CN114933617A - 二苯甲酮二聚体化合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了从白木香叶中提取分离一类二苯甲酮二聚体化合物的方法。该类化合物具有降脂、美白等活性，为白木香叶的利用提供了可能。

Description

二苯甲酮二聚体化合物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种二苯甲酮二聚体化合物的制备方法。

背景技术

白木香(Aigilaria Sinensis)为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria)乔木，主要分布于我国广东、广西、福建和台湾等地，在亚洲被广泛用作香水、香料和传统药物。白木香带树脂的心材是《中国药典》2020年版中名贵中药材沉香的唯一来源。沉香始记于《名医别录》，性味辛，微温，具有行气止痛、温中止呕以及纳气平喘等功效，目前临床常用于胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆，肾虚气逆喘急等症。在自然条件下，沉香的形成尤为困难，形成周期长以及商业炒作等原因使其成为“木中黄金”，造成大量的野生资源被毁灭性砍伐，因此白木香被列入世界濒危红色植物保护名录。

而白木香叶为可再生资源在白木香列入濒危植物之前未得到充分利用，目前已被批准作沉香茶和保健品原料使用，在药食两个方面均具有广泛的应用前景。一般来说，白木香叶主要通过热水冲泡的方式使用。但目前为止，缺乏对白木香叶大极性提取物的化学成分以及生物活性相关的研究。

发明内容

为了阐明白木香叶的物质基础，扩大药用植物利用率，本发明对白木香叶中的相关成分进行了研究，同时分离纯化了两个新化合物，并发现了这些化合物具备一定的生理活性。

具体的，本发明提供了如式1或2所示化合物的制备方法，它包括如下内容：

(1)白木香叶水提物；

(2)水提物上大孔吸附树脂，依次用水、20:80甲醇-水洗脱，收集20:80甲醇-水洗脱部位；

(3)20:80甲醇-水洗脱部位经凝胶柱层析，用30±5％v/v甲醇洗脱，洗脱部位用半制备高效液相色谱进行纯化，C18作为固定相，流动相为乙腈-水＝10∶90，先出峰的化合物为化合物2，后出峰的化合物为化合物1

其中，水提物可以采用浸渍、超声、回流等常规方式进行提取。

若采用加热提取，加热温度可以选自85±10℃。

其中，所述大孔吸附树脂选自弱极性大孔吸附树脂。例如，所述大孔吸附树脂选自D101或类似的树脂。

当流动相洗脱流速为30mL/min，保留时间约在15.2±0.2min为化合物1，保留时间约在12.8±0.2min为化合物2。

所述凝胶可以选自Sephadex LH-20或类似的凝胶柱。

本发明中，在进行洗脱前，可以对样品进行适当的浓缩，使得上样液浓度适宜，便于吸附。

本发明中，洗脱后，收集的洗脱液可以进一步采用浓缩、干燥等常规工艺除去溶剂。

本发明有益效果：

本发明在白木香叶中发现了新的化合物，并且该类化合物还具有良好的降脂、抑制酪氨酸酶活性，以白木香叶为研究对象有利于对濒危植物的保护以及为合理开发利用白木香叶提供一定的理论依据。

附图说明

图1化合物1和2可能结构与HMBC信号。注：Ⅰ：化合物1和2的HMBC信号；Ⅱ和Ⅲ为化合物1和2的两种聚合方式。

图2化合物1和2结构图。

图3化合物1和2的降脂活性结果。注：A、D为空白组油红O和苏丹黑B染色结果。B和C是线虫经化合物1和2处理的油红O染色结果。E和F是线虫经化合物1和2处理的苏丹黑B染色结果。

图4化合物1和2酪氨酸酶抑制活性。

具体实施方式

实施例1

采用纯水对白木香叶进行提取制备得到总浸膏，经大孔树脂除糖后，采用正、反相硅胶等色谱方法分离白木香叶水溶性化学成分，结合一维与二维核磁共振谱图(¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC)、质谱(MS)、紫外吸收光谱(UV)等以及文献资料鉴定化合物的立体结构。具体如下。

提取分离：

将干燥的药材粉末(5kg)分别用85℃纯水浸提3次(每次0.5小时)。将提取的水混合后减压浓缩获得总浸膏。总浸膏过大孔树脂D-101柱以甲醇/水(0∶100，20∶80，40∶60，60∶40，80∶20，v/v)进行梯度洗脱，取甲醇/水(20：80)洗脱液，得到组分M1-2。

M1-2先经Sephadex LH-20柱层析，用30％v/v甲醇洗脱，收集洗脱部位，然后用半制备高效液相色谱(乙腈-水，10∶90，30mL/min)进行纯化，分离得到化合物1(96.2mg，t_R＝15.2min)和化合物2(36.5mg，t_R＝12.8min)。

新化合物结构鉴定：

化合物1为黄色无定形粉末。在紫外吸收光谱中，分别在370、315和260nm处有吸收峰，表明存在一个大的共轭体系。1的¹H NMR谱图非常简单，只有9个质子信号(表1)，可以容易地指定为在δ_H 13.81(1H,s)处形成分子内氢键的羟基，两个芳香质子δ_H 6.87(1H,s)，6.33(1H,s)，葡萄糖的一个端基质子信号δ_H 4.51(1H,d,J＝9.7Hz)，以及在δ_H 3.0和4.0之间的五个含氧次甲基信号。相反，化合物1的¹³C NMR核磁共振波谱显示19个碳的型号，这可以看出一个高度共轭的羰基(δ_C 180.7)，两个苯环(δ_C 163.7,162.3,156.0,153.3,152.8,140.8,123.2,114.4,107.5,101.9,101.3,93.6)和一个葡萄糖(δ_C 81.9,79.2,73.7,70.9,70.9,70.9,61.8)信号，表明化合物1是被高度取代的，结构上与芒果苷相似。因此，根据已有的研究报告，推测化合物1可能为xanthone或二苯甲酮单糖苷。然而，当用HRESIMS光谱仪测量1的分子量时，在m/z 400～500范围内没有出现准分子离子峰，而在m/z 845.17200[M+H]⁺处有一个准分子离子峰。用FAB质谱仪进一步测定了化合物1的相对分子质量，测得其相对分子质量为844，在m/z 400～500之间没有明显的离子碎片，表明化合物1为稳定的二聚体。根据上述证据，从m/z 845.17200[M+H]⁺处的离子峰确定1的分子式为C₃₈H₃₆O₂₂，以及具有21个不饱和度。在HSQC谱中，δ_H 6.34处的质子信号与δ_C 93处的碳信号直接相关。δ_H 6.87的氢信号与δ_C 101.3的碳直接相关。在HMBC谱中，H-5与C-1、C-3、C-4和C-6的相关性使我们能够构建A环的亚结构，类似地，H-5'与C-1'、C-3'、C-4'和C-6'相关有助于构建Ⅰ中B环的亚结构(图1)。此外，H-1”与C-2'、C-3'和C-4'相关，C-2'上形成分子内氢键的羟基质子与C-1'、C-3'、C-4'和C-2'相关，决定了葡萄糖在C-3'上的位置。H-5和H-5'都与C-7表现出弱的四键HMBC关联，支持C-7连接A环和B环。因此，形成了化合物1的部分结构如图I。考虑到分子量、分子式和不饱和度，化合物1一定是结构I的二聚化产物，即结构II和结构III(图1)。鉴于H-3与C-6”'没有HMBC相关性，因此确定结构I应该二聚为结构II。

化合物1是一个十元环二聚体，含有两个联苯和两个二苯甲酮基团，可能存在旋转抑制和轴向手性。因此，测定了1的CD光谱，以确定其立体化学结构。在CD光谱中，化合物1在235～255nm有正的cotton效应，在195～215nm有相反的cotton效应。一般来说，250nm处的ECD cotton效应揭示了联苯的显著吸收，对应于联苯的A吸收带，此时在ECD谱中，正的cotton效应对应于M扭转，负的cotton效应与P扭转相关。因此，化合物1在235～255nm和195～215nm区域的特征性的cotton效应表明，两个联苯的构型为M扭转。以类似的方式，260和320nm的负的cotton效应，通过与文献中的构型比较，两个二苯甲酮的构型为P扭转。最后，化合物1的结构如图2所示。

Aquidibenzophenonside B(2)为黄色无定形粉末。在高分辨质谱中，m/z845.17082[M+H]⁺的准分子离子峰表明化合物2的分子量与化合物1相同。化合物2的UV、¹H和¹³C核磁共振波谱数据与化合物1基本相同。因此，化合物2的分子式也被确定为C₃₈H₃₆O₂₂，具有21个不饱和度。为了确定化合物1和2之间的结构关系，比较了化合物1和2的HPLC、NMR、旋光性和圆二色谱特征。在HPLC分析中，以乙腈-水(10∶90，v/v)为流动相，化合物1和2的保留时间分别为8min和6min。化合物1和2以1∶1的质量比混合在一起以氘代甲醇为溶剂做核磁共振氢谱，结果表明大部分的核磁共振信号几乎重叠，仍然可以区分为不同的化合物。在HSQC和HMBC光谱中，化合物2具有完全相同的相关关系，因此表明化合物2和1具有相同的平面结构。化合物2的旋光度和CD的cotton效应与化合物1完全相反，表明化合物2是化合物1的异构体。根据CD谱，两个联苯的构型被指定为P扭转，两个二苯甲酮的构型被指定为M扭转。最后，确定了化合物2，如图2所示。

Aquidibenzophenonside A(1):黄色无定形粉末；

UV(MeOH):λmax(logε)370(5.09),315(5.39),260(8.37)；CD(MeOH)λmax(Δε)220(+5.03),252(+8.60),264(-8.47),319(-10.51),362(+2.57)；HRESIMS m/z 845.17200[M+H]⁺(calcd for C₃₈H₃₆O₂₂,844.16982)。化合物1一半结构的¹H NMR和¹³C NMR数据见表1.

Aquidibenzophenonside B(2):黄色无定形粉末；

UV(MeOH):λmax(logε)370(5.11),315(5.38),260(8.40)；CD(MeOH)λmax(Δε)220(-7.87),251(-12.71),264(+15.79),319(+16.37),364(-4.83)；HRESIMS m/z 845.17082[M+H]⁺(calcd for C₃₈H₃₆O₂₂,844.16982).化合物2一半结构的¹H NMR和¹³C NMR数据见表1.

表1化合物1(DMSO-d₆)和2(CD₃OD)一半结构的氢谱与碳谱数

实施例2秀丽隐杆线虫降脂活性

首先以本发明化合物1、2处理秀丽隐杆线虫，采用油红O与苏丹黑B对线虫进行染色观察，通过体内脂肪堆积情况来评价单体化合物降脂活性强弱。

将100μL的样品溶液(终浓度为100μg/mL)和100μL的活化的OP50涂于NGM培养基上，置于30℃的培养箱中培养18h，将同期化培养至L1期线虫接种于含药或不含药的NGM培养基上恒温培养(20℃)72h，对线虫进行油红O和苏丹黑B染色。最后将染色的线虫用磷酸缓冲液冲洗后挑至载玻片上，置于显微镜下拍摄照片观察体内的脂肪颗粒。奥利司他与DMSO分别为阳性与空白对照。

肥胖是由外界环境因素或人体因素引起的常见病，可诱发代谢综合征、冠心病、高血压等多种慢性病。线虫的消化道由咽部和肠道组成，是脂肪沉积的主要部位。线虫身体透明，在显微镜下可以清楚地观察到从头到尾的整个肠道状况。因此，它是研究降脂作用及其分子机制的重要模型。

本研究采用油红O和苏丹黑B染色方法，观察化合物1和2对线虫脂肪积累的影响。油红O染色统计结果显示，阳性组和空白组脂肪百分比分别为21.57％和42.05％。化合物1和2处理的线虫含脂率分别为26.37％、26.80％(图3B、3C所示)，与空白组比较差异显著(P<0.05)。苏丹黑B染色阳性组和空白组脂肪百分比分别为14.46％和26.70％，化合物1和2的脂肪百分比分别为18.69％、18.97(图3E、3F)，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，本发明2个二苯甲酮类新化合物具有显著的降脂活性。

实施例3酪氨酸酶抑制活性

以左旋多巴为底物，用酶标仪检测酪氨酸酶活性的抑制。化合物1、2首先溶解在DMSO中，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH＝6.8)稀释到一系列浓度。同时将左旋多巴和酪氨酸酶溶解在PBS中。左旋多巴和酪氨酸酶的浓度分别为0.5mM和0.06mg/mL。将化合物(50μL)、酪氨酸酶(50μL)和PBS(50μL)混合在96孔板中，在30℃下反应10min，然后将左旋多巴加入到混合物中，并在30℃下反应5min。然后，在475nm处检测各溶液的吸光度。总溶液体系为250μL，以DMSO为空白对照。酪氨酸酶抑制率计算如下：抑制率(％)＝1-[(A₂-A₁)/(B₂-B₁)]×100％

A₁是空白在0分钟的吸光度，A₂是100空白在10分钟的吸光度；B₁是样品在0分钟的吸光度，B₂是101空白在10分钟的吸光度。

结果：

本研究考察了化合物对酪氨酸酶的抑制活性，结果表明，化合物1和2对酪氨酸酶有抑制活性。化合物1的IC₅₀值为111.6±2.01μg/mL，化合物2的IC₅₀值为94.06±1.56μg/mL(参见图4)。

Claims (7)

1.如式1或2所示化合物的制备方法，它包括如下内容：

(1)白木香叶水提物；

(2)水提物上大孔吸附树脂，依次用水、20:80甲醇-水洗脱，收集20:80甲醇-水洗脱部位；

(3)20:80甲醇-水洗脱部位经凝胶柱层析，用30±5％v/v甲醇洗脱，洗脱部位用半制备高效液相色谱进行纯化，C18作为固定相，流动相为乙腈-水＝10∶90，先出峰的化合物为化合物2，后出峰的化合物为化合物1

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：水提物是以水加热浸提得到。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：加热温度为85±10℃。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂选自弱极性大孔吸附树脂。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂选自D101。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：流动相洗脱流速为30mL/min，保留时间15.2±0.2min为化合物1，保留时间12.8±0.2min为化合物2。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述凝胶选自Sephadex LH-20。

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