CN102702071A

CN102702071A - 一种天仙子中新化合物和制备方法及应用

Info

Publication number: CN102702071A
Application number: CN2012101913978A
Authority: CN
Inventors: 李军; 门启鸣; 杨丹
Original assignee: DALIAN INSTITUTE FOR DRUG CONTROL
Current assignee: DALIAN INSTITUTE FOR DRUG CONTROL
Priority date: 2012-06-12
Filing date: 2012-06-12
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明公开了一种天仙子中抗癌化合物的提取方法及应用，中药提取方法领域。本发明的化合物克罗酰胺的提取方法为6-甲氧基-7-羟基-1-（3-甲氧基-4-羟基苯基）-2-[（4-羟基苯基）-乙基]-2,3-萘二甲酰亚胺，其制备方法为取天仙子种子，用乙醇回流提取，得天仙子总浸膏，总浸膏先用蒸馏水溶解分散，用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层浸膏，乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱、制备液相，得到的化合物天仙子酰胺。本发明的化合物对乳腺肿瘤细胞、白血病肿瘤细胞生长有一定的抑制作用，显示出作为新型抗肿瘤药物的应用前景。

Description

一种天仙子中新化合物和制备方法及应用

技术领域

本发明属于中药提取方法领域，特别涉及一种中药天仙子中的化合物的提取方法及其在抗癌方面的应用。

背景技术

癌症是危害全人类健康的最为严重的疾病之一，病程长，病死率高，是当今社会中给患者和家人带来痛苦最多的疾病。据世界卫生组织统计，全世界每年死于癌症的患者约5000万，每年有600多万人死于癌症，因此癌症的预防与治疗任务十分艰巨。药物是癌症治疗的三大疗法之一，由来已久，但用化学药物治疗肿瘤只是近四十年的事。与手术治疗及放射治疗相比，化学药物治疗的历史要短得多。科学家经过四十多年的努力，已发现几十种有效的抗肿瘤药物。新抗肿瘤药物的不断发现及深入研究,已使肿瘤化学治疗成为学科并使肿瘤内科学得以诞生。但是多数常见实体瘤如肺癌、肝癌、结肠癌及胰腺癌等还缺乏有效药物，不少抗肿瘤药在临床应用过程中易产生耐药性，因此，新型抗肿瘤药物研究势在必行。近年来，随着科学技术的迅猛发展及分子肿瘤学、分子生物学技术的进步，新抗肿瘤药物不断涌现，抗癌药物的研究与开发已进入一个崭新的阶段。

许多化学抗癌药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞，且临床上用于治疗肿瘤的化学药物，大多数品种有不同程度的致突变遗传毒性，为此治疗肿瘤的同时增加了病人第二种肿瘤的可能性。在这种情况下，中草药在抗癌抗突变方面具有独特的优势和广阔的应用前景。

天仙子为我国传统解痉、止痛药，明代著明本草学家李时珍的《本草纲目》谓：“主治癫狂、风痹厥痛、喘咳、牙痛．痈肿、恶疮”。80年代以来天仙子的临床应用有新的发展，主要治疗作用是解除小血管和平滑肌的痉挛，感染性休克，改善微循环，胞膜，调节植物神经和多种体液因子等。近年来，具研究发现天仙子的一些化合物还具有抗癌活性。但其抗癌活性机制还有待研究清楚。我们可以进一步研究其在体内及体外的作用，为临床应用提供更科学的依据，也为扩大其应用范围提供依据。

本发明旨在筛选天仙子抗癌活性导向天然产物，为进一步开发抗癌新药提供科学基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有木脂素酰胺类物结构的化合物天仙子酰胺，以及化合物的提取方法及其在抗癌制药中的应用。该化合物的结构如下：

Figure 2012101913978100002DEST_PATH_IMAGE001

化学名称为：6-甲氧基-7-羟基-1-（3-甲氧基-4-羟基苯基）-2-[（4-羟基苯基）-乙基]-2,3-萘二甲酰亚胺

本发明的化合物的提取方法如下：

1、取天仙子干燥成熟种子或经炒法炒制的种子，粉碎成粉末，用6-9倍量的70-80%乙醇回流提取，每次1小时，提取2次，将提取液中的乙醇减压回收，至无醇味，得天仙子总浸膏；

2、总浸膏先用蒸馏水溶解分散，先用等体积的石油醚萃取1-3次，再用乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂乙酸乙酯，得乙酸乙酯层浸膏；

3、乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇（50:1）洗脱，得到的馏分又经硅胶柱色谱以三氯甲烷-丙酮（3:1）洗脱，得到的组分经硅胶柱三氯甲烷-甲醇（3:1）纯化后，以甲醇-水（50:50）为流动相，紫外检测器，检测波长为244nm，在制备液相中进一步去杂质，得到纯度为98%的天仙子酰胺化合物。

本发明的化合物天仙子酰胺采用MTT法检测进行了抗癌实验研究。实验结果表明天仙子酰胺对人乳腺癌细胞、白血病细胞生长有一定的抑制作用，显示出作为新型抗肿瘤药物的应用前景。

本发明天仙子为Henbane (Hyoscyamus niger L.) 干燥成熟种子，炒法炒制的种子是指锅预热至190℃，投入生品种子，拌炒5-10分钟即得。天仙子酰胺为淡黄色粉末，碘化铋钾显色呈阳性，茚三酮反应呈阳性。

具体实施方式

以下实施例子进一步解释本发明的内容，但并不用以限制本发明。

实施例1

1、取天仙子干燥成熟种子3kg，粉碎成粉末，用7倍量的75%乙醇回流提取，每次1小时，提取2次，将提取液中的乙醇减压回收，至无醇味，得天仙子总浸膏；

2、总浸膏先用蒸馏水溶解分散，先用等体积的石油醚萃取2次，再用乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂乙酸乙酯，得乙酸乙酯层浸膏；

3、乙酸乙酯层浸膏硅胶拌样，经硅胶柱色谱，硅胶为100-200目，以三氯甲烷-甲醇（50:1）洗脱，合并得到的馏分；后经硅胶柱色谱，硅胶为200-300目，以三氯甲烷-丙酮（3:1）洗脱，合并得到的组分；再经硅胶柱三氯甲烷-甲醇（3:1），硅胶为200-300目，纯化后，得到纯化物;

4、将纯化物在安捷伦制备液相中进一步去杂质，以甲醇-水（50:50）为流动相，紫外检测器，检测波长为244nm，制备柱为安捷伦C₁₈得到纯度为98%的化合物天仙子酰胺约65mg。

实施例2

1、取天仙子炒制的种子3kg，粉碎成粉末，用6倍量的70%乙醇回流提取，每次1小时，提取2次，将提取液中的乙醇减压回收，至无醇味，得天仙子总浸膏；

2、总浸膏先用蒸馏水溶解分散，先用等体积的石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂乙酸乙酯，得乙酸乙酯层浸膏；

3、乙酸乙酯层浸膏硅胶拌样，经硅胶柱色谱，硅胶为100-200目，以三氯甲烷-甲醇（50:1）洗脱，合并得到的馏分；后经硅胶柱色谱，硅胶为200-300目，以三氯甲烷-丙酮（3:1）洗脱，合并得到的组分；再经硅胶柱三氯甲烷-甲醇（3:1），硅胶为200-300目，纯化后，得到纯化物；

实施例3

1、取天仙子炒制的种子3kg，粉碎成粉末，用9倍量的80%乙醇回流提取，每次1小时，提取2次，将提取液中的乙醇减压回收，至无醇味，得天仙子总浸膏；

2、总浸膏先用蒸馏水溶解分散，先用等体积的石油醚萃取1次，再用乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂乙酸乙酯，得乙酸乙酯层浸膏；

4、将纯化物在安捷伦制备液相中进一步去杂质，以甲醇-水（50:50）为流动相，紫外检测器，检测波长为244nm，制备柱为安捷伦C₁₈得到纯度为98%的化合物天仙子酰胺约78mg。

实施例4

天仙子酰胺的抗癌活性

人肿瘤细胞株

乳腺肿瘤细胞系MCF-7，白血病细胞系K562购自ATCC，保存在中科院大连化学物理研究所药用资源开发组。用RPMI-1640培养液(含10%的小牛血清, 100KU·L^-1青霉素，100mg·L^-1链霉素)，在37℃，5%CO₂，相对湿度100%条件下培养。

、试剂及主要仪器

PBS 溶液（pH=7.4）；RPMI-1640 培养基；0.25%胰酶消化液；小牛血清；青霉素；链霉素；四氮唑蓝(MTT)；二甲亚砜(DMSO)；旋转蒸发仪；超净台；酶标仪(Multiskan MK3)；5％CO₂ 恒温细胞培养箱。

、癌细胞株的抑制实验

取对数生长的肿瘤细胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，用培养液稀释至5×10⁴个·ml^-1，接种于96孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱过夜，待细胞贴壁，各实验组和空白组分别加入等体积的不同浓度的药物和培养液，化合物的浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 μm继续培养 12h，24h，36h。

、MTT法测定

加药后的特定时间，每孔加入20μl MTT（5mg·ml^-1），继续培养4h。吸去上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）150μl·孔^-1，振荡10min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在570 nm波长处测其OD值，根据下式计算细胞抑制率，细胞抑制率(%) = (对照组OD 值- 实验组OD 值) / 对照组OD 值×100% ，结果见表1、2、3。

、实验结果

表1 加药后培养12小时

Figure 2012101913978100002DEST_PATH_IMAGE002

表2 加药后培养24小时

表3 加药后培养36小时

结果表明天仙子酰胺对乳腺肿瘤细胞，白血病细胞细胞生长均有一定的抑制作用，可用于制备新型的抗癌药物。

Claims

1.一种天仙子中新化合物，其特征在于：化学名称为6-甲氧基-7-羟基-1-（3-甲氧基-4-羟基苯基）-2-[（4-羟基苯基）-乙基]-2,3-萘二甲酰亚胺，即天仙子酰胺。

2.一种天仙子中新化合物的制备方法，其特征在于

（1）取天仙子干燥成熟种子或经炒法炒制的种子，粉碎成粉末，用6-9倍量的70-80%乙醇回流提取，每次1小时，提取2次，将提取液中的乙醇减压回收，至无醇味，得天仙子总浸膏；

（2）浸膏先用蒸馏水溶解分散，先用等体积的石油醚萃取1-3次，再用乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂乙酸乙酯，得乙酸乙酯层浸膏；

（3）乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇（50:1）洗脱，得到的馏分又经硅胶柱色谱以三氯甲烷-丙酮（3:1）洗脱，得到的组分经硅胶柱三氯甲烷-甲醇（3:1）纯化后，以甲醇-水（50:50）为流动相，紫外检测器，检测波长为244nm，在制备液相中进一步去杂质，得到纯度为98%的天仙子酰胺化合物。

3.权利要求1所述的化合物天仙子酰胺在制备抗乳腺癌和白血病药物中的应用。