CN110776409B - 一种印度黄檀的提取方法及提取物在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及印度黄檀的提取方法,所述黄檀为豆科Leguminosae黄檀属Dalbergia植物印度黄檀Dalbergia sissoo Roxb.;提取物包含醇提取物、乙醚提取物、石油醚提取物;提取物中分离的单体有4‑甲氧基黄檀醌(4‑Methoxydalbergione)。具体包括以下步骤:取印度黄檀心材,刨成薄片后粉碎并过2号筛,提取溶剂为乙醇或甲醇溶液,料液比为1∶2‑1∶8,加热回流提取2‑5次,每次1‑3h。趁热滤过,合并滤液,减压浓缩成稀浸膏状。通过细胞实验证实了印度黄檀具有重要的药用价值。其单体能够显著抑制人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF‑7和小鼠乳腺癌细胞4T1及人脑胶质瘤细胞U87的增殖,影响其形态功能。将为印度黄檀的开发利用提供依据,为抗肿瘤药物的研发提供新的选择。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及植物印度黄檀心材及其提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
恶性肿瘤严重危害着人类的健康,是引起全世界广泛关注的严重公共卫生问题。世界卫生组织(WHO)数据显示,人群中,因慢性病死亡的人数占所有死因的70%,其中肿瘤排第2位。据国际癌症研究机构(IARC)研宄预测,2020年全球癌症新发病例将达约1711万人,2030年将达约2165万人。我国2017年主要疾病的死亡率顺位结果显示:恶性肿瘤死亡率居第1位,据估计我国每年慢性病死亡人数约800万,肿瘤新发病例约310万,死亡约200万;近20年来发病率年均增长4%。
中药抗肿瘤具有作用多靶点作用、药效持久、毒副作用小等有优点,中药及其有效成分已成为当今抗肿瘤药物研究热点之一。
《中国药典》(2015版)规定降香唯一来源是降香檀,具有理气、活血化瘀、止痛止血的功效,用于治疗吐血,衄血及外伤出血,还可用于治疗肝郁胁痛,胸痹刺痛,跌扑伤痛,呕吐腹痛等。但降香檀资源经过度开采,国内野生资源已面临濒危,而人工栽培生长周期长,需要10年才能初步结香,30年才能成材,未能解决市场需求。
印度黄檀Dalbergia sissoo Roxb.为豆科Leguminosae黄檀属Dalbergia植物,是一种较为珍贵的中药材,历史上曾作为中药降香广泛使用,称“番降”。我国学者根据形态、产地、功效等,经过长期考证,认为“番降”即印度黄檀。印度黄檀生长迅速,种植5年生的印度黄檀一般就能形成心材,10-15年就基本成材。由于印度黄檀生长优势明显,且具有确切的药用价值,我国自上世纪90年代开始在国内引种印度黄檀,主要分布于广东、广西、海南、福建、浙江、云南等地。
目前印度黄檀未纳入《中国药典》,其药理活性研究较少,其活性部位、活性成分含量等都不够明确,主要成分的药理活性多集中在黄酮类化合物,相关黄酮类成分具体诸多功效,如抗血小板凝聚、增加冠脉流量,抗炎、抗菌、抗氧化作用,中枢神经系统对胶质细胞的保护作用及对骨肉瘤、肺癌等的抗肿瘤作用等。
经检索文献和国内外专利,未发现有关印度黄檀及其提取物对肝癌、乳腺癌和胶质瘤等抗肿瘤作用报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种印度黄檀的提取方法及提取物在抗肿瘤药物中的应用,以解决上述背景技术中存在的多种缺点和弊病。
印度黄檀的提取方法,所述印度黄檀为豆科Leguminosae黄檀属Dalbergia植物印度黄檀Dalbergia sissoo Roxb.。
具体包括以下步骤:取印度黄檀心材,刨成薄片后粉碎并过2号筛,提取溶剂为乙醇或甲醇溶液,料液比为1∶2-1∶8,加热回流提取2-5次,每次1-3h。趁热滤过,合并滤液,减压浓缩成稀浸膏状。
印度黄檀石油醚提取物的方法包括以下步骤:取印度黄檀心材,刨成薄片后粉碎并过2号筛,加入石油醚溶剂,料液比为1∶2-1∶8,超声提取0.5-2h,浸泡12-48h,滤过,再次加入石油醚进行提取,提取2-5次,合并滤液,减压浓缩,得深棕色油状液体。
印度黄檀乙醚提取物的方法包括以下步骤:取印度黄檀心材,刨成薄片后粉碎并过2号筛,加入乙醚溶剂,料液比为1∶2-1∶8,超声提取0.5-2h,冷浸12-48h,滤过,再次加入乙醚进行提取,提取2-5次,合并滤液,加入无水硫酸钠脱水12-24h,滤过,置通风橱内自然挥干乙醚,得深棕色油状液体。
4-甲氧基黄檀醌(4-Methoxydalbergione)的分离、纯化方法包括以下步骤:将三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位成分进行分离纯化:取少量甲醇分别溶解三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位稠浸膏,加入1.5倍量硅胶(80~100目)拌样,研磨均匀,水浴挥至无醇味,上样。依次用环己烷-乙酸乙酯(体积比100∶0~0∶100)进行梯度洗脱,每份收集约100ml。经TLC检视,相同流分合并,减压浓缩,析出黄色晶体,经萃取、重结晶,得化合物4-甲氧基黄檀醌。
所述抗肿瘤药物为含有印度黄檀原植物所制成的饮片和/或其醇提取物或乙醚提取物或石油醚提取物或其中分离的单体化合物4-甲氧基黄檀醌,还包含常规药用辅料;所述肿瘤是肝癌、乳腺癌和脑胶质瘤。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
印度黄檀Dalbergia sissoo Roxb.历史上曾作为中药降香广泛使用,称“番降”。具有行气、活血、止痛等药效。本发明通过细胞实验证实了印度黄檀中提取分离的单体化合物4-甲氧基黄檀醌(4-Methoxydalbergione)能够显著抑制人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7和小鼠乳腺癌细胞4T1及人脑胶质瘤细胞U87的增殖。本发明将为印度黄檀的临床应用提供科学依据,为抗肿瘤药物的开发提供新的选择。
本发明通过细胞实验证实了印度黄檀具有重要的药用价值。其单体能够显著抑制人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7和小鼠乳腺癌细胞4T1及人脑胶质瘤细胞U87的增殖,影响其形态功能。将为印度黄檀的开发利用提供依据,为抗肿瘤药物的研发提供新的选择。
附图说明
图1为印度黄檀原植物图及其心材和粉末;
图2为化合物4-甲氧基黄檀醌的外观图和紫外吸收光谱图;
图3为单体化合物4-甲氧基黄檀醌(4-Methoxydalbergione)的HPLC色谱图;
图4为化合物4-甲氧基黄檀醌对人肝癌细胞HepG2的细胞增殖及抑制作用结果;
图5为化合物4-甲氧基黄檀醌对人乳腺癌细胞MCF-7的细胞增殖及抑制作用结果;
图6为化合物4-甲氧基黄檀醌对鼠乳腺癌细胞4T1的细胞增殖及抑制作用结果;
图7为化合物4-甲氧基黄檀醌对人脑胶质瘤细胞U87的细胞增殖及抑制作用结果;
图8为化合物4-甲氧基黄檀醌对人肝癌细胞HepG2形态的影响;
图9为化合物4-甲氧基黄檀醌对人脑胶质瘤细胞U87形态的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:印度黄檀饮片的制备
本品为豆科Leguminosae黄檀属Dalbergia植物印度黄檀Dalbergia sissooRoxb.的干燥心材(图1B),除去边材,阴干,劈成小块,碾成细粉或镑片。
实施例2:印度黄檀心材粉末的制备取印度黄檀,除去边材,阴干,刨成薄片后用粉碎机粉碎过50-150目筛,即得(图1C)。
实施例3:印度黄檀醇提取物的制备
取印度黄檀心材,刨成薄片后粉碎并过2号筛,提取溶剂为乙醇或甲醇溶液,料液比为1∶2-1∶8,加热回流提取2-5次,每次1-3h。趁热滤过,合并滤液,减压浓缩成稀浸膏状。
实施例4:印度黄檀石油醚提取物的制备
取印度黄檀心材,刨成薄片后粉碎并过2号筛,加入石油醚溶剂,料液比为1∶2-1∶8,超声提取0.5-2h,浸泡12-48h,滤过,再次加入石油醚进行提取,提取2-5次,合并滤液,减压浓缩,得深棕色油状液体。
实施例5:印度黄檀乙醚提取物的制备
取印度黄檀心材,刨成薄片后粉碎并过2号筛,加入乙醚溶剂,料液比为1∶2-1∶8,超声提取0.5-2h,冷浸12-48h,滤过,再次加入乙醚进行提取,提取2-5次,合并滤液,加入无水硫酸钠脱水12-24h,滤过,置通风橱内自然挥干乙醚,得深棕色油状液体。
实施例6:4-甲氧基黄檀醌(4-Methoxydalbergione)的分离、纯化
将三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位成分进行分离纯化:取少量甲醇分别溶解三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位稠浸膏,加入1.5倍量硅胶(80~100目)拌样,研磨均匀,水浴挥至无醇味,上样。依次用环己烷-乙酸乙酯(体积比100∶0~0∶100)进行梯度洗脱,每份收集约100m1。经TLC检视,相同流分合并,减压浓缩,析出黄色晶体,经萃取、重结晶,得化合物4-甲氧基黄檀醌(4-Methoxydalbergione)(图2)。
实施例7:HPLC对单体化合物的纯度检测
色谱条件:色谱柱为Waters Symmetry ODS C18(4.6mm×250mm,5μm);流动相为甲醇-0.2%(体积分数,下同)H3PO4水溶液,梯度洗脱,程序见表1;流速为1mL/min;柱温为30℃;进样量为10μL;检测波长:0~15min为280nm,15~22min为260nm,22~27min为350nm,27~30min为260nm,30~52min为293nm。单体化合物的HPLC色谱图(图3)。
表1梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution conditions
检测结果:使用HPLC法检测并用峰面积归一化法计算,其质量分数大于98.00%。
实施例8:印度黄檀成分抗肿瘤活性实验
(1)仪器及试药
Biotek Elx800酶标仪(美国BioTek);二氧化碳培养箱(MCO-20AIC型,日本三洋株式会社);SW-CJ-2FD超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);DK-8D电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司);TDL-40B低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);实验室高压蒸汽灭菌锅(MLS-3750型,日本三洋株式会社);微量移液器(1000μl、100μl、10μl、2.5μl,德国艾本德股份有限公司);96孔板(美国Coming公司);倒置显微镜(Ti2,日本NIKON)。2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8,CCK-8,大连美仑);DMEM(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Gibco公司);PBS磷酸缓冲液(美国Gibco公司);胰蛋白酶(美国Gibco公司);二甲基亚砜(DMSO,美国sigma公司);人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U-87MG)、人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、鼠乳腺癌细胞(4T1)均来自ATCC细胞库;单体化合物4-甲氧基黄檀醌为实验室自制(纯度>98.0%)。
(2)细胞培养与传代
各细胞用培养基(89%DMEM,10%胎牛血清,1%双抗)于37℃、5%CO2培养箱中培养,3~4d传代1次,传代时移除旧培养基,采用PBS冲洗2次,每次1ml,而后加入0.25%(w/v)Trypsin-0.53mM EDTA(1∶4)1ml,30s后置倒置显微镜下观察大部分贴壁细胞已消化至成单个细胞后,加入10ml培养基,移至离心管中,1000r/min离心5min,移除上层液体,加入适当培养基,计数,调整至合适浓度。
(3)肿瘤细胞体外增殖抑制试验
取对数生长期细胞,用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mM EDTA(1∶4)消化后,调整细胞浓度至2×104个/ml;取96孔板,每孔加入上述含细胞生物培养液100μl(边缘孔用无菌PBS填充),5%CO2,37℃孵育12h。
各细胞贴壁后,加入含浓度梯度(2.5、5、10、25、50、100μM)药物的培养液,每组4个复孔,并设置溶媒对照组。在浓度为5%的CO2,温度为37℃条件下孵育24h、48h、72h,4T1细胞作用48h,每孔加入CCK-8溶液10μl,继续培养2h,置酶标仪OD 450nm波长下测量各个孔的吸光值,根据吸光值计算细胞增殖抑制率,采用Prism软件处理和分析以上数据,4-Methoxydalbergione对HepG2具有极强的增殖抑制作用(24h IC50为5.4μM;48h IC50为1.7μM;72h IC50为1.2μM)(图4);对MCF-7具有极强的增殖抑制作用(24h IC50为5.2μM;48hIC50为1.5μM;72h IC50为1.2μM)(图5);对4T1具有增殖抑制作用,48h IC50为35μM(图6);对U87具有较强的增殖抑制作用(24h IC50为10.0μM;48h IC50为4.6μM;72h IC50为5.0μM)(图7)。
(4)印度黄檀成分对肿瘤细胞形态影响
取对数生长期细胞,用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mM EDTA(1∶4)消化后,取6孔板,每孔加入细胞5×103个,5%CO2,37℃孵育12h。细胞贴壁后,U87细胞加入含浓度梯度(2.5、5、10、20μM)药物的培养液,HepG2细胞加入含浓度梯度(2.5、5、10μM)药物的培养液每组3个复孔,并设置溶媒对照组。在浓度为5%的CO2,温度为37℃条件下U87细胞孵育24h、48h,HepG2细胞作用48h,倒置显微镜下观察细胞形态。细胞在2.5μM-100μM浓度梯度4-Methoxydalbergione作用后,HepG2细胞在5μM浓度下作用24h(图8)、U87细胞在10μM浓度下作用24h(图9)已出现细胞形态显著改变,细胞皱缩,体积明显变小,细胞贴壁不牢,易脱落。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (1)
1.一种印度黄檀提取物在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述抗肿瘤药物为含有印度黄檀原植物中分离的单体化合物4-甲氧基黄檀醌,还包含常规药用辅料;所述肿瘤是肝癌、乳腺癌和脑胶质瘤。
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