CN110343045B - 芳基四氢萘型木脂素类化合物及制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品及医药技术领域，具体为一种芳基四氢化萘型木脂素(aryl‑tetralin‑type lignan)的制备方法及应用。该芳基四氢萘型木脂素化合物为[(+)‑2a,3a‑di‑O‑galloyl lyoniresinol]，其是由余甘子干燥成熟的果实中提取分离得到。经实验研究表明，该化合物对多种自由基具有良好的清除作用，同时亦发现有神经保护功能。因此，可开发成药用于与氧化应激引起的帕金森(PD)、阿尔兹海默症(AD)和亨廷顿病(HD)等多种神经退行性疾病的治疗。

Description

芳基四氢萘型木脂素类化合物及制备和应用

技术领域

本发明属于食品及医药技术领域，具体涉及一种从植物余甘子干燥成熟果实中分离得到的一个芳基四氢萘型木脂素类化合物：(+)-2a,3a-di-O-galloyl lyoniresinol的方法和应用。

背景技术

余甘子(Phyllanthusemblica)隶属于大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属(Phyllanthus)，也是该属中少有的乔木类型。主要分布在我国的四川、贵州、云南、广东、福建、台湾等地。余甘子作为一种常用藏药，同诃子、毛诃子在藏药中并称“三大果”而普遍使用；其主要成分为鞣质及相关多元酚类化合物，同时也含有萜类、黄酮类等其它成分。

近年来，国内外对余甘子果实认识的深度和广度得到快速发展，对其成分的研究由果实逐步发展到叶子和树皮。从中发现了具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒、调血脂等作用的活性成分。由于余甘子果实富含丰富的维生素C成分，加之药理活性高、毒副作用小，故被国家卫生部列入首批药食兼用名单。全面、深入、系统地研究传统药物余甘子，不仅有利于它的合理开发和运用，同时也能带动余甘子种植产业更好的发展，提升它的经济价值，造福于人。

发明人通过对余甘子果实的化学成分和活性进行研究，首次分离出并鉴定出全新的芳基四氢萘型木脂素。通过抗氧化活性筛选结果发现，该化合物具有良好的自由基清除和神经保护的功效，为后续深入的研究奠定基础。

发明内容

本发明提供了一种芳基四氢萘型木脂素类化合物(+)-2a,3a-di-O-galloyllyoniresinol的制备方法及其在神经保护作用药物方面中的应用。

本发明采用的具体方案是：一种芳基四氢萘型木脂素类化合物，其特征在于：分子式C₃₆H₃₆O₁₆，化合物结构式：

相应的，所述的芳基四氢萘型木脂素类化合物的制备方法，步骤包括：

用余甘子干燥成熟的果实，粉碎后醇水溶液室温浸泡提取，减压浓缩去醇后得总浸膏；

将浸膏用水溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，得到石油醚、乙酸乙酯和水层；

乙酸乙酯层通过反复硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱分离；

再经过制备型高效液相色谱仪纯化得该化合物纯品。

优选的，所述硅胶柱层析中，硅胶为100～200目，乙酸乙酯层浸膏与两倍重量的硅胶拌样混匀，十倍浸膏重量的硅胶装于玻璃柱，再利用二氯甲烷-甲醇-水进行梯度洗脱，梯度设置为二氯甲烷:甲醇:水的体积比为：9:1:0.1～6:4:1范围内设置12个浓度梯度；洗脱后TLC板检测合并相同成分，共计8个组分。

优选的，所述Sephadex LH-20柱分离是：选择洗脱后8个组分中的组分，过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20，然后甲醇水梯度洗脱，甲醇:水v/v梯度为：0％、30％、50％、70％、90％，经TLC检测合并相同成分。

优选的，所述的纯化是：柱分离后的产品采用制备型高效液相色谱仪纯化，流动相用乙腈:水为体积比为10:90～15:85梯度洗脱，得该化合物纯品。

优选的，所述纯化过程中的水中含0.01％三氟醋酸，所述的乙腈:水取5个梯度洗脱。

优选的，所述醇水溶液为乙醇水溶液，乙醇与水体积比为7:3，醇水溶液用量以足以淹没余甘子；浸泡提取4～5次，每次浸泡24小时。

优选的，溶液浸膏的用水量为3～4倍重量，所述石油醚、乙酸乙酯用量与浸膏溶液体积相等。

进一步的，前述任意一项的芳基四氢萘型木脂素类化合物在神经退行性疾病药物中的应用。

进一步的，前述任意一项的芳基四氢萘型木脂素类化合物在抗氧化药物中的应用。

本发明的芳基四氢萘型木脂素类化合物是首次从自然界分离得到，并通过一系列的化学技术和波谱学手段，鉴定和确认其分子结构；具有独创性。具体来说：化合物是由余甘子干燥成熟的果实中提取分离得到。经实验研究表明，该化合物对多种自由基具有良好的清除作用，同时亦发现有神经保护功能。因此，可开发成药用于与氧化应激引起的帕金森(PD)、阿尔兹海默症(AD)和亨廷顿病(HD)等多种神经退行性疾病的治疗。

附图说明

图1为本发明化合物的氢谱图；

图2为本发明化合物的碳谱图。

具体实施方式

本发明芳基四氢萘型木脂素化合物的制备及鉴定具体实施例如下：

化合物制备：

仪器设备：

分析型高效液相色谱仪，型号日本岛津LC-20AT(SPD-M20A)；

制备型高效液相色谱仪，型号北京创新通恒P3000(UV3000)；

分析柱，型号依利特C₁₈柱(250mm×4.60mm,5μm)；

制备柱，型号依利特C₁₈柱(250mm×30mm,10μm)；

30.0kg余甘子干燥成熟的果实，粉碎后用乙醇:水(7:3,v/v)室温浸泡提取5次，每次浸泡24小时，每次浸泡液用量为20L，基本浸没粉末物料；

减压浓缩去醇得总浸膏3.1kg，将浸膏溶解在10L水中，然后依次用浸膏溶液相等体积的石油醚、乙酸乙酯进行萃取，得到石油醚、乙酸乙酯和水层，共计3层；其中，乙酸乙酯1.29kg；

乙酸乙酯层通过硅胶柱层析(硅胶为100～200目)，利用二氯甲烷-甲醇-水(二氯甲烷:甲醇:水,9:1:0.1～6:4:1,v/v/v)梯度洗脱，共设置四个浓度梯度，梯度设置为(9:1:0.1,8:2:0.2,7:3:0.5,6:4:1)，每个梯度浓度溶剂30L，每3L溶剂减压蒸馏一次；经TLC板检测合并具有相同点的组分，最终得8个组份(标记为组份1～8)。

取TLC板检测成点性清晰的组份2总重300g，过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20，甲醇水溶液梯度洗脱(梯度设置为甲醇体积含量0％，30％，50％，70％，90％)，经TLC检测合并相同组分，共计得10个小组分(标记为组2-1～2-10)；

上述组分经TLC板检测FeCl₃溶液显色(显示蓝色)具有明显主点且杂质点较少的组分2-8采用制备型高效液相色谱仪制备纯化(乙腈:水(含0.01％三氟醋酸v/v),10:90～15:85v/v)流速为10mL/min梯度洗脱，梯度设置为乙腈：水(10:90～15:85,40min)得该化合物纯品16.9mg(t_R＝39.0min)，经分析型高效液相分析其纯度大于等于95％。

其它柱色谱等技术方法亦可，例如：以过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20的相同组分，再经过反相RP-C₁₈以甲醇水梯度条件洗脱，并TLC板检测合并相同主成分，最后再以制备型高效液相分离纯化得化合物1。

化合物鉴定：

仪器设备：

¹H和¹³C NMR(核磁共振谱)：BrukerAvanceⅢ-400

IR(红外)：Perkin-Elmer 1725X-FT

UV(紫外)：Perkin-ElmerLambda 35

HRESI-MS(高分辨质谱)：LTQOrbitrap XL mass spectrometers

HPLC(高效液相)：Shimadzu LC-20AT

(1)本发明化合物的结构鉴定

化合物1：棕色无定型粉末，5％硫酸乙醇溶液显土黄色，与FeCl₃溶液显蓝色。ESI-MS m/z 723[M–H]^-；HRESIMS m/z 747.1905[M+Na]⁺(计算值：C₃₆H₃₆O₁₆Na,747.1896)。结合¹³C NMR和DEPT谱推测其分子式为C₃₆H₃₆O₁₆，不饱和度为19。

同时¹³C NMR和DEPT谱中显示有四组3,4,5-三氧取代的苯环，其中有两组归属于没食子酰基，此外δ_C59.5，56.4和56.8(2C)为四个甲氧基碳信号，δ_C33.5(C-4)，65.2(C-2a)和67.6(C-3a)为三个亚甲基碳信号，有两个亚甲基与氧原子相连，以及三个季碳信号δ_C 45.9(C-2)，42.9(C-1)和37.5(C-3)。¹H-¹H COSY谱H-1/H-2，H-2/H-3，H-3/H-4，H-4/H-5相关；以及HMBC谱H-1/C-2a，H-1/C-8，H-4/C-3a，H-4/C-5远程相关表明本发明化合物为一个芳基四氢萘型木脂素类化合物。将所有碳信号数据与文献对比，证实了本发明化合物为一个lyoniresinol的没食子酰基酯类结构。亚甲基δ_H H-3a 4.43(2H,m)和δ_H H-2a4.28(1H,dd,J＝10.8,6.4Hz)，4.20(1H,dd,J＝10.8,5.2Hz)与lyoniresinol(δ_H 3.5–3.6)对比，化学位移向低场移动，表明没食子酰基分与C-3a和C-2a羟基相连，HMBC谱远程相关进一步证实。

NOESY谱中H-2/H-2′,6′和H-2/H-3a空间相关表明上述氢原子位于同侧，同时，³J_1,2＝6.4Hz较大的耦合常数，表明H-1与H-2位于异侧，由此本发明化合物的相对构型被确定。经与文献对比，本发明化合物的实验CD与(+)-lyoniresinol文献报道数据一致，因此其芳基取代C-1位的绝对构型确定为S型。综上所述，本发明化合物的绝对构型确定为(1S,2R,3R)-1，并命名为(+)-2a,3a-di-O-galloyl lyoniresinol。化学结构式如下：

(2)化合物的波谱学数据如下：

棕色无定型粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)223(4.53),278(4.27)nm；IR(KBr)ν_maxcm^-1:3393,2931,1684,1611,1495,1457；ESI-MS m/z 723[M–H]^-；HRESI-MS m/z 747.1905[M+Na]⁺(calcd.for C₃₆H₃₆O₁₆Na,747.1896)。¹H NMR(acetone-d₆,400MHz)δ_H7.18(2H,s,H-2″,6″),7.11(2H,s,H-2″′,6″′),6.66(1H,s,H-5),6.43(2H,s,H-2′,6′),4.43(2H,m,H-3a),4.35(1H,d,J＝6.4Hz,H-1),4.28(1H,dd,J＝10.8,6.4Hz,H-2aα),4.20(1H,dd,J＝10.8,5.2Hz,H-2aβ),3.84(3H,s,OMe-3),3.70(6H,s,OMe-3′,5′),3.33(3H,s,OMe-5),2.86(1H,m,H-4),2.41(1H,m,H-2),2.15(1H,m,H-3)，如图1。

如图2所示，核磁共振碳谱数据如下：¹³C NMR(acetone-d₆,100MHz)δ_C167.0(C-7″),166.9(C-7″′),148.5(C-3′,5′),148.1(C-6),147.0(C-8),146.2(C-3″,5″),146.2(C-3″′,5″′),138.9(C-4″),138.7(C-4′),138.7(C-7),138.2(C-1′),135.0(C-4′),128.6(C-4a),125.4(C-8a),121.8(C-1″,1″′),110.0(C-2″,6″),109.9(C-2″′,6″′),107.3(C-5),106.9(C-2′,6′),67.6(C-3a),65.2(C-2a),59.5(OMe-5),56.8(OMe-3′,5′),56.4(OMe-3),45.9(C-2),42.9(C-1),37.5(C-3),33.5(C-4)。

本发明化合物的抗氧化活性及神经保护作用研究

1.抗氧化作用实验方法：

1.1清除DPPH自由基的测定

向96孔透明板中分别加入100μL不同浓度(2，5，10，20，50μM)的化合物1样品，再加入100μL 0.2mmol/L的DPPH溶液。依照相同的操作方法，将不同浓度的样品液分别与甲醇混匀作为空白组，DPPH溶液与甲醇混匀作为对照组。避光室温静置30min后，在波长517nm处测其吸光值，重复3次实验，每次3组平行，取平均值。以抗坏血酸作为阳性对照。

DPPH清除率(％)＝(1-(A₁-A₂)/A₃)×100％

式中：A₁—DPPH溶液与待测液的吸光度之和；A₂—待测液与溶剂的吸光度之和；A₃—DPPH溶液与溶剂的吸光度之和。

1.2铁离子还原能力(FRAP)的测定

取0.2mL不同浓度(2，5，10，20，50μM)的化合物1样品，各加入0.5mL磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH 6.6)和0.5mL 1％铁氰化钾溶液，于50℃水浴20min，加入0.5mL 10％的三氯乙酸溶液，混合后离心3min(2000rpm)，取上清液0.5mL，加入0.5mL蒸馏水和0.1mL三氯化铁溶液(0.1％)，混匀后静置10min。在波长700nm处测定吸光度，重复3次实验，每次3组平行，取平均值。以抗坏血酸作为阳性对照。

1.3清除ABTS⁺自由基的测定

将ATBS⁺用磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH 7.2)溶解配置成7mmol/L溶液，与2.45mmol/L过硫酸钾等体积混匀，室温避光反应12-16h，制备成ABTS⁺储备液。取20μL不同浓度(2，5，10，20，50μM)的化合物1样品加到96孔透明酶标板中，分别加入150μL ABTS⁺储备液，室温反应10min后，在波长517nm处测其吸光值，重复3次实验，每次3组平行，取平均值。以二叔丁基对甲酚作为阳性对照。

ABTS⁺清除率(％)＝(A₀-A)/A₀×100％

式中：A₀—ABTS⁺工作液与PBS的吸光度之和；A—ABTS⁺工作液与样品液的吸光度之和。

1.4氧自由基吸收能力(ORAC)的测定

分别吸取20μL不同浓度(2，5，10，20，50μM)的化合物1样品于96孔酶标板中，加入180mL FL于37℃条件下孵育20min后，随后加入20μL ABAP溶液(119mmol/L)启动反应，以激发波长485nm、发射波长535nm测定荧光强度，测定时间间隔为5min，连续测定35次。ORAC值以Trolox当量表达，单位为mmol TE/g DW。以槲皮素作为阳性对照。

结果如下：

表1本发明化合物的抗氧化能力实验结果和阳性对照

^a各值用均数表示(n＝3)。

IC₅₀ ^b:清除50％DPPH自由基时的浓度(mM)。

^c以抗氧化剂(Trolox)为当量浓度表示抗氧化的能力大小。

与对照组相比较，可见本发明的化合物对ORAC清除作用较微弱外，对另外三种自由基具有(DPPH、ABTS⁺、FRAP)良好的清除活性，证明本发明化合物具有一定的抗氧化活性，可用于食品等行业当作天然的抗氧化剂。

2.神经保护作用实验方法：

2.1细胞培养

神经细胞PC12培养于含浓度为5％马血清、10％胎牛血清、1％盘林西林(100U/mL)及链霉素(100μg/mL)的DMEM培养液中，置于细胞培养箱中培养，设置培养条件为5％CO₂、37℃。当细胞密度达到70-90％时进行传代，待细胞状态稳定后，进行细胞试验。

2.2 6-OHDA诱导PC12细胞的神经损伤的保护作用

将PC12细胞以每孔3×10⁵个/mL接种于96孔板中，待培养过夜后，加入100μM化合物1作用30分钟后，再加入分子质量为250.00mol/L,终浓度为250.09μM的6-OHDA(现配现用)，待培养24小时后移去培养基，加入终浓度为0.5mg/ml的MTT溶液100μL，培养4个小时后，加入MTT Stopping Buffer 100μL培养16-20小时，用酶标仪在波长550nm处测其吸光度。

结果如下：

表2本发明化合物的神经保护作用实验结果

化合物	细胞成活率(％)<sup>a</sup>
		本发明化合物1<sup>b</sup>	74.25±3.60
6-OHDA<sup>c</sup>	54.18±3.05
		正常细胞<sup>d</sup>	100.00±4.34

^a各值用均数表示(n＝3)。^b添加化合物1和6-羟基多巴胺试验组的存活率。^c只添加和6-羟基多巴胺试验组的存活率。^d未添加任何药物下正常细胞的存活率。

上述实验结果表明，本发明化合物对多种自由基清除活性(DPPH、FRAP、ABTS⁺)均优于对照组，说明本发明化合物具有良好的抗氧化作用。其神经保护作用的结果也明显强于对照组，由于人体的氧化应激作用造成细胞损伤，进而诱导帕金森(PD)、阿尔兹海默症(AD)等神经退行性疾病的发生。因此，本发明化合物不仅可作为天然的食品抗氧化剂，同时亦可用于神经保护作用药物的开发。

Claims (7)

1.一种芳基四氢萘型木脂素类化合物在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用，其特征在于：所述芳基四氢萘型木脂素类化合物的分子式为C₃₆H₃₆O₁₆，化合物结构式为：

。

2.根据权利要求1所述的芳基四氢萘型木脂素类化合物的制备方法，步骤包括：

用余甘子干燥成熟的果实，粉碎后醇水溶液室温浸泡提取，减压浓缩去醇后得总浸膏；

将浸膏用水溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，得到石油醚、乙酸乙酯和水层；

乙酸乙酯层通过反复硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱分离；

所述硅胶柱层析利用二氯甲烷-甲醇−水梯度洗脱，所述二氯甲烷、甲醇和水的体积比为9:1:0.1～6:4:1；共设置四个浓度梯度，梯度设置分别为9:1:0.1, 8:2:0.2, 7:3:0.5,6:4:1，经TLC板检测合并后最终得8个组份；

所述Sephadex LH-20柱利用甲醇水溶液梯度洗脱，梯度设置为甲醇体积含量0%，30%，50%，70%，90%；

再经过制备型高效液相色谱仪纯化得该化合物纯品；

所述纯化利用乙腈和水梯度洗脱，所述水中含有体积比为0.01%三氟醋酸，所述乙腈和水的体积比为10:90 ～15:85。

3.根据权利要求2所述的芳基四氢萘型木脂素类化合物的制备方法，其特征在于：所述硅胶柱层析中，硅胶为100～200目，乙酸乙酯层浸膏与两倍重量的硅胶拌样混匀，十倍浸膏重量的硅胶装于玻璃柱，再利用二氯甲烷-甲醇−水进行梯度洗脱。

4. 根据权利要求3所述的芳基四氢萘型木脂素类化合物的制备方法，其特征在于：所述Sephadex LH-20柱分离是：选择洗脱后8个组分中的组分，过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20，然后甲醇水梯度洗脱，甲醇:水v/v梯度为：0%、30%、50%、70%、90%，经TLC检测合并相同成分。

5.根据权利要求4所述的芳基四氢萘型木脂素类化合物的制备方法，其特征在于：所述纯化过程中的水中含0.01%三氟醋酸，所述的乙腈:水取5个梯度洗脱。

6.根据权利要求2所述的芳基四氢萘型木脂素类化合物的制备方法，其特征在于：所述醇水溶液为乙醇水溶液，乙醇与水体积比为7:3，醇水溶液用量以足以淹没余甘子；浸泡提取4～5次，每次浸泡24小时。

7.根据权利要求2所述的芳基四氢萘型木脂素类化合物的制备方法，其特征在于：溶液浸膏的用水量为3～4倍重量，所述石油醚、乙酸乙酯用量与浸膏溶液体积相等。

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