CN110885385B - 翼首草毒素a及其应用和低肝损伤毒性翼首草提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了翼首草毒素A及其应用和低肝损伤毒性翼首草提取物的制备方法，本发明首次从翼首草中分离鉴定得到的Pterocephtoxin A，研究发现Pterocephtoxin A具有诱导肝损伤的作用，因此在制备翼首草提取物时去除含有Pterocephtoxin A的部分，能够为翼首草临床合理用药提供重要的保障。

Description

翼首草毒素A及其应用和低肝损伤毒性翼首草提取物的制备 方法

技术领域

本发明涉及天然药物化学领域，具体涉及翼首草毒素A，还涉及翼首草毒素A的应用和低肝损伤毒性翼首草提取物的制备方法。

背景技术

类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，临床上主要表现为对称性的关节疼痛和肿胀，并伴随着不同程度软骨结构和骨质的破坏。类风湿性关节炎的患者需长期服药，因此对药物的安全具有更高的要求。肝脏是人体最大的“加工厂”，承担着生物合成，代谢转化以及分泌排泄等重要功能。肝脏作为药物代谢的重要器官，大多数药物进入体内后，都会经肝脏代谢然后被机体吸收。因此，肝脏是体内药源性导致损伤的主要靶器官之一。中草药的肝毒性主要体现在中草药导致肝损伤之中。近年来，这一类的报道逐渐增加，在药物诱导的肝损伤之中，中草药约占45.43％。当今世界，约有80％的人已经习惯使用中草药进行疾病的治疗，而不恰当使用中草药是引发肝损伤的主要原因，而重视中药肝毒性已经成为评估中草药毒性的一个重要的环节。翼首草是一种常用的藏药材，藏语名有榜子毒乌，榜孜毒乌，榜孜夺吾等。2015版《中华人民共和国药典》(一部)收录川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hooker(C.B.Clarke)

的干燥全草作为其正品基源植物，其味苦、性寒、有小毒，具有解毒除瘟、清热止痢、祛风通痹的功效。翼首草民间用药历史非常悠久，诸多医药类典籍，如《藏药志》、《西藏常用中草药》、《晶珠本草》等都对翼首草的用药有详细的记载，其中，尤以抗类风湿性关节炎最为显著。同时，这些典籍之中同样也有关于翼首草“小毒”的记载。翼首草是一种常用藏药材，且拥有悠久的抗类风湿性关节炎用药历史，本发明阐明了从翼首草中分离鉴定得到的Pterocephtoxin A具有诱导肝损伤的作用，在制备工艺上去除含有Pterocephtoxin A的部分，能够为翼首草临床合理用药提供重要的保障。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种翼首草毒素A；本发明的目的之二在于提供翼首草毒素A的应用；本发明的目的之三在于提供一种低肝损伤毒性翼首草提取物；本发明的目的之四在于提供低肝损伤毒性翼首草提取物的制备方法；本发明的目的之五在于提供所述低肝损伤毒性翼首草提取物在制备类风湿性关节炎的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、翼首草毒素A，其结构式如下：

2、所述的翼首草毒素A在制备肝损伤的试剂中的应用。

3、一种低肝损伤毒性翼首草提取物，所述翼首草提取物不含翼首草毒素A或翼首草毒素A浓度低于肝损伤浓度。

优选的，所述翼首草提取物由以下方法制备：将干燥的翼首草粉碎后用乙醇溶液提取，回收溶剂得到浸膏，加水分散制成混悬液，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液减压浓缩回收溶剂，得到正丁醇萃取物，将得到的正丁醇萃取物过HP-20大孔树脂柱，乙醇体积分数低于40％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，得到低肝损伤毒性翼首草提取物。

优选的，所述提取为使用体积分数95％的乙醇溶液提取5次。

优选的，所述洗脱为使用乙醇-水体积比为0：100～40：60的溶液梯度洗脱。

4、低肝损伤毒性翼首草提取物的制备方法，包括如下步骤：将干燥的翼首草粉碎后用乙醇溶液提取，回收溶剂得到浸膏，加水分散制成混悬液，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液减压浓缩回收溶剂，得到正丁醇萃取物，将得到的正丁醇萃取物过HP-20大孔树脂柱，乙醇体积分数低于40％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，得到低肝损伤毒性翼首草提取物。

优选的，所述提取为使用体积分数95％的乙醇溶液提取5次。

优选的，所述洗脱为使用乙醇-水体积比为0：100～40：60的溶液梯度洗脱。

5、所述低肝损伤毒性翼首草提取物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明首次从翼首草中分离鉴定得到的PterocephtoxinA，并发现了Pterocephtoxin A具有诱导肝损伤的作用，因此在制备工艺上去除含有Pterocephtoxin A的部分，为翼首草临床合理用药提供重要的保障。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1显示了翼首草正丁醇萃取物的高效液相图和正丁醇萃取物各乙醇洗脱部位细胞毒活性分析(A：分离色谱图；B：细胞毒活性分析)。

图2显示了翼首草正丁醇萃取物80％乙醇洗脱部位B部分中，Pterocephtoxin A的制备示意图。

图3显示了Pterocephtoxin A的结构式。

图4显示了Pterocephtoxin A的¹H NMR谱图。

图5显示了Pterocephtoxin A的¹³C NMR谱图。

图6显示了不同剂量的Pterocephtoxin A对小鼠肝功能血清生化指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的影响(A：ALT；B：AST；图中Con为对照组，Pterocephtoxin A-L为低剂量组60mg/kg，Pterocephtoxin A-H为高剂量组120mg/kg组。与对照组相比：^*P<0.05，^**P<0.01)。

图7显示了不同剂量的Pterocephtoxin A对小鼠肝组织病理切片的变化：图中Con为对照组，Pterocephtoxin A-L为低剂量组60mg/kg，Pterocephtoxin A-H为高剂量组120mg/kg组。

图8显示了不同剂量的Pterocephtoxin A对人正常肝细胞L-02细胞存活率，乳酸脱氢酶(LDH)谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的影响(A：L-02细胞存活率；B：LDH；C：ALT；D：AST；图中Con为对照组，Pterocephtoxin A的浓度分别为2、4和8μmol/L。与对照组相比：^*P<0.05，^**P<0.01)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、Pterocephtoxin A的提取和分离

将匙叶翼首草样品(7.2kg)干燥(40℃，36h)后粉碎，用95％乙醇提取5次，减压回收溶剂，得到浸膏约1.9kg。将浸膏用适量的水分散制成混悬液(适当加热，使其完全混匀)，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。萃取液减压浓缩回收溶剂后，得到正丁醇部位200g。正丁醇萃取部位经HP-20大孔树脂柱色谱，乙醇-水系统(0：100～95：5)梯度洗脱，分别收集体积分数40％乙醇洗脱部位、体积分数60％乙醇洗脱部位、体积分数80％乙醇洗脱部位、体积分数95％乙醇洗脱部位、丙酮洗脱部位和乙酸乙酯洗脱部位。对各部位进行细胞毒活性筛选，结果如图1所示。结果显示，体积分数60％乙醇洗脱部位和体积分数80％乙醇洗脱部位的细胞毒活性较高。因此，选取体积分数80％乙醇洗脱部位进行后续分离。该部位经过MCI(甲醇-水体系)得到A、B和C三个部分。B部分经LH-20(甲醇)、正相硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇体系)，最终经过半制备液相(甲醇：水76：24)分离得到化合物Pterocephtoxin A(400mg，t_R＝74min)(图2)。

实施例2、Pterocephtoxin A的谱学数据

分离获得的Pterocephtoxin A的结构式如图3所示，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)和¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)见下表1，其相应的图谱，¹H NMR，¹³C NMR，分别见图4和图5。

表1、¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)和¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)

实施例3、Pterocephtoxin A诱导小鼠肝损伤研究

1、动物分组和给药方法

取昆明小鼠30只，实验室适应性喂养7天后，分为3组：对照组，Pterocephtoxin A-L组(60mg/kg)，Pterocephtoxin A-H组(120mg/kg)，连续灌胃给药16天，末次给药前12h，禁食不禁水。末次给药2h后，眼球取血，脱颈椎处死小鼠，取肝脏组织。

2、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)检测

各组小鼠血液收集至EP管内，4℃冰箱静置1h，5000rpm/min离心10min，取上层血清。全自动生化分析仪检测小鼠血清中ALT和AST的含量，结果如图6所示。结果显示，与对照组相比，Pterocephtoxin A-L组和Pterocephtoxin A-H组中ALT和AST明显升高，且有一定量效关系，其差别有统计学意义(P<0.01)结果表明Pterocephtoxin A能够诱导小鼠肝损伤。

3、肝组织病理切片检査

一部分小鼠肝组织置于4％多聚甲醛溶液中固定，经脱水、透明浸蜡、包埋、切片、摊片、苏木精和伊红染色后观察肝组织病理变化。实验结果见图7，肝组织病理切片结果表明，对照组小鼠的肝小叶结构清晰,肝细胞排列规律且整齐,无肿胀、萎缩等变化。Pterocephtoxin A-L组和Pterocephtoxin A-H组小鼠的肝细胞损伤明显,中央静脉充血严重，炎症细胞浸润明显，肝细胞变性坏死明显,表明Pterocephtoxin A能够引起肝损伤，且高剂量组比低剂量组严重。

实施例4、Pterocephtoxin A诱导人正常肝细胞L-02坏死研究

1、L-02细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)检测

正常人肝细胞株L-02置于96孔板中，约5000细胞/孔，每孔DMEM完全培养基约100μL，置于37℃，5％CO₂培养箱内12h后，吸弃上清，更换培养液并用不同剂量的Pterocephtoxin A处理24h，用CCK-8法检测细胞存活率，用LDH、ALT和AST试剂盒检测细胞上清液中LDH、ALT和AST的相对含量。实验结果见图8，与对照组相比，随着PterocephtoxinA浓度的逐渐增高，特别是16μmol/L时，L-02细胞的存活率均显著降低，且呈现剂量依赖性(P<0.01)，经过计算，Pterocephtoxin A的IC₅₀值为6.01±0.44μmol/L。与对照组相比，随着Pterocephtoxin A浓度的逐渐增高，L-02细胞上清液中LDH含量升高，且呈现剂量依赖性(P<0.01)，表明Pterocephtoxin A引起L-02细胞膜损伤。与对照组相比，随着pterocephtoxinA浓度的逐渐增高，L-02细胞上清液中ALT和AST的含量同样升高，说明Pterocephtoxin A诱导L-02细胞坏死，细胞上清液中肝功能指标ALT和AST上升。

2、L-02细胞内钙离子浓度(Ca²⁺)和活性氧(ROS)检测

L-02细胞接种在6孔板中，每孔细胞密度为1×10⁶个，每孔含DMEM完全培养基约为1.5mL，待细胞贴壁后，分别用2μmol/L、4μmol/L和8μmol/L的Pterocephtoxin A处理L-02细胞6h，检测细胞内Ca²⁺和ROS的含量。实验结果显示，与对照组相比，随着Pterocephtoxin A浓度的逐渐增高，L-02细胞内的Ca²⁺和ROS浓度显著升高(P<0.01)。

3、L-02细胞碘化丙啶(PI)染色检测

将L-02细胞以1×10⁵每孔的密度接种于24孔板中，其中每孔含DMEM完全培养液约为500μL，待细胞贴壁后，分别用2μmol/L、4μmol/L和8μmol/L的Pterocephtoxin A处理L-02细胞24h，处理结束后，PBS清洗两次，每孔加入450μL的DMEM，然后加入50μL PI染液(100μg/mL)染色30min，温度为37℃。PBS清洗2次，荧光显微镜下观察并拍照记录，放大倍数为200倍。PI染色的结果显示，在荧光显微镜下观察，与对照组相比，随着Pterocephtoxin A浓度的逐渐增高，红色荧光逐渐变强，特别是8μmol/L时，可以观察到非常明亮的红色荧光，表明随着Pterocephtoxin A浓度的逐渐增高，L-02细胞坏死数量明显增多。

实施例5、翼首草制备工艺

根据上述研究选择翼首草提取物按如下制备工艺：对翼首草正丁醇萃取物进行乙醇梯度洗脱，洗脱至乙醇体积分数最高为40％即可，去除含有毒性的乙醇体积分数为60％以后的部位，得到的提取物可以减轻翼首草在使用过程中引起的肝毒性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (7)

1.翼首草毒素A，其特征在于，其结构式如下：

。

2.权利要求1所述的翼首草毒素A在制备肝损伤的试剂中的应用。

3.一种低肝损伤毒性翼首草提取物，其特征在于：所述翼首草提取物不含翼首草毒素A或翼首草毒素A浓度低于肝损伤浓度；

所述翼首草毒素A其结构式如下：

。

4.根据权利要求3所述低肝损伤毒性翼首草提取物，其特征在于：所述翼首草提取物由以下方法制备：将干燥的翼首草粉碎后用乙醇溶液提取，回收溶剂得到浸膏，加水分散制成混悬液，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液减压浓缩回收溶剂，得到正丁醇萃取物，将得到的正丁醇萃取物过HP-20大孔树脂柱，用体积分数低于40%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，得到低肝损伤毒性翼首草提取物。

5.根据权利要求4所述低肝损伤毒性翼首草提取物，其特征在于：所述提取为使用体积分数95%的乙醇溶液提取5次。

6.根据权利要求4所述低肝损伤毒性翼首草提取物，其特征在于：所述洗脱为使用乙醇-水体积比为0：100~40：60的溶液梯度洗脱。

7.权利要求3~6任一项所述低肝损伤毒性翼首草提取物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

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