CN102675270B - 一种天仙子中抗癌化合物的提取方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天仙子中抗癌化合物的提取方法及应用，中药提取方法领域。本发明的化合物克罗酰胺的提取方法为取天仙子种子，用6-9倍量的70-80%乙醇回流提取，每次2小时，提取3次，得天仙子总浸膏；总浸膏先用蒸馏水溶解分散，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯层浸膏；乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱、制备液相，得到的化合物克罗酰胺。本发明的化合物对乳腺肿瘤细胞、前列腺肿瘤细胞生长有一定的抑制作用，显示出作为新型抗肿瘤药物的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于中药提取方法领域，特别涉及一种中药天仙子中的化合物的提取方法及其在抗癌方面的应用。
背景技术
癌症严重威胁着人类的生命健康。据世界卫生组织统计，全世界每年死于癌症的患者约5000万，每年有600多万人死于癌症，因此癌症的预防与治疗任务十分艰巨。药物是癌症治疗的三大疗法之一，由来已久，但用化学药物治疗肿瘤只是近四十年的事。与手术治疗及放射治疗相比，化学药物治疗的历史要短得多。科学家经过四十多年的努力，已发现几十种有效的抗肿瘤药物。新抗肿瘤药物的不断发现及深入研究，已使肿瘤化学治疗成为学科并使肿瘤内科学得以诞生。但是多数常见实体瘤如肺癌、肝癌、结肠癌及胰腺癌等还缺乏有效药物，不少抗肿瘤药在临床应用过程中易产生耐药性，因此，新型抗肿瘤药物研究势在必行。近年来，随着科学技术的迅猛发展及分子肿瘤学、分子生物学技术的进步，新抗肿瘤药物不断涌现，抗癌药物的研究与开发已进入一个崭新的阶段。
抗癌药物的开发已成为本世纪新药研究的重大课题。医学界在寻求和使用抗癌药物的同时，发现许多化学抗癌药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞，且临床上用于治疗肿瘤的化学药物，大多数品种有不同程度的致突变遗传毒性，为此治疗肿瘤的同时增加了病人第二种肿瘤的可能性。在这种情况下，中草药在抗癌抗突变方面具有独特的优势和广阔的应用前景。
天仙子为我国传统解痉、止痛药，明代著明本草学家李时珍的《本草纲目》谓：“主治癫狂、风痹厥痛、喘咳、牙痛、痈肿、恶疮”，80年代以来天仙子的临床应用有新的发展，主要治疗作用是解除小血管和平滑肌的痉挛，感染性休克，改善微循环，胞膜，调节植物神经和多种体液因子等。近年来，具研究发现天仙子的一些化合物还具有抗癌活性。但其抗癌活性机制还有待研究清楚。我们可以进一步研究其在体内及体外的作用，为临床应用提供更科学的依据，也为扩大其应用范围提供依据。
本发明旨在筛选天仙子抗癌活性导向天然产物，为抗癌药物的新药研制与开发提供先导化合物，为进一步开发抗癌新药提供科学基础，在人类与癌症斗争的伟大战役中创造潜在的、巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有木脂素酰胺类物结构的化合物克罗酰胺（gro-
ssamide），以及化合物的提取方法及其在抗癌制药中的应用。该化合物的结构如下：
本发明的化合物的提取方法如下：
1、取天仙子干燥成熟种子或经炒法炒制的种子，粉碎成粉末，用6-9倍量的60-80%乙醇回流提取，每次1-3小时，提取2-4次，将提取液中的乙醇减压回收，至无醇味，得天仙子总浸膏；
2、总浸膏先用蒸馏水溶解分散，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2-5次，回收溶剂得各层浸膏，取乙酸乙酯层浸膏；
3、乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇（50:1）洗脱，得到的馏分又经硅胶柱色谱以三氯甲烷-丙酮（3:1）洗脱，得到的组分经硅胶柱三氯甲烷-甲醇（7:1）纯化后，以甲醇-水（7:3）为流动相，紫外检测器，检测波长为223nm，在制备液相中进一步去杂质，得到化合物克罗酰胺。
本发明的化合物克罗酰胺采用SRB法检测进行了抗癌实验研究。实验结果表明克罗酰胺对乳腺肿瘤细胞，前列腺肿瘤细胞生长均有一定的抑制作用，显示出作为新型抗肿瘤药物的应用前景。
本发明天仙子为Henbane (Hyoscyamus niger L.) 干燥成熟种子，炒法炒制的种子是指将锅预热至185-210℃，投入生品种子，拌炒5-10分钟即得。克罗酰胺为淡黄色粉末，碘化铋钾显色呈阳性，茚三酮反应呈阳性。
附图说明
图1化合物克罗酰胺高效液相色谱图。
具体实施方式
以下实施例子进一步解释本发明的内容，但并不用以限制本发明。
实施例1
1、取天仙子干燥成熟种子5kg，粉碎成粉末，用6倍量的60%乙醇回流提取，每次1小时，提取3次，将提取液中的乙醇减压回收，至无醇味，得天仙子总浸膏；
2、总浸膏先用蒸馏水溶解分散，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2次，回收溶剂得各层浸膏，取乙酸乙酯层浸膏；
3、乙酸乙酯层浸膏硅胶拌样，经硅胶柱色谱，硅胶为100-200目，以三氯甲烷-甲醇（50:1）洗脱，合并得到的馏分；后经硅胶柱色谱，硅胶为200-300目，以三氯甲烷-丙酮（3:1）洗脱，合并得到的组分；再经硅胶柱三氯甲烷-甲醇（7:1），硅胶为200-300目，纯化后，得到纯化物；
4、将纯化物在制备液相中进一步去杂质，以甲醇-水（7:3）为流动相，紫外检测器，检测波长为223nm，制备柱为安捷伦制备柱（Agilent Prep-C18 column,50×100mm,5um）得到纯度为98%的化合物克罗酰胺约185mg。
实施例2
1、取天仙子炒制的种子5kg，粉碎成粉末，用8倍量的75%乙醇回流提取，每次3小时，提取2次，将提取液中的乙醇减压回收，至无醇味，得天仙子总浸膏；
2、总浸膏先用蒸馏水溶解分散，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次，回收溶剂得各层浸膏，取乙酸乙酯层浸膏；
3、乙酸乙酯层浸膏硅胶拌样，经硅胶柱色谱，硅胶为100-200目，以三氯甲烷-甲醇（50:1）洗脱，合并得到的馏分；后经硅胶柱色谱，硅胶为200-300目，以三氯甲烷-丙酮（3:1）洗脱，合并得到的组分；再经硅胶柱三氯甲烷-甲醇（7:1），硅胶为200-300目，纯化后，以甲醇-水（7:3）为流动相，在制备液相中进一步去杂质，制备柱为安捷伦制备柱（Agilent Prep-C18 column,50×100mm,5um），得到纯度为99%的化合物克罗酰胺约270mg。
实施例3
1、取天仙子种子5kg，将锅预热至185℃，投入种子，拌炒8分钟即得炒制的种子，将炒制的种子粉碎成粉末，用9倍量的80%乙醇回流提取，每次2小时，提取4次，将提取液中的乙醇减压回收，至无醇味，得天仙子总浸膏；
2、总浸膏先用蒸馏水溶解分散，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，回收溶剂得各层浸膏，取乙酸乙酯层浸膏；
3、乙酸乙酯层浸膏硅胶拌样，经硅胶柱色谱，硅胶为100-200目，以三氯甲烷-甲醇（50:1）洗脱，合并得到的馏分；后经硅胶柱色谱，硅胶为200-300目，以三氯甲烷-丙酮（3:1）洗脱，合并得到的组分；再经硅胶柱三氯甲烷-甲醇（7:1），硅胶为200-300目，纯化后，以甲醇-水（7:3）为流动相，在制备液相中进一步去杂质，制备柱为安捷伦制备柱（Agilent Prep-C18 column,50×100mm,5um）得到纯度为98%的化合物克罗酰胺约200mg。
实施例4
1、取天仙子种子5kg，将锅预热至210℃，投入种子，拌炒5分钟即得炒制的种子，将炒制的种子粉碎成粉末，用7倍量的75%乙醇回流提取，每次3小时，提取34次，将提取液中的乙醇减压回收，至无醇味，得天仙子总浸膏；
2、总浸膏先用蒸馏水溶解分散，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，回收溶剂得各层浸膏，取乙酸乙酯层浸膏；
3、乙酸乙酯层浸膏硅胶拌样，经硅胶柱色谱，硅胶为100-200目，以三氯甲烷-甲醇（50:1）洗脱，合并得到的馏分；后经硅胶柱色谱，硅胶为200-300目，以三氯甲烷-丙酮（3:1）洗脱，合并得到的组分；再经硅胶柱三氯甲烷-甲醇（7:1），硅胶为200-300目，纯化后，以甲醇-水（7:3）为流动相，在制备液相中进一步去杂质，制备柱为安捷伦制备柱（Agilent Prep-C18 column,50×100mm,5um）得到纯度为98%的化合物克罗酰胺约235mg。
实施例5
克罗酰胺的抗癌活性
磺基罗丹明B (SRB)、台盼蓝均购自 Sigma 公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；RPMI1640购自Gibco公司；酶标仪为Bio-Rad公司产品Model 550。
1、人肿瘤细胞株
乳腺肿瘤细胞系MCF-7，前列腺肿瘤细胞系PC-3购自ATCC，保存在中科院大连化学物理研究所药用资源开发组。实验时选用对数生长期细胞。
2、肿瘤细胞株的抑制实验
采用SRB法检测两种化合物对MCF-7， PC-3细胞的毒性作用。细胞接种于含有10%新生牛血清的RPMI1640培养液中, 置37℃、5% CO2和全湿条件下培养。待细胞达到对数生长期时进行实验。将MCF-7， PC-3细胞接种于96孔板中，接种密度分别为：6000， 6500， 5000， 6000/孔/100 ul RPMI1640，于CO2孵箱中孵育24 h。之后，加入化合物，浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 μm；对照组加等体积含有1%二甲基亚砜的RPMI1640；空白组只有培养液不加细胞。每组设3个复孔。
培养48 h后，SRB法检测细胞的存活率。每孔加入50 ul 50%的预冷的三氯乙酸，96孔板置于-4 ℃一小时，冷水清洗五次后，SRB于37℃染色30 min。1%醋酸洗到为结合的SRB，晾干后使用Tris (10 mM, pH 10.5) 溶解结合的染料，酶标仪于570 nm下测定吸光度（A值），计算生长抑制率( IR) 。IR ( %) = [ 1 - (实验组 A 值 - 空白组A 值) / (对照组A 值 - 空白组 A 值) ] ×100 %。实验重复 3 次见表1。
表1 克罗酰胺肿瘤细胞的体外抑制作用
SRB比色法测定不同作用时间条件下，加入化合物，浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 μm，培养24小时后。结果表明克罗酰胺对乳腺肿瘤细胞，前列腺肿瘤细胞生长有一定的抑制作用。
Claims (1)
1.化合物克罗酰胺在制备抗乳腺癌药物中的应用；
天仙子中抗癌化合物的提取方法，如下:
(1)取天仙子干燥成熟种子或经炒法炒制的种子，粉碎成粉末，用6-9倍量的60-80％乙
醇回流提取，每次1-3小时，提取2-4次，将提取液中的乙醇减压回收，至无醇味，得天仙子总浸膏；
(2)总浸膏先用蒸馏水溶解分散，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2-5次，回收溶剂得各层浸膏，取乙酸乙酯层浸膏；
(3)乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱，以50:1的三氯甲烷-甲醇洗脱，得到的馏分又经硅胶柱色谱以3:1的三氯甲烷-丙酮洗脱，得到的组分经硅胶柱7:1三氯甲烷-甲醇纯化后，以7:3的甲醇-水为流动相，紫外检测器，检测波长为223nm，在制备液相中进一步去杂质，得到化合物克罗酰胺。
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