膏；
分离：将浸膏复溶于水中，用不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，依次对洗脱液进行减压旋蒸发、冷冻干燥，得白扁豆花黄酮类化合物组分Fr.Ⅰ、Fr.Ⅱ、Fr.Ⅲ和Fr.Ⅳ；
纯化：取组分Fr.Ⅱ，用甲醇溶解，采用半制备高效液相色谱法进行白扁豆花黄酮类化合物提纯，得纯白扁豆花黄酮类化合物。
可选的，所述半制备高效液相色谱法包含如下工艺参数：
色谱柱：Sunfire C18柱，规格为：150mm×10mm I.D.，粒径为：5μm；流动相：乙腈(A)和0.5％的乙酸-水(B)，柱温30℃，双通道波长为280nm和360nm。
可选的，所述半制备高效液相色谱法包含如下操作步骤：
梯度洗脱：0～5min采用10～17％乙腈溶液进行洗脱，5～10min采用17～19％乙腈溶液进行洗脱，10～25min采用19～26％乙腈溶液进行洗脱，25～26min采用26～10％乙腈溶液进行洗脱，26～28min采用10～10％乙腈溶液进行洗涤；
添加0.5％的乙酸水溶液至流动相中，检测并收集各流出物洗脱峰，得到保留时间Rt为11.732min、12.117min、13.345min、13.991min、15.361min、16.187min和16.531min 7个洗脱峰，然后减压旋转蒸发冻干，得到7个纯化白扁豆花黄酮化合物。
可选的，所述提取及初富集中乙醇的浓度为70％，温度为35℃。
可选的，所述分离中梯度洗脱的材料为AB-8大孔树脂柱，乙醇水溶液的浓度依次为20％、30％、50％和70％。
可选的，所述分离中乙醇水溶液的用量为10BV，流速为5mL/min。
一种白扁豆花黄酮类化合物，采用权利要求所述的制备方法制备而成。
可选的，所述白扁豆花黄酮类化合物具有清除ABTS+·、DPPH·DPPH·和对α-葡萄糖苷酶体外抑制活性的作用。
可选的，所述白扁豆花黄酮类化合物应用在功能性食品中。
可选的，所述白扁豆花黄酮类化合物具有抗氧化、降血糖作用。
从上面所述可以看出，本说明书一个或多个实施例提供的一种白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法，首先将白扁豆花进行粉碎，然后采用不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱得到白扁豆花黄酮类化合物4种成分，然后采用半制备高效液相色谱法对4种组分中的Fr.Ⅱ进行提纯，最终制备出的纯白扁豆花黄酮类化合物具有抗氧化、降血糖活性。同时，纯白扁豆花既是食品又是药品的花类植物，易栽培，开发其抗氧化、降血糖活性具备显著的经济和社会效益。
本申请提供的分离提纯的方法，通过不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱和半制备高效液相色谱法对提出的组分进行提纯的方法相互协作，分离提取的白扁豆花黄酮类化合物不仅更具有专一性，同时提高了提取的白扁豆花黄酮类化合物的生物活性，有利于进行白扁豆花黄酮成分的生物活性的研究。
附图说明
为了更清楚地说明本说明书一个或多个实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书一个或多个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本说明书一个或多个实施例白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法工艺流程图；
图2为本说明书一个或多个实施例获得7个白扁豆花黄酮类化合物的洗脱峰图；
图3为本说明书一个或多个实施例制备的白扁豆花黄酮类化合物在不同浓度条件下对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本公开进一步详细说明。
从植物中筛选提取有效清除自由基的能力的黄酮化合物，具有安全好、无致畸性和无致癌性等优点[鲁晓翔.黄酮类化合物抗氧化作用机制研究进展[J].食品研究与开发,2012,33(03):220-224.]。α-葡萄糖苷酶是机体内碳水化合物消化的一种关键酶，α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的化合物，α-葡萄糖苷酶抑制剂被认为是控制II型糖尿病的理想途径[缪子敬.广东化工[J].2019,46(17)96-98]。
梁侨丽报道采用酸化硅胶柱层析分离白扁豆花正丁醇萃取物，重结晶获得木犀草素，大波斯菊苷，木犀草素-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和野漆树苷[梁侨丽.中国药科大学学报[J].1996,27(4):205～207]。
发明人在研究植物成分的提取过程中发现白扁豆花黄酮成分具有不同于其他植物黄酮成分的性质，在提取过程中现有的植物成分的提取、纯化的方法，无法适用于白扁豆花黄酮成分的提取、纯化，采用现有的提取方法，获取的白扁豆花黄酮成分的生物活性很低，导致无法进行白扁豆花黄酮成分的生物活性的研究。
为了解决上述技术问题，本说明书一个或多个实施例提供了一种白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法，包括如下步骤：
粉碎：将白扁豆花进行烘干，然后用粉碎机粉粹，过筛，得白扁豆花粉；
提取及初富集：用乙醇对白扁豆花粉进行回流萃取，然后用石油醚洗涤萃取液并收集下层水相，石油醚洗涤萃取液具有除去鞣制、皂苷类杂质，然后对收集的水相进行旋转蒸发，并用正丁醇萃取富集黄酮类化合物，对提取的黄酮类化合物减压旋转蒸发至浸膏；
分离：将浸膏复溶于水中，用不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，依次对洗脱液进行减压旋蒸发、冷冻干燥，得白扁豆花黄酮类化合物组分Fr.Ⅰ、Fr.Ⅱ、Fr.Ⅲ和Fr.Ⅳ；
纯化：取组分Fr.Ⅱ，用甲醇溶解，采用半制备高效液相色谱法进行白扁豆花黄酮类化合物提纯，得纯白扁豆花黄酮类化合物。
同时本说明书一个或多个实施例提供了一种白扁豆花黄酮类化合物，采用上述所述的制备方法制备而成。
首先将白扁豆花进行粉碎，然后采用不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱得到白扁豆花黄酮类化合物4种成分，然后采用半制备高效液相色谱法对4种组分中的Fr.Ⅱ进行提纯，最终制备出的纯白扁豆花黄酮类化合物具有抗氧化、降血糖活性。同时，纯白扁豆花既是食品又是药品的花类植物，易栽培，开发其抗氧化、降血糖活性具备显著的经济和社会效益。
本申请提供的分离提纯的方法，通过不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱和半制备高效液相色谱法对提出的组分进行提纯的方法相互协作，分离提取的白扁豆花黄酮类化合物不仅更具有专一性，同时提高了提取的白扁豆花黄酮类化合物的生物活性，有利于进行白扁豆花黄酮成分的生物活性的研究。
具体的，本说明书一个或多个实施例提供了一种白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法，工艺流程图如图1所示，包括如下步骤：
粉碎：将白扁豆花在60℃的烘箱中烘干，然后用粉碎机粉粹，过80目筛，得到白扁豆花粉；
提取及初富集：用35℃、70％乙醇将白扁豆花粉回流萃取三次，用石油醚洗涤萃取液以除去鞣制、皂苷类杂质，收集下层水相部分并进行旋转蒸发除去石油醚残留液，然后用正丁醇萃取富集黄酮类化合物，并将富集的黄酮类化合物进行减压旋转蒸发至浸膏；
分离：将上述浸膏复溶于水中，上AB-8大孔树脂柱，用20％、30％、50％和70％乙醇-水洗脱液梯度洗脱，每种洗脱液用量10BV，流速为5mL/min，收集流出液，减压旋蒸去乙醇，冷冻干燥，分别获得组分Fr.Ⅰ、Fr.Ⅱ、Fr.Ⅲ和Fr.Ⅳ；
4)纯化：取组分Fr.II，用甲醇溶解,上半制备高效液相色谱法(semi-preparativeHPLC)制备黄酮类化合物。
色谱柱：Sunfire C18柱(150mm×10mm I.D.，5μm)。流动相：乙腈(A)和0.5％的乙酸-水(B)。梯度洗脱程序为：0-5min，10-17％A；5-10min，17-19％A；10-25min，19-26％A；25-26min，26-10％A；26-28min，10-10％A。柱温30℃，2707自动进样器进样填满定量环(100μL)。双通道波长为280nm和360nm。PDA检测器检测并手动收集各峰流出物。添加0.5％的乙酸水溶液至流动相中以减少峰拖尾并改善峰形，得到7个洗脱峰，如图2所示，然后减压旋转蒸发冻干，得到7个白扁豆花黄酮化合物。
1、通过1H NMR，13C NMR，和UV，UPLC-TOF-MS对7个白扁豆花黄酮化合物进行组分鉴定，具体的数据如下：
Rt11.732组分：
1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝6.20(s,1H),6.43(s,1H),8.05(d,J＝8.6Hz,2H),6.91(d,J＝8.8Hz,2H),6.91(d,J＝8.8Hz,2H),8.05(dd,J＝8.6Hz,2H),5.71(d,J＝7.0Hz,1H),4.61(d,J＝7.8Hz,1H)。
13CNMR(126MHz,DMSO)δ＝156.3(C-2),132.9(C-3),177.5(C-4),161.3(C-5),98.7(C-6),164.3(C-7),93.7(C-8),155.6(C-9),104.2(C-10),120.9(C-1'),131.0(C-2’),115.3(C-3'),160.0(C-4'),115.3(C-5'),131.0(C-6'),97.9(C-1”)82.5(C-2”),76.7(C-3”),69.7(C-4”),77.0(C-5”),60.8(C-6”),103.9(C-1”'),74.4(C-2”'),76.6(C-3”'),69.6(C-4”'),77.5(C-5”'),60.5(C-6”')。
Rt12.117组分：
1HNMR(500MHz,Methanol-d4)δ＝6.21(d,J＝2.1Hz,1H),6.40(d,J＝2.1Hz,1H),7.67(d,J＝2.1Hz,1H),6.91(d,J＝8.8Hz,2H),6.87(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),5.11(d,J＝7.7Hz,1H),4.52(d,J＝1.6Hz,1H),1.12(d,J＝6.2Hz,3H)。
13CNMR(126MHz,Methanol-d4)δ＝158.5(C-2),135(C-3),179.4(C-4),162.9(C-5),99.9(C-6),166.0(C-7),94.8(C-8),159.3(C-9),105.6(C-10),123.1(C-1'),117.7(C-2'),145.8(C-3'),149.8(C-4'),116.0(C-5'),123.5(C-6'),104.7(C-1”),75.7(C-2”),78.2(C-3”),71.4(C4”),77.2(C-5”),68.5(C-6”),102.4(C-1”'),72.1(C-2”'),72.2(C-3”'),73.9(C-4”'),69.7(C-5”')。
Rt13.345组分：
1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝6.06(s,1H),6.25(s,1H),δ6.79(d,J＝8.8Hz,1H),5.42(d,J＝7.4Hz,1H).
13CNMR(126MHz,DMSO)δ＝159.3(C-2),132.4(C-3),177.5(C-4),167.8(C-5),98.3(C-6),168.1(C-7),93.8(C-8),158.6(C-9),104.0(C-10),125.8(C-1'),117.1(C-2'),141.7(C-3'),144.2(C-4'),115.8(C-5'),125.3(C-6'),100.1(C-1”),72.0(C-2”),73.0(C-3”),68.4(C-4”),73.6(C-5”),65.4(C-6”)。
Rt13.991组分：
1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝6.20(d,J＝2.0Hz,1H),6.42(d,J＝2.1Hz,1H),8.05(d,J＝8.7Hz,2H),6.86(d,J＝8.8Hz,2H),6.86(d,J＝8.8Hz,2H),8.05(d,J＝8.7Hz,2H),5.32(d,J＝7.7Hz,1H),4.58(d,J＝4.3Hz,1H),1.06(d,J＝6.2Hz,2H)。
13CNMR(126MHz,DMSO)δ＝156.5(C-2),133.3(C-3),177.4(C-4),161.2(C-5),98.8(C6),164.5(C-7),93.8(C-8),156.6(C-9),103.8(C-10),120.9(C-1'),131.0(C-2'),115.1(C-3'),160.0(C-4'),115.1(C-5'),131.0(C-6'),102.1(C-1”),71.1(C-2”),73.5(C-3”),68.3(C-4”),73.0(C-5”),65.3(C-6”),100.1(C-1”'),70.4(C-2”'),70.6(C-3”'),71.9(C-4”'),68.0(C-5”'),17.9(C-6”')。
Rt15.361组分：
1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝7.98(d,J＝8.7Hz,1H),6.88(d,J＝8.8Hz,1H),6.40(s,1H),6.19(s,1H),5.37(s,0H),5.31(d,J＝7.5Hz,0H),5.10(dd,J＝11.6,5.4Hz,1H),4.37(s,1H),0.98(d,J＝6.2Hz,1H)。
13CNMR(126MHz,DMSO)δ＝156.59(C-2),133.3(C-3),177.38(C-4),161.24(C-5),98.90(C-6),164.61(C-7),93.87(C-8),156.86(C9),103.90(C-10),120.95(C-1'),130.94(C-2'),115.16(C-3'),159.97(C-4'),115.1(C-5'),133.25(C-6'),101.43(C-1”),74.23(C-2”),76.41(C-3”),69.97(C-4”),75.78(C-5”),66.95(C6”),100.83(C-1”'),70.4(C-2”'),70.65(C-3”'),71.87(C-4”'),68.31(C-5”'),17.9(C-6”')。
Rt16.187组分：
1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝6.17(s,1H),6.40(s,1H),7.85(d,J＝2.1Hz,1H),6.91(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),5.43(d,J＝7.2Hz,1H),4.41(d,J＝7.2Hz,1H)。
13CNMR(126MHz,DMSO)δ＝157.4(C-2),133.8(C-3),177.3(C4),162.0(C-5),99.8(C-6),164.4(C-7),94.7(C-8),157.2(C-9),104.6(C-10),121.9(C-1'),116.1(C-2'),150.3(C-3'),147.7(C-4'),56.3(OCH3),114.1(C-5'),123.1(C-6'),102.1(C-1”),75.1(C-2”),77.2(C-3”),71.4(C-4”),76.8(C-5”),66.5(C-6”),101.8(C-1”'),70.9(C-2”'),71.1(C-3”'),72.6(C-4”'),69.1(C-5”'),18.6(C-6”')。
Rt16.531组分：
1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝8.05(d,J＝8.7Hz,1H),6.89(d,J＝8.7Hz,1H),6.89(d,J＝8.7Hz,1H),8.05(d,J＝8.7Hz,1H),5.47(d,J＝7.5Hz,1H)。
13CNMR(126MHz,DMSO)δ＝156.3(C-2),133.2(C-3),177.5(C-4),161.3(C-5),98.7(C-6),98.7(C-7),93.7(C-8),156.4(C-9),104.0(C-10),120.9(C-1'),130.9(C-2'),115.1(C-3'),160.0(C-4'),115.1(C-5'),130.9(C-6'),100.9(C-1”),74.2(C-2”),77.5(C-3”),69.9(C-4”),76.4(C5”),60.9(C-6”)。
经比较鉴定，保留时间Rt为11.732min、12.117min、13.345min、13.991min、15.361min、16.187min和16.531min分别为化合物kaempferol 3-O-sophoroside(山奈酚-3-O-槐糖苷)，quercetin 3-rutinoside(槲皮素-3-芸香苷)，quercetin 3-glucoside(槲皮素-3-葡萄糖苷)，kaempferol-3-O-robinobioside(山奈酚-3-O-洋槐糖苷)，kaempferol-3-O-rutinoside(山奈酚-3-O-芸香糖苷)，isorhamnetin 3-O-neohesperidoside(异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷)和kaempferol-3-O-galactoside(山奈酚-3-O-半乳糖苷)。
数据处理:所有实验均重复三次，结果以均值±标准差(X±SD)来表示。采用GraphPad Prism 7软件计算IC50，效果试验1ABTS+·法测定白扁豆花中分离制备黄酮组分抗氧化活性
①ABTS+工作液的配制：将10mL、7mM ABTS试剂与176μL、140mM K2S2O8溶液在黑暗中反应16小时，立即用pH 7.0PBS缓冲液稀释ABTS+溶液至在734nm处的吸光度达到0.7±0.1；②对照样维生素C与白扁豆花黄酮组分的配制：准确称取VC、保留时间Rt为11.732min、12.117min、13.345min、13.991min、15.361min、16.187min和16.531min黄酮组分，用甲醇溶解并配制成浓度100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL、1500μg/mL、2500μg/mL样品溶液与对照样溶液；③分别取其190μL ABTS+工作液、10μL对照样维生素C、10μL白扁豆花黄酮组分各浓度溶液置入96孔微孔板，在25℃下，将混合溶液在黑暗中孵育6分钟，然后置于酶标仪中测定其在734nm的吸光度；④通过(1-Ai/A0)×100％计算ABTS+·清除能力。⑤以体系VC、黄酮组分浓度为横坐标，ABTS+·清除率为纵坐标作图，并求出IC50。
表1:白扁豆花中分离制备黄酮组分清除ABTS+·的活性
Figure BDA0003062374200000081
从表1可见，豆花中分离制备黄酮组分在相对较高的浓度(>100μg/mL)下表现出优异的清除ABTS+·能力，与VC相当。而在较低浓度(<20μg/mL)下，除RT13.345组分，多数黄酮组分清除ABTS+·能力则偏弱。IC50数值显示，RT13.345组分与VC最为接近。
效果试验2：DPPH·法测定白扁豆花中分离制备黄酮组分抗氧化活性
①确定最大吸收峰：在室温下，以甲醇做参比，紫外扫描一定浓度的DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)溶液，确定其最大吸收峰为517nm，并确定DPPH·溶液浓度与吸光度呈线性正相关关系。②对照样维生素C(VC)与白扁豆花黄酮组分的配制：准确称取DPPH、保留时间Rt为11.732min、12.117min、13.345min、13.991min、15.361min、16.187min和16.531min黄酮组分，用甲醇溶解并稀释为一系列梯度。③样品空白的吸光度：分别取100μL对照样VC与白扁豆花黄酮组分溶液，加入等体积甲醇，在黑暗放置30分钟于酶标仪在517nm处测量吸光度，记作样品的空白(B2)。④未加样的DPPH·吸光度：分别取100μL、0.2mM DPPH溶液添加到96孔微孔板中，加入等体积甲醇，在黑暗放置30分钟于酶标仪在517nm处测量吸光度，记作样品的空白(B0)。⑤样品与DPPH·反应后的吸光度：将100μL的0.2mM DPPH溶液添加到96孔微孔板中的100μL样品溶液中，在黑暗放置30分钟于酶标仪在517nm处测量吸光度，记作B1。⑥DPPH·清除率：通过[1–(B1-B2)/B0]×100％计算DPPH·清除能力。⑦以体系VC、黄酮组分浓度为横坐标，DPPH·清除率为纵坐标作图，并求出IC50。
表2:白扁豆花中分离制备黄酮组分清除DPPH·的活性
Figure BDA0003062374200000091
从表2可见，豆花中分离制备黄酮组分RT12.117、RT13.345在低浓度下(<50μg/mL)清除DPPH自由基达90％，IC50数值显示，组分RT12.117、RT13.345与VC接近。
效果试验3：白扁豆花中分离制备黄酮组分对α-葡萄糖苷酶体外抑制活性
96微孔板反应体系中依次加入40μL的α-glucosidase溶液(0.2U/mL)，然后加入不同黄酮类化合物(1mM)40μL，置于310.15K的恒温水浴锅中反应10min，再加入8mM pNPG(对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷)溶液40μL，放入310.15K的恒温水浴锅中继续反应30min，随后滴加120μL 0.2M的碳酸钠终止反应，405nm波长下测定OD值。从中筛选出抑制作用较好的黄酮类化合物，阿卡波糖做阳性对照组，抑制率＝[1-(OD样品-OD样品空白)/(OD对照-OD对照空白)]×100％，(OD样品：为加黄酮组分抑制剂反应后吸光度；OD样品空白：为不加黄酮组分抑制剂反应后的吸光度；OD对照：为只加黄酮组分抑制剂的吸光度，OD对照空白：为不加酶与黄酮组分抑制剂反应后的吸光度)并计算其IC50，每组重复3次。
从图3A-G可见7种扁豆花中分离得到的黄酮组分在不同浓度条件下对α-glucosidase活性的抑制作用。从表3中的IC50可知7种黄酮类化合物对α-glucosidase活性的抑制效果均优于对照Acarbose(阿卡波糖)，且抑制能力组分RT16.531>组分RT11.732>组分RT15.361>组分RT13.991>组分RT13.3451>组分RT16.187>组分RT12.117。
表3:白扁豆花中分离制备黄酮组分抑制α-glucosidase的IC50
Figure BDA0003062374200000101
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本说明书一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本说明书一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本说明书一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
粉碎：将白扁豆花进行烘干，然后用粉碎机粉粹，过筛，得白扁豆花粉；
提取及初富集：用乙醇对白扁豆花粉进行回流萃取，然后用石油醚洗涤萃取液并收集下层水相，然后对收集的水相进行旋转蒸发，并用正丁醇萃取富集黄酮类化合物，对提取的黄酮类化合物减压旋转蒸发至浸膏；
分离：将浸膏复溶于水中，用不同梯度的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，依次对洗脱液进行减压旋蒸发、冷冻干燥，得白扁豆花黄酮类化合物组分Fr.Ⅰ、Fr.Ⅱ、Fr.Ⅲ和Fr.Ⅳ；
纯化：取组分Fr.Ⅱ，用甲醇溶解，采用半制备高效液相色谱法进行提纯，得纯白扁豆花黄酮类化合物。
2.根据权利要求1所述的白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法，其特征在于，所述半制备高效液相色谱法包含如下工艺参数：
色谱柱：Sunfire C18柱，规格为：150mm×10mm I.D.，粒径为：5μm；流动相：乙腈(A)和0.5％的乙酸-水(B)，柱温30℃，双通道波长为280nm和360nm。
3.根据权利要求1所述的白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法，其特征在于，所述半制备高效液相色谱法包含如下操作步骤：
梯度洗脱：0～5min采用10～17％乙腈溶液进行洗脱，5～10min采用17～19％乙腈溶液进行洗脱，10～25min采用19～26％乙腈溶液进行洗脱，25～26min采用26～10％乙腈溶液进行洗脱，26～28min采用10～10％乙腈溶液进行洗涤；
添加0.5％的乙酸水溶液至流动相中，检测并收集各流出物洗脱峰，得到保留时间Rt为11.732min、12.117min、13.345min、13.991min、15.361min、16.187min和16.531min 7个洗脱峰，然后减压旋转蒸发冻干，得到7个纯化白扁豆花黄酮化合物。
4.根据权利要求1所述的白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法，其特征在于，所述提取及初富集中乙醇的浓度为70％，温度为35℃。
5.根据权利要求1所述的白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法，其特征在于，所述分离中梯度洗脱的材料为AB-8大孔树脂柱，乙醇水溶液的浓度依次为20％、30％、50％和70％。
6.根据权利要求5所述的白扁豆花黄酮类化合物分离制备方法，其特征在于，所述分离中乙醇水溶液的用量为10BV，流速为5mL/min。
7.一种白扁豆花黄酮类化合物，其特征在于，采用权利要求1～6任一所述的制备方法制备而成。
8.根据权利要求7所述的白扁豆花黄酮类化合物，其特征在于，所述白扁豆花黄酮类化合物具有清除ABTS+·、DPPH·DPPH·和对α-葡萄糖苷酶体外抑制活性的作用。
9.根据权利要求7所述的白扁豆花黄酮类化合物，其特征在于，所述白扁豆花黄酮类化合物应用在功能性食品中。
10.根据权利要求7所述的白扁豆花黄酮类化合物，其特征在于，所述白扁豆花黄酮类化合物具有抗氧化、降血糖作用。
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