CN107459477B

CN107459477B - 一种马齿苋中异吲哚生物碱类化合物及其提取分离方法

Info

Publication number: CN107459477B
Application number: CN201710724567.7A
Authority: CN
Inventors: 英锡相; 迪迪尔·史蒂恩; 张文洁; 蒋明月
Original assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2017-08-22
Filing date: 2017-08-22
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2037-08-22
Also published as: CN107459477A

Abstract

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋中提取、分离和鉴别出的异吲哚类生物碱化合物及其提取分离方法。所述的新生物碱化合物，分子式为C₂₈H₂₃NO₈，命名为Oleraisoindole。还提供上述异吲哚类生物碱化合物的提取分离方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、ODS中压柱及Sephadex LH‑20纯化、液相分离制备。其结构采用UV、IR、HR‑ESI‑TOF‑MS、¹H‑NMR、¹³C‑NMR及二维核磁波谱解析的方法确定为一种异吲哚类生物碱化合物。该化合物具有潜在的抗炎和抗肿瘤等活性，并提供制备方法，为开发新药和开发新成分提供先导物和理论依据。

Description

一种马齿苋中异吲哚生物碱类化合物及其提取分离方法

技术领域

本发明属于中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的一种异吲哚生物碱类化合物及其提取分离方法。

背景技术

马齿苋(Portulaca oleracea L.)，又名长命菜、马苋菜，为马齿苋科植物。马齿苋性喜肥沃土壤，耐旱亦耐涝，生命力强，分布广泛，资源丰富，而以我国东北部的更为常见。马齿苋既可入药，又可食用，是我国卫生部划定的药食同源的野生植物之一。2015版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。

现代药理学研究表明，马齿苋具有降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、松弛或兴奋平滑肌及增强免疫力等功效。研究表明马齿苋中所含多种化学成分与其多样的药理作用息息相关，其主要化学成分包括：黄酮类、生物碱类、萜类、香豆素类、有机酸类、挥发油、多糖、氨基酸、各种色素类和矿物质类等。其中生物碱是马齿苋中的一大类活性成分,而酰胺类生物碱又占绝大多数。目前已报道的生物碱类成分有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和酰胺类生物碱：马齿苋酰胺A-I、K、L、N-S。

目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，进一步对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种从马齿苋中提取的异吲哚生物碱类化合物，经研究发现本发明的异吲哚类生物碱具有抗炎、抗肿瘤的作用，同时提供一种针对本发明异吲哚生物碱类化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。

为实现本发明的上述目的，本发明提供一种异吲哚生物碱类化合物，分子式分别为C₂₈H₂₃NO₈，命名为Oleraisoindole，化学结构式为：

为实现本发明的上述目的，本发明还提供一种马齿苋中异吲哚生物碱类化合物的提取分离方法，具体步骤为：

步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取，水提液过滤，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得浓缩液备用；

步骤2、将步骤1中浓缩液用乙酸乙酯反复萃取，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物；

步骤3、将步骤2中乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析分离，依次用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；

步骤4、将步骤3中所得物再经预处理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位减压浓缩至干，得浓缩物备用；

步骤5、将步骤4中所得浓缩物经预处理的Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)，以甲醇-水等度洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位减压浓缩至干，得浓缩物备用。

步骤6、对步骤5中所得浓缩物进行HPLC(高效液相)分离制备，以乙腈-水作为流动相，制备得到本发明异吲哚生物碱类化合物。

所述ODS和Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

本发明的有益效果。

本发明中所述马齿苋一种异吲哚生物碱类化合物的分离和药理活性研究未被现有论文期刊所报道；本发明提供来源于马齿苋的一种异吲哚生物碱类化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、ODS中压柱、Sephadex LH-20及HPLC进行分离纯化与制备，成功提取分离出一种新的生物碱化合物，该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用水提取及乙酸乙酯萃取，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高均大于90％，此外经研究表明本发明的化合物具有抗炎和抗肿瘤作用，因此本发明一种异吲哚生物碱类化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎和抗肿瘤的药物。

附图说明

图1为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的紫外光谱图。

图2为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的红外光谱图。

图3为本发明异吲哚生物碱类高分辨质谱图，其中(a)为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的高分辨质谱图(HR-ESI(+)-TOF-MS)；图3(b)为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的高分辨质谱图(HR-ESI(-)-TOF-MS)。

图4为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的¹H-NMR光谱图(MeOD)。

图5为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的¹³C-NMR光谱图(MeOD)。

图6为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的核磁共振碳谱(DEPT)光谱图(MeOD)。

图7为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的核磁共振¹H-¹HCOSY光谱图(MeOD)。

图8为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的核磁共振HMBC光谱图(MeOD)。

图9为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的核磁共振HSQC光谱图(MeOD)。

图10为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的核磁共振NOESY光谱图(MeOD)。

图11为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的¹H-NMR光谱图(DMSO)。

图12为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的¹³C-NMR光谱图(DMSO)。

图13为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的核磁共振碳谱(DEPT)光谱图(DMSO)。

图14为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的核磁共振¹H-¹HCOSY光谱图(DMSO)。

图15为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的核磁共振HMBC光谱图(DMSO)。

图16为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的核磁共振HSQC光谱图(DMSO)。

图17为本发明异吲哚生物碱类Oleraisoindole的核磁共振NOESY光谱图(DMSO)。

具体实施方式

实施例1。

本发明提供一种异吲哚生物碱类化合物，分子式为C₂₈H₂₃NO₈，化学结构式为：

所述异吲哚生物碱类化合物根据结构命名为Oleraisoindole，表1为该异吲哚生物碱类化合物的核磁数据：化合物分别在MeOD和DMSO两种不同溶剂中的¹H-NMR谱与¹³C-NMR谱数据。

表1：C₂₈H₂₃NO₈分别在MeOD和DMSO两种不同溶剂中的核磁数据。

请参阅图1-17，本发明一种异吲哚生物碱类化合物Oleraisoindole的结构鉴定与推导。

Oleraisoindole：黄色粉末，易溶于甲醇，不溶、微溶于水。点样于硅胶薄层板后，喷稀碘化铋钾试液斑点显橘红色，提示该化合物为生物碱成分，UV(MeOH)λ_max:284nm，IRν_OH3425ν_C＝O 1700，ν_C-O 1390。HR-ESI(-)-TOF-MS给出m/z:500.1374[M-H]⁺的准分子离子峰，HR-ESI(+)-TOF-MS给出m/z:484.1397[M-H₂O+H]⁺的准分子离子峰，则分子量为501.1430。结合该化合物分别在MeOD和DMSO两种不同溶剂中的核磁谱，根据¹H-NMR，¹³C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C₂₈H₂₃NO₈，不饱和度为18。从¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱中可以看到一些双重信号的色谱峰，推测可能是该化合物混合了两个非常相似的分子，我们假设这是由于出现了两个相对稳定的构象异构体(如：旋转异构)，且把每个双重信号的峰看做一个信号来推测结构。

在以MeOD为溶剂的核磁谱中，¹³C-NMR谱和DEPT谱显示27个碳信号，分别为2个CH₃(δ：56.55；56.63)、1个CH₂(δ：46.1/46.2)、13个季碳(2个羰基碳，δ：170.15；169.1/169.3；5个连O的碳，δ：147.8；148.8；151.2；152.7；158.2；6个双键碳，δ：123.29；127.9；132.7；133.7；134.0；139.6)、11个CH(71.8/72.0；112.1；110.0；123.30；115.1；115.94/116.00；123.95/124.05；128.56；128.60；116.07；116.12)。在以DMSO为溶剂的核磁谱中，¹³C-NMR谱和DEPT谱显示28个碳信号，分别为2个CH₃(δ：56.55；55.68/55.75)、1个CH₂(δ：45.3/45.4)、14个季碳(2个羰基碳，δ：167.5；166.9/167.1；5个连O的碳，δ：146.5；147.07/147.09；149.8；150.9；156.6；7个双键碳，δ：121.68/121.74；125.57/125.64；125.23/125.20；130.6；131.4；133.0；137.1)、11个CH(69.10/69.12；110.4；109.5；121.6；114.2/114.3；115.06/115.09；122.6；127.0，重叠；114.81；114.84)。其中多了一个季碳δ125.23/125.20，从相关谱中可以看出有相关，故存在。

在以MeOD为溶剂的¹H-NMR谱中，显示2个甲基信号，分别为δ3.84/3.86(3H，s)，δ4.04(3H，s)；1个次甲基信号分别为a:δ3.68(1H，dd，J＝13.7；8.7)/δ3.90(1H，dd，J＝13.7；9.3),b:δ4.93(1H，m)；11个次甲基信号分别为δ7.15(1H，s)，δ7.53(1H，s)，δ8.17(1H，s)，δ6.84/6.93(1H，d，J＝1.9)，δ6.95(1H，d，J＝8.0),δ6.75/6.78(1H，dd，J＝8.0；1.9)，δ4.93(1H，brdd，J＝8.3；5.6)，δ7.19(1H，brd，J＝8.2)，δ7.21(1H，brd，J＝8.2),δ6.71(1H，brd，J＝8.2)，δ6.73(1H，brd，J＝8.2)。根据¹H-¹H COSY谱可知，次甲基中的Hδ7.19、δ7.12分别和δ6.71、δ6.73相耦合，Hδ6.95和δ6.75/6.78相耦合；次甲基中的Hδ4.93和δ3.68/3.69、δ3.88相互耦合；三个次甲基δ7.15、δ7.53和δ8.17相互耦合；δ7.53和δ4.04相互耦合；而Hδ7.53、δ7.15和δ8.17相对于其他次甲基化学位移较大，可能与双键相连。在以DMSO为溶剂的¹H-NMR谱中，显示存在4个活泼氢：1个醇羟基δ5.35，3个酚羟基δ9.18、δ9.25、δ9.27；2个甲基信号，分别为δ3.74/3.76(3H，s)，δ3.95(3H，s)；1个次甲基信号分别为a:δ3.48/3.49(1H，dd，J＝13.5；5.0)，b：δ3.69(1H，brdd，J＝13.5；8.5)11个次甲基信号分别为δ7.15(1H，s)，δ7.69(1H，s)，δ8.22(1H，s)，δ6.83/6.90(1H，d，J＝2.0)，δ6.91(1H，d，J＝8.0),δ6.72/6.75(1H，dd，J＝8.0；12.0)，δ4.78(1H，m)，δ7.11(1H，brd，J＝8.5)，δ7.12(1H，brd，J＝8.5),δ6.68(1H，brd，J＝8.5)，δ6.69(1H，brd，J＝8.5)。¹H-¹H COSY谱与上述在MeOD作为溶剂的¹H-¹HCOSY核磁谱相同，只是多了一个δ4.78与δ5.53相互耦合，说明醇羟基与C-1”相连。

从核磁数据中可以看出，该化合物存在两个苯环。第一个苯环：氢谱中δ6.84/6.93、δ6.75/6.78和δ6.95的三个氢是1,3,4位三取代的苯环中的一部分；HMBC谱显示H-2'与C-4，H-6'与C-4相耦合，说明与C-4(δ139.6)相关联。HMBC中H-5'与C-3'相耦合，且NOE中甲基与H-2'相耦合，说明甲氧基与苯环上的C-3'相连；另外，苯环上还存在一个与C-4'相连的羟基。第二个苯环：是一个典型的对位取代苯环，一个羟基与C-4”'(δ158.2)相连；HMBC谱中H-2”'、H-6”'与C-2”相耦合，说明C-2”与C-1”'相连。根据¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱中C-1”(δ_H3.67/3.70、δ_H3.88，δ_C46.1/46.2)的化学位移，可以推算出这是一个典型的CH₂与N相连的结构，同时C-2”(δ_H4.93，δ_C71.8/72.0)连接一个羟基。另外，在HMBC谱中，H-1”分别与羰基C-1(δ170.2)和C-3(δ169.1/169.3)相耦合。

在¹H-NMR谱中，可以看到有四个单峰信号，分别是一个甲基(δ_H4.04,δ_C56.55)和三个次甲基C-9(δ_H8.17，δ_C123.30)、C-8(δ7.53，δ_C110)、C-5(δ7.15，δ_C112.1)。在这部分结构中存在9个季碳，其中一个双键碳C-4(δ139.6)、两个羰基碳C-1和C-3作为外围碳。氢谱中H-8与H-9化学位移不同，而在HMBC中H-8与C-9、H-9与C-8相耦合，在NOE中显示两者空间相关，说明两者相关，但不在同一个苯环上；总之，上述表明两个环绕质子在同一萘基上。在HMBC中，H-8分别与C-4a，C-6，C-7和C-9相耦合，但不确定甲氧基与羟基在苯环上的位置。在NOE中甲基与H-8有强的相关信号，说明甲氧基与C-7相连。H-9与C-8和C-4a相耦合，进一步说明H-8与H-9是相关联的，H-9与C-1和C-3a也相关联。因此，可以推断出C-1与C-9a相连。另外，虽然C-3与C-3a相连的键不能被测定，但基于C-3a(δ123.29)的化学位移，两者相连是合理的。在HMBC中单峰H-5(δ7.15)与C-6和C-7相耦合，可以推断出其与H-8是对位的关系；在NOE中H-5与H-6'相耦合，最终确定这是一个四取代的苯环。在碳谱中C-9a未被检测到，但是在HMBC谱中有相关；且在以DMSO-d6为溶剂的核磁碳谱中，可以检测到强而单一的色谱峰，但在HMBC中δ125.20/125.23处未发现相关信号，所以该信号归于C-9a。

根据以上信息，可确定此新生物碱为上述结构。而出现许多双重信号的原因是由于存在一个手性碳(C-2”)和一个旋转对映异构中心(C-4与C-1'相连键)。

本发明还提供上述此异吲哚生物碱类化合物的提取分离方法，具体步骤为。

步骤1：称取马齿苋干燥药材150kg，采用水煎煮提取，水用量为药材的10倍，煎煮提取两次，每次煎煮2h，水提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用。

步骤2：将步骤1中所得药液，用乙酸乙酯反复萃取3次，乙酸乙酯与浓缩液的体积比例为1:1(v:v)，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。

步骤3：将步骤2中所得乙酸乙酯萃取物干法上样，经硅胶柱层析分离，其中硅胶为200～300目，依次用乙酸乙酯-甲醇(3:1、1:1、1:3，v:v)梯度洗脱，共得到20个部位(即共得到20个瓶，每瓶400mL)，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的1～2洗脱部位(将合并后的1～2部位经50℃以下减压浓缩至干，备用。

步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的ODS中压柱层析分离，其中填料粒度为20～40μm，用甲醇-水(40/60，60/40，80/20，100/0，v/v)梯度洗脱(加压，使流速为1mL/min，温度为室温)，得到11个部位(即梯度洗脱得11个瓶，每瓶200mL)，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的1～2部位合并，50℃以下减压浓缩至干，备用。所述ODS的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

步骤5：将步骤4中所得显色部位经预处理的Sephadex LH-20柱层析，以甲醇-水(70/30，v/v)等度洗脱，得到42个部位(即梯度洗脱得42个瓶，每瓶20mL)经薄层色谱进行检测，显色，将显色的26～30部位合并，50℃以下减压浓缩至干，备用。所述Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

步骤6：将步骤5中所得物经HPLC分离制备，以乙腈-水(30/70，v/v)作为流动相，检测波长为230，280nm，制备得到本发明异吲哚生物碱类化合物，归一法测定纯度均为90～99％。

本发明异吲哚生物碱类化合物的抗炎作用。

1、主要材料。

1.1、药品和试剂：实验所用新生物碱化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；青霉素、链霉素(杭州四季青公司)；LPS(美国Sigma公司)；IL-6、TNF-α、PGE₂的ELISA试剂盒(美国Cayman公司)；细胞裂解液、Griess试剂(碧云天生物技术有限公司)。

1.2 细胞株：RAW264.7巨噬细胞(美国ATCC细胞库)。

1.3 分组：分为对照组、LPS组和实验组，各一组。

2 实验方法。

2.1 细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37.5％，CO₂培养箱中培养。

2.2 MTT比色法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×10⁴个/mL，每孔100μL，温度37℃，5％CO₂条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明生物碱化合物Oleraisoindole(1-50μM)，孵育1h后向LPS组和实验组分别加入终浓度为1μg/mL的LPS，另设调零组(含DMSO溶媒的培养液)，每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入5mg/mL MTT 20μL，温度37℃，5％CO₂条件下继续孵育4h后，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪570nm波长处测定各孔吸光值。

2.3 利用格里斯(Griess)法测定NO的含量，考察本发明种两新生物碱化合物对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的NO产生量的抑制作用。小鼠巨噬细胞RAW264.7传代后在含10％胎牛血清的高糖细胞培养基DMEM中培养，实验组加入不同浓度的本发明新生物碱化合物Oleraisoindole(1-20μM)，在37℃，5％CO₂条件下孵育1h后用LPS(终浓度为1μg/mL)诱导炎症反应，24h后收集上清液，每组处理重复3孔。Griess法测定细胞上清液中NO的含量，根据不同浓度本发明新生物碱化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响，用以反映NO水平。

2.4 ELISA法测定炎症因子IL-6、TNF-α和炎症介质PGE₂：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×10⁵个/mL，每孔1mL，温度37℃，5％CO₂条件下培养过夜，实验组加入本发明生物碱化合物Oleraisoindole(1-20μM)，培育1h后，在每孔加入LPS(终浓度为1μg/mL)，共孵育24h，每组处理重复3孔。ELISA法测定马齿苋来源新生物碱处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE₂的含量。

3 实验结果。

实验结果表明本发明新生物碱化合物对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的增殖无影响，安全无毒；并可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7所产生过量炎症细胞因子IL-6、TNF-α和炎症介质NO、PGE₂，且呈浓度依赖。细胞相对存活率实验结果如表2所示。

表2：本发明对RAW264.7巨噬细胞相对存活率的影响。

注：^*P<0.05与对照组比较(高浓度组有显著性差异)。

利用格里斯(Griess)法测定NO的含量实验结果见表3。

表3：本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响(均数±标准差，n＝3)。

注：^*P<0.05与对照组比较，^#P<0.05与LPS组比较。

ELISA法测定炎症因子IL-6、TNF-α和炎症介质PGE₂结果如表4所示。

表4：本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE₂含量的影响(均数±标准差，n＝3)。

注：^*P<0.05与对照组比较，^#P<0.05与LPS组比较。

本发明异吲哚生物碱类的抗肿瘤作用。

1 主要材料。

1.1 药品和试剂：实验所用新生物碱化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；青霉素、链霉素(杭州四季青公司)；

1.2 细胞株：人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB(中科院上海细胞库)。

1.3 分组：分为对照组、实验组和调零组(含DMSO溶媒的培养液)。

2 实验方法。

2.1 细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.2 MTI法检测细胞增殖，取对数生长期细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×10⁴个/mL，每孔100μL，温度37℃，5％CO₂条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明生物碱化合物，每组设3个复孔，加药后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。将含药培养液吸去，加入体积比为4：1的无血清培养液和MTT(终质量浓度为5mg/mL)共100mL，继续孵育4h，小心吸去上清液后，每孔加入DMSO 150μL，放于震荡器上震荡以使结晶完全溶解(5min)，酶标仪在570nm波长下检测各孔的吸光度(A)值。然后，计算各浓度化合物对细胞生长的抑制率,抑制率公式：细胞生长抑制率＝(1-A_加药孔/A_对照孔)×100％，再应用SPSS软件处理数据，将抑制率对药物浓度作曲线，计算IC₅₀值。

3 实验结果。

实验结果表明本发明新生物碱化合物对人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB、的增殖具有抑制作用，且随药物浓度增大，抑制率也明显升高，即呈浓度依赖。本发明两种新化合物对上述八种肿瘤细胞IC₅₀值见表5.

表5 本发明对肿瘤细胞的抑制作用。

综上所述，本发明提供异吲哚生物碱类及其提取分离方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、ODS中压柱层析、及Sephadex LH-20柱层析，HPLC分离制备，成功的分离得到新生物碱化合物，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗炎和抗肿瘤作用，因此本发明新生物碱及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。

Claims

1.一种马齿苋中异吲哚生物碱类化合物的提取分离方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤3、将步骤2中乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析分离，依次用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，乙酸乙酯和甲醇的体积比为3:1，1:1和1:3，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；

步骤4、将步骤3中所得物再经预处理的ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，甲醇和水的体积比为40:60，60:40，80:20和100:0，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位减压浓缩至干，得浓缩物备用；

步骤5、将步骤4中所得浓缩物经预处理的Sephadex LH-20，以甲醇-水等度洗脱，流动相洗脱程序为等度洗脱，且甲醇和水的体积比为70:30，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得浓缩物，备用；

步骤6、对步骤5中所得浓缩物进行HPLC分离制备，以乙腈和水的体积比为30:70作为流动相，检测波长为230、280nm，即得异吲哚生物碱类化合物；

所述ODS和Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡；

所述步骤2中浓缩液用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯与浓缩液的体积比为1:1；

所述马齿苋中异吲哚生物碱类化合物，分子式为：C₂₈H₂₃NO₈，命名为Oleraisoindole，其化学结构式如下：

。

2.如权利要求1所述提取分离方法，其特征在于，所述步骤1中水煎煮提取两次，每次煎煮2小时，水用量为药材的10倍。

3.如权利要求1-2任一所述的提取分离方法，其特征在于，所述马齿苋中异吲哚生物碱类化合物及其盐或衍生物用于制备抗炎和抗肿瘤的药物或保健品。