CN101244129A - 拉萨大黄提取物、其制备方法及其在制备治疗心脑血管疾病制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种拉萨大黄提取物、其制备方法及其在治疗药物制备中的用途，所述提取物从拉萨大黄的根和/或根茎中提取，其中含有二苯乙烯类化合物去氧土大黄苷和/或虎杖苷。属中药领域。其特征在于拉萨大黄为蓼科植物Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Haiao，提取物是从拉萨大黄的根和/或根茎中提取，其中含有二苯乙烯类化合物去氧土大黄苷和/或虎杖苷，二苯乙烯类化合物是指其化合物结构中含有二苯乙烯结构单元的一类化合物，其化学结构通式(如图)。其中，R选自H、OH、OCH₃、－O－葡萄糖基、－O－取代的葡萄糖基。

Description

拉萨大黄提取物、其制备方法及其在制备治疗心脑血管疾病制剂中的应用

技术领域  本发明涉及一种拉萨大黄提取物、其制备方法及其在治疗药物制备中的用途，所述提取物从拉萨大黄的根和/或根茎中提取，其中含有二苯乙烯类化合物去氧土大黄苷和/或虎杖苷。属中药领域。

背景技术  大黄是著名的传统中药，在疾病治疗中有着广泛应用(李秀才，大黄的研究进展，中国药学杂志.1998，33(10)：581~584；许义杵，大黄的应用及其机理研究进展，中国医院药学杂志.1992，12(9)：421~422)。已知分布于中国的大黄属植物有40余种(岳仁宋，大黄的实验研究与临床应用，中西医结合杂志.1990，10(5)：310~313)；据报道，迄今从大黄中分离到不同种类化合物80余种(张广斌，林霞，大黄的化学成分及临床应用，中华临床医药.2004，5(6)：115~116)，这些化合物主要有蒽醌类化合物、二苯乙烯类(芪类)化合物、鞣质以及黄酮、色酮、树脂、有机酸、植物甾醇等。

传统中医药中，大黄属植物中多以掌叶组大黄入药，判定大黄品质优劣主要是根据其泻下作用的强弱或有无；近现代研究中，多以蒽醌类化学成分作为其药学活性成分以及质量检测的指标成分。例如，《中国药典》收载的大黄品种有掌叶大黄(Rheum palmatumL.)、唐古特大黄(Rheumtanguticum Maxim.ex Balf.)及药用大黄(Rheum officinale Baill.)等，这些大黄品种被称之为“正品”大黄，《中国药典》还规定，正品大黄不得检出土大黄苷(芪类成分)。

除“正品”大黄外，民间作为大黄用的被称为山大黄，土大黄等的一些同属植物，主要有藏边大黄(Ruheum emodi Wall)、河套大黄(Rheum horaoenseC.Y.Cheng et C.T.Kao)、华北大黄(Rheum franzenbachii Miint.)、天山大黄(Rheum wittrochii Lundstr.)等。

尽管大黄所含蒽醌类化合物具有广泛的药理活性，但是此类化合物的诱变以及肾毒性等潜在毒副作用也越来越受到关注；而大黄所含二苯乙烯类化合物的潜在临床应用价值则受到了越来越多的重视。例如，中国专利申请99122378公开了波叶组大黄所含芪类化合物的降糖活性；中国专利01118193申请则公开了波叶组大黄所含芪类化合物的降血脂活性。而天然芪类化合物在改善微循环、改善冠脉血流、降压、抑制血小板凝集、清除自由基等多种生物活性也见于文献报道。

另一方面，随着大黄在中医药方面的广泛应用，正品大黄的药用资源也越来越紧张，研究开发非正品大黄显然具有积极的应用价值。

拉萨大黄(Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Haiao)属蓼科(Polygonaceae)大黄属(Rheum)植物，产于西藏东部，四川等地，生于海拔3500~4600m草坡上。此前未见有关拉萨大黄化学成分的系统研究报道及药理活性、临床应用的相关报道。

本发明人通过化学成分和生物活性研究，惊奇发现拉萨大黄具有重要的药用价值：首先，拉萨大黄中几乎不含具有潜在严重毒副作用的蒽醌类化学成分；其次，拉萨大黄中具有高含量的以去氧土大黄苷和虎杖苷为主的二苯乙烯类化合物；本发明人还发现，以二苯乙烯类化合物为主的拉萨大黄提取物以及纯化的去氧土大黄苷和虎杖苷均具有显著的心血管生理学活性，因此这些提取物均具有显著的药用价值。

发明内容  本发明的目的之一是提供一种拉萨大黄提取物，所述提取物从拉萨大黄的根和/或根茎中提取，其中含有二苯乙烯类化合物去氧土大黄苷和/或虎杖苷，所述拉萨大黄为Rheumlhasaense A.J.Li et P.K.Haiao。

本发明是这样完成的：一种拉萨大黄提取物，拉萨大黄为蓼科植物Rheum lhasaense A.J.Liet P.K.Haiao，其特征在于提取物是从拉萨大黄的根和/或根茎中提取。

本说明书及其权利要求书中，“二苯乙烯类化合物”是指其化合物结构中含有二苯乙烯结构单元的一类化合物，其化学结构可用通式1表示：

化学结构通式1

其中，R选自H、OH、OCH₃、-O-葡萄糖基、-O-取代的葡萄糖基。

本发明中，所述提取物中，以重量百分比计，二苯乙烯类化合物总含量优选不低于50％。

本发明所提供的一种拉萨大黄提取物是一种以二苯乙烯类化合物为主要化学成分的混合物。可以理解，此提取物中不同化学成分的含量随原料批次不同、处理工艺参数变化而有所变化。一般地，所述提取物中含有约60％~95％的去氧土大黄苷和虎杖苷，而其它二苯乙烯类化合物的含量约为1~10％。

显然，上述提取物可以用于进一步精制纯化以获得纯品去氧土大黄苷以及纯品虎杖苷。本发明中，所谓纯品去氧土大黄苷以及纯品虎杖苷分别是指化合物的纯度不低于90％。

本发明中，拉萨大黄为野生或栽培的拉萨大黄，以重量百分比计，所述提取物中二苯乙烯类化合物总含量为50％~100％。

本发明中，所述提取物中含有50％~85％去氧土大黄苷，5~15％虎杖苷，所述提取物中去氧土大黄苷与虎杖苷的含量比例为10∶1~5∶1。

本发明中，所述提取物中含有20％~45％的虎杖苷，5~15％的去氧土大黄苷，所述提取物中虎杖苷与去氧土大黄苷的含量比例为5∶1~2∶1。

本发明中，所述提取物是纯度为90％~100％的去氧土大黄苷，所述提取物是纯度为90％~100％的虎杖苷。

由此，本发明的又一个目的是提供从拉萨大黄中提取纯化的纯品去氧土大黄苷和/或纯品虎杖苷。其中，去氧土大黄苷是5-羟基-4’-甲氧基二苯乙烯-3-O-葡萄糖甙(4′-methoxy-5-hydroxy-stilbene-3-O-glucoside，deoxyrhaponticin)，虎杖苷是4’，5-二羟基二苯乙烯-3-O-葡萄糖甙(4′，5-dihydroxy-stilbene-3-O-glucoside，polydatin，piceid)，它们的化学结构分别如图2、3所示：

2去氧土大黄苷(deoxyrhaponticin)    3虎杖苷(polydatin，piceid)

本发明进一步提供上述拉萨大黄提取物的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：

(4)前处理：前处理步骤包括拉萨大黄原植物根或根茎的采集、净制和/或干燥、切碎或粉碎；

(5)提取：所述提取是采用含水或不含水有机溶剂作为提取溶剂对步骤(1)所述拉萨大黄根或根茎进行提取获得拉萨大黄提取液；所述有机溶剂包括含有1~4个碳原子的醇、酮、醚以及它们的混合物。

(6)后处理：后处理步骤包括回收或部分回收步骤(2)所得提取液中的有机溶剂得到提取浓缩液，所得提取浓缩液可加入或不加水，继而将提取液进行固液分离，分别收集固相和液相；固相可直接干燥或进行进一步结晶精制得到权利要求3所述拉萨大黄提取物(I)；液相经进一步吸附树脂层析纯化、分段洗脱、洗脱物浓缩或析晶可得到权利要求3所述的拉萨大黄提取物(II)及权利要求4所述拉萨大黄提取物(III)。I和II可单独使用，也可以合并使用。

步骤(1)所述前处理步骤中，所述拉萨大黄是指蓼科植物Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Haiao。所述拉萨大黄可以是野生的，也可以是人工种植的，人工引种栽培大黄的成功可以进一步扩大拉萨大黄的药源或产生更优的变种。

本发明发现，拉萨大黄根及根茎中存在高含量的二苯乙烯类化合物，随采收季节、地点以及其它因素的不同，拉萨大黄根及根茎所含二苯乙烯类化合物的总量可达5％~14％(以干重计)，此在大黄类植物中非常罕见。

此外，本发明还惊奇发现，拉萨大黄根和根茎中几乎不含蒽醌类化合物，此在大黄类植物中更为罕见，这是拉萨的一项非常重要的特征：其一，应用拉萨大黄入药不存在对蒽醌化合物潜在严重毒副作用的担忧；其二，应用拉萨大黄提取二苯乙烯类活性成分时，其提取工艺可以不受蒽醌类化合物的干扰，因此工艺可以更简便。

拉萨大黄地上茎叶中二苯乙烯类成分含量很低，作为提取原料的价值相对较低，但是仍可作为二苯乙烯类化合物的来源之一。本发明优选采用拉萨大黄的地下根和根茎作为提取原料，但不排除以其整个植株作为提取原料。

采集的拉萨大黄一般需要经过净制、切制和/或粉碎等前处理。所述净制可包括去除采集过程中附着于拉萨大黄根和根茎上的泥土等杂物，还可以包括将根和根茎与地上茎叶分开等。所采集的拉萨大黄可以应用其鲜品，也可以采用其风干、晒干或机器干燥的干品；所得此根和根茎或整个植株优选进行适当切制或粉碎以利提取。

步骤(2)所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇或乙醚。其提取溶剂优选乙醇或甲醇的水溶液；其中特别优选乙醇水溶液作为提取溶剂；进一步地，本发明优选采用50％~95％优选乙醇水溶液作为提取溶剂。

步骤(2)所得拉萨大黄提取液需经适当的后处理方可获得拉萨大黄提取物。由于拉萨大黄所含二苯乙烯类化合物水溶性有限，本发明发现，回收提取液中的有机溶剂和/或适当浓缩提取物可以使提取物所含的大部分脂溶性二苯乙烯类化合物从提取液中析出，而水溶性杂质及大部分水溶性二苯乙烯类化合物则保留在上清液中。此方法中，析出沉淀中总二苯乙烯类化合物的含量可达50％以上；水洗此沉淀可以进一步除去夹杂于沉淀的水溶性杂质和色素，从而获得二苯乙烯类化合物总含量达到70％以上的提取物。

此方法所得提取物中所含二苯乙烯类化合物主要有去氧土大黄苷、虎杖苷以及少量其它同类化合物；其中，去氧土大黄苷和虎杖苷的含量比例一般在10∶1~5∶1的范围内。

上述沉淀产物可以直接用作本发明所述拉萨大黄提取物，此即上文步骤(3)所述拉萨大黄提取物(I)。提取物I可采用醇水溶液重结晶进行进一步精制来提高去氧土大黄苷的纯度，可得权利要求8所述的去氧土大黄苷。

该后处理方法中，上清液中残留大量水溶性二苯乙烯类化合物，其总量一般可占原提取液所含此类化合物总量的50％~90％。可以采用合适的有机溶剂萃取进一步回收留存于上清液中的二苯乙烯类化合物，例如采用正丁醇、正丁醇-二氯甲烷混合溶剂萃取；此类化合物还可以采用连续逆流萃取法等本领域内熟知的方法回收。

本发明中优选采用大孔吸附树脂、聚酰胺树脂吸附层析法回收上清液中的二苯乙烯类化合物。上述后处理步骤中，随着提取液中的有机溶剂的回收，上清液上样于大孔吸附树脂柱和/或聚酰胺树脂柱时，上清液中所含的二苯乙烯类化合物易于被树脂柱床所吸附；上样吸附后，树脂柱床可采用水以及低浓度有机溶剂水溶液洗涤以进一步去除非二苯乙烯类的杂质成分，随后可采用较高及高浓度的有机溶剂水溶液分步洗脱所需的化学成分，所得洗脱溶液经浓缩、析晶、干燥即可获得上文步骤(3)所述的拉萨大黄提取物(II)和(III)。拉萨大黄提取物(II)可采用醇水溶液重结晶进行进一步精制来提高去氧土大黄苷的纯度，通过反复重结晶或其它纯化手段可得权利要求8所述的去氧土大黄苷，含有25％~45％虎杖苷的拉萨大黄提取物(III)亦可通过醇水溶液重结晶进行进一步精制或其它纯化方法来提高虎杖苷的纯度，可得所述的虎杖苷。

采用大孔树脂吸附回收上清液所含二苯乙烯类化合物时，柱床体积一般按每100ml吸附对脂(装柱后体积)吸附1~3g二苯乙烯类化合物设置，这时一般可以获得良好的吸附转移率。上清液上样吸附后，可顺次采用水、约1％~15％的乙醇或甲醇水溶液洗涤除去非二苯乙烯类化合物杂质，随后采用约40％~80％乙醇或甲醇水溶液即可洗脱吸附于大孔树脂的二苯乙烯类化合物。本发明中，优选的大孔吸附树脂为弱极性和中极性的树脂，例如商品型号D101、D1300、AB8型吸附树脂。在合适的条件下，大孔树脂吸附法可以回收上清液中所含的约75％至85％以上的二苯乙烯类化合物。大孔树脂吸附法所得产物中，二苯乙烯类化合物总含量可达约50％至85％以上。

采用聚酰胺树脂吸附回收上清液所含二苯乙烯类化合物时，柱床体积一般按每100ml吸附树脂(装柱后体积)吸附1.5~5g二苯乙烯类化合物设置，这时一般亦可以获得良好的吸附转移率。上清液上样吸附后，可顺次采用水、约30％~45％的乙醇或甲醇水溶液洗涤除去非二苯乙烯类化合物杂质，随后采用约80％~95％乙醇或甲醇水溶液即可洗脱吸附于聚酰胺树脂的二苯乙烯类化合物。在合适的条件下，聚酰胺树脂吸附法可以回收上清液中所含的约75％至85％以上的二苯乙烯类化合物。聚酰胺树脂吸附法所得产物中，二苯乙烯类化合物总含量可达约85％％至95％以上。

容易理解，由于虎杖苷的水溶性高于去氧土大黄苷，因此其沉淀产物及精制产物II(10∶1~5∶1)中去氧土大黄苷和虎杖苷的含量比例高于拉萨大黄药材原料中此两种化合物含量比例(1∶1.5~1∶2)。

上述拉萨大黄提取物(I)、(II)和(III)中，去氧土大黄苷、虎杖苷等化合物已经得到富集，采用这些提取物作为原料可以方便地制备纯品去氧土大黄苷、虎杖苷。例如，本发明中，采用拉萨大黄提取物(I)、(II)作为原料，采用反复重结晶、硅胶层析、聚酰胺层析结合重结晶法纯化可获得纯度高达90％以上的纯品去氧土大黄苷、虎杖苷。

由此本发明进一步提供拉萨大黄提取物在制备纯品去氧土大黄苷、虎杖苷中的方法，以及拉萨大黄提取物在制备纯品去氧土大黄苷、虎杖苷中的用途。

本发明发现，按本发明方法所获得的拉萨大黄提取物(I)、(II)、(III)及其混合物、以及纯品去氧土大黄苷、虎杖苷均具有良好的心血管药理学活性，部分试验中，拉萨大黄提取物(I)、(II)和拉萨大黄提取物(III)的药理学活性还强于纯品去氧土大黄苷、虎杖苷。已知二苯乙烯类化合物具有多靶点药理学活性，例如对膜电位、离子通道、酪氨酸激酶等靶体均有不同程度的药理学影响。可以理解，化学结构不同的二苯乙烯类化合物对于不同作用靶点活性作用强度应当存在差异，当这种差异存在一定互补性时，其混合物的药理学活性即可能呈现出协同作用效应，即混合物的药理学活性强度可能高于纯品化合物的药理学活性的简单加和。作为二苯乙烯类化合物混合物的拉萨大黄提取物(I~III)，其部分药理学活性强于纯品去氧土大黄苷、虎杖苷正是协同药理学作用的体现。

由此，本发明进一步提供本发明之拉萨大黄提取物在治疗药物制备中的用途。

按照常规的制剂工艺，可以将本发明之拉萨大黄提取物制备成任何一种适用于临床应用的药物制剂。如片剂，胶囊剂，丸剂，散剂，膏剂，分散剂，颗粒剂，粉针剂，水针剂等。

同样，本发明之拉萨大黄提取物也可以与其它活性成分联合使用形成新的制剂。显然，这些含有本发明所述有效部位的制剂在本发明的权利要求范围内。

本发明之拉萨大黄提取物具有较好的生物活性，在作为制备治疗心脑血管疾病的治疗药物方面有广泛的用途。所述的有效部位中活性成分的结构清楚、组成明确，有利于各级产品的质量监测和控制，符合天然产物复合制剂的发展方向和要求。另外，本发明所述有效部位的制备方法简单易行，生产成本低，可连续操作，具有极强的实用性。

附图说明：以下通过具体实施例将进一步说明本发明的内容。下文实施例仅为就本发明所述有效部位的来源、制备方法、化学组成及其用途的特殊说明，显然，本发明权利范围不受这些实施例限制。

图1为本发明薄层鉴别(用碘显色)。其中1为虎杖苷对照品液；2为有效部位I供试品液；3为去氧土大黄苷对照品液。

图2为本发明薄层鉴别(紫外灯254nm)，其中1为去氧土大黄苷对照品液；2为虎杖苷对照品液；3~5：为三批拉萨大黄药材提取物供试品液。

图3为本发明拉萨大黄原料供试品液PLC典型图谱。其中峰1为虎杖苷(RT：13.467)；峰2为去氧土大黄苷(RT：30.408)。

图4为本发明拉萨大黄提取物I供试品液HPLC典型图谱。其中峰1为虎杖苷(RT：13.601)；峰2为去氧土大黄苷(RT：30.469)。

图5为本发明拉萨大黄提取物II的HPLC典型图谱。其中峰1为虎杖苷(RT：13.559)；峰2为去氧土大黄苷(RT：30.427)。

图6为本发明拉萨大黄提取物III的PLC典型图谱。其中峰1为虎杖苷(RT：13.403)；峰2为去氧土大黄苷(RT：30.250)。

图7为本发明纯品去氧土大黄苷的HPLC典型图谱。

图8为本发明纯品虎杖苷的四LC典型图谱。

具体实施方案

实施例1：拉萨大黄及其提取物中主要化学成分的定性鉴别与定量检测

(1)样品来源

拉萨大黄根茎：收购于西藏拉萨地区，除去杂质，洗净，切成片或块，晒干。批号：050902

拉萨大黄提取物：后述实施例2所得拉萨大黄提取物I样品，批号：20050911

标准品：去氧土大黄苷，Sigma产品，纯度99％，批号LOT085F7240；虎杖苷，Sigma产品，纯度99％，批号05625HA。

(2)样品及标准品溶液配制

标准品溶液配制：精密称取以五氧化二磷真空干燥的虎杖苷或去氧土大黄苷对照品适量，以甲醇配成1mg/ml对照品储备液，稀释成25g/ml作为标准品溶液。

拉萨大黄原料供试品溶液制备：取拉萨大黄根茎(药材)干燥粉末10g，100ml 95％乙醇回流提取3次(120min/次)，合并提取液，滤纸过滤，滤液进一步以0.45μm微孔滤膜过滤，弃初滤液，取续滤液作为拉萨大黄原料供试品溶液。

拉萨大黄提取物供试品溶液制备：精密称取以五氧化二磷真空干燥的上述拉萨大黄提取物粉末适量，以甲醇配成10mg/ml样品储备液，精密吸取1ml，置于25ml容量瓶中，甲醇定容，密塞，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，弃初滤液，取续滤液作为拉萨大黄提取物供试品溶液。

(2)定性鉴别：薄层色谱法检查

本法采用硅胶薄层层析。取上述供试品液及对照品液各4  l，分别点于同一硅胶薄层层析板(硅胶G，Gf 254)板上，以甲苯∶甲醇(体积比，17∶5)为展开剂展开，取出，晾干，在紫外灯下观查或置于碘缸中显色，在对照品相同的位置，供试品应有相应的斑点。

(3)供试品所含去氧土大黄苷和虎杖苷含量定量检测：高效液相色谱法(HPLC)

色谱条件：采用Zorbax SB-C18(4.5×150mm，Agilent)反相色谱柱，50％甲醇-醋酸水为流动相，流速0.6ml/min，用DAD紫外检测仪进行检测，检测波长320nm。

标准曲线建立：上述标准品溶液分别进样4、6、8、10、12、24μl进行色谱测定，按上述色谱条件测定峰面积，以各对照品峰面积(Y，A)对进样量(X，mg)进行线性回归，回归方程：Y＝5.2632X+0.1053，r＝0.9999(虎杖苷，n＝5)，Y＝5.6497X+0.0565，r＝0.9999(去氧土大黄苷，n＝5)。

样品测定：上述拉萨大黄原料供试品溶液、拉萨大黄提取物供试品溶液各10μl分别注入液相色谱仪中，根据标准曲线计算拉萨大黄原料、拉萨大黄提取物中所含去氧土大黄苷和虎杖苷含量。

(4)供试品所含总二苯乙烯类化合物的总量检测：紫外分光光度法(UV)

原理：UV光谱中，二苯乙烯类化合物在约315～320nm左右具有最大吸收峰；拉萨大黄原料供试品溶液以及拉萨大黄提取物供试品溶液的HPLC全波长检测图谱证实，拉萨大黄所含二苯乙烯类化合物在320nm处有最大吸收；HPLC全波长扫描检测图谱还证实，拉萨大黄所含非二苯乙烯类化合物在320nm基本没有紫外吸收，根据计算，非二苯乙烯类化合物在315～320nm处的紫外吸收约占全部提取物紫外吸收的3~5％。根据同类化合物在特征最大吸收处具有近似的摩尔吸收强度的原理，本发明中以去氧土大黄苷作为标准品，采用紫外分光光度法检测供试品中二苯乙烯类化合物的总含量。

标准曲线建立：精密称取在105℃干燥至恒重的虎杖苷对照品20mg，置250ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得(每1ml中含虎杖苷0.08mg)。精密量取对照品液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml置于25ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。以乙醇为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA)，在319nm的波长处分别测定吸光度，以各对照品浓度(Y，g/ml)对吸光度(X，A)进行线性回归，回归方程：Y＝14.07X-0.4523，r＝0.9999(虎杖苷，n＝5)。

样品测定：精密称取以五氧化二磷真空干燥的上述拉萨大黄提取物粉末约150mg，置于50ml容量瓶中，甲醇定容，密塞，摇匀，精密量取1ml，置于100ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得供试品液。以甲醇为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA)，在319nm的波长处测定吸光度，从标准曲线计算虎杖苷的浓度(μg/ml)，本品按干燥品计算，含总芪以虎杖苷(C₂₀H₂₂O₈)计算，即得结果。

(5)结果：

i)定性鉴别：拉萨大黄及其提取物I的典型薄层色谱图如图1、2所示，结果表明，在对照品相同的位置，供试品均有相应的斑点。

ii)去氧土大黄苷和虎杖苷含量检测：拉萨大黄原料及其提取物I、II、III的典型HPLC谱图如图3~6所示，结果表明，拉萨大黄及其提取物中，去氧土大黄苷和虎杖苷含量分别为3.5％、1.8％；9.8％、75.9％；7.3％、69.4％及27.9％，8.0％；

iii)二苯乙烯类化合物总量检测：紫外分光光度法测定结果表明，拉萨大黄原料及其提取物I中二苯乙烯类化合物的含量分别为12.1％、88.1％、80.2％及53.4％。

实施例2：拉萨大黄提取物制备

(1)材料：

拉萨大黄根茎：收购于西藏拉萨地区，除去杂质，洗净，切成片或块，晒干。批号：050902

树脂：D101大孔吸附树脂，天津市海光化工有限公司产品，按照生产厂说明书进行预处理；80~100目聚酰胺树脂，浙江黄岩树脂化工有限公司产品，按照生产厂说明书进行预处理。

(2)制备

i)拉萨大黄前处理及其总二苯乙烯化合物含量测定：

采集的拉萨大黄植株，水洗去泥土，通风处悬挂凉干，分离地下根茎和地上茎叶，粉碎机分别将其粉碎成粗颗粒。

取地下根茎和地上茎叶各100g，分别切碎，1L 75％乙醇浸泡24小时后，装渗漉柱(φ8cm，1100cm)，75％乙醇渗漉，渗漉流速20ml/min，间隔取样行HPLC-DAD检测，直至渗漉液中基本不含二苯乙烯化合物，紫外分光光度法检测渗漉液中二苯乙烯类化合物含量，此检测结果作为药材所含二苯乙烯类化合物总量。

结果：批号050902的拉萨大黄地下根茎和地上茎叶中的所含二苯乙烯类化合物总量分别为10％和0.001％。

ii)提取：

拉萨大黄地下根茎7份，每份600g，切碎，分别以50％、75％、95％乙醇；50％、90％甲醇；50％丙酮；正丁醇作为提取溶剂提取。各份药材分别以上述不同提取溶剂0.6L回流提取3次，每次2小时。分别合并提取液，紫外分光光度法检测提取液中总二苯乙烯类化合物含量(A)，计算二苯乙烯类化合物转移率(B)：提取液二苯乙烯类化合物平均总量/药材二苯乙烯类化合物总量×100％。

提取试验结果如表1所示。

表1：不同提取溶剂的提取试验结果

提取液	50％乙醇	75％乙醇	95％乙醇	50％甲醇	90％甲醇	50％丙酮	正丁醇
								AB	56.94g94.9％	57.18g95.3％	53.82g89.7％	54.78g91.3％	56.94g94.9％	55.44g92.4％	48.72g81.2％

A：紫外分光光度法检测的提取液中总二苯乙烯类化合物量；B：二苯乙烯类化合物转移率

上述提取试验中，以50％、75％、95％醇；50％、90％甲醇；50％丙酮；正丁醇作为提取溶剂提取时，提取步骤之二苯乙烯类化合物转移率在80％~95％之间。可见它们均可作为拉萨大黄的有效提取溶剂，其中，鉴于乙醇的安全、廉价且提取转移率较高，因此本发明优选乙醇水溶液作为提取溶剂。

iii)后处理：

步骤ii)所得各提取溶液，减压(0.1~0.08Mpa，60℃)回收其中所含的有机溶剂，加水定容至600mL后，混合均匀，4℃放置24h，离心(4000rpm×30min)，得上清液和沉淀。紫外分光光度法分别取样检测上清液和沉淀中总二苯乙烯类化合物的含量。计算上清液和沉淀中的二苯乙烯类化合物转移率(C、D)：上清液或沉淀二苯乙烯类化合物总含量/提取液二苯乙烯类化合物总量×100％。

沉淀处理：各份所得沉淀，沉淀水洗(20ml×2)后，离心(4000rpm×30min)，真空干燥。计量所得终产物拉萨大黄提取物I的重量(E)，HPLC法和紫外分光光度法分别检测终产物中的去氧土大黄苷、虎杖苷以及二苯乙烯类化合物的含量(F、G、H)。

后处理及沉淀处理结果如表2所示。

表2：沉淀处理试验结果

提取溶剂	50％乙醇	75％乙醇	95％乙醇	50％甲醇	90％甲醇	50％丙酮	正丁醇
								CDEFGF+GF/GH	40.3％58.1％36.348.9％11.8％60.7％4.172.3％	17.2％84.0％26.2545.7％10.1％55.8％4.670.1％	28.4％80.8％14.475.0％9.2％84.2％8.288.4％	30.0％69.2％28.548.7％12.4％61.1％3.970.9％	37.7％66.1％15.268.9％12.3％81.2％5.686.3％	42.3％55.5％31.443.1％10.1％53.2％4.369.8％	18.9％79.5％28.742.1％10.7％52.8％3.970.1％

C：沉淀中二苯乙烯类化合物转移率；    D：上清液中二苯乙烯类化合物转移率；

E：沉淀终产物量；                    F：沉淀终产物量中去氧土大黄苷含量；

G：沉淀终产物量中虎杖苷含量；        F+G：沉淀终产物量中去氧土大黄苷与虎杖苷含量之和；

F/G：去氧土大黄苷与虎杖苷含量之比；  H：沉淀终产物量中二苯乙烯类化合物含量。

上清液处理：合并全部上清液，再次过滤，检测所得滤液中的二苯乙烯类成分含量，将其平均分成8份，分别上样于4根D101大孔吸附树脂柱(φ5.0cm，55cm，柱床体积1000ml)和4根聚酰胺树脂柱(φ5.0cm，55cm，柱床体积1000ml)。

HPLC检查D101树脂柱上样流出液，未见二苯乙烯类化合物泄漏。4根D101树脂柱分别顺次以1000ml水、10％乙醇或15％甲醇洗涤，HPLC检查洗涤流出液，流出液亦基本不含或仅含微量去氧土大黄苷与虎杖苷。D101树脂柱分别先以45％乙醇、40％甲醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥得拉萨大黄提取物III，再分别以80％乙醇，、80％甲醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，析晶，得拉萨大黄提取物II。计量所得终产物拉萨大黄提取物III、II的重量(I1、I2)，HPLC法和紫外分光光度法分别检测终产物中的去氧土大黄苷、虎杖苷以及二苯乙烯类化物含量(J、K、L)。

HPLC检查聚酰胺树脂柱上样流出液，未见二苯乙烯类化合物泄漏。4根聚酰胺树脂柱分别顺次以3000ml水、25％乙醇或30％甲醇洗涤，HPLC检查洗涤流出液，流出液亦基本不含或仅含微量去氧土大黄苷与虎杖苷。聚酰胺树脂柱分别先以80％、95％乙醇，再以80％、95％甲醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥。计量所得终产物拉萨大黄提取物III、II的重量(I1、I2)，PLC法和紫外分光光度法分别检测终产物中的去氧土大黄苷、虎杖苷以及二苯乙烯类化合物含量(J、K、L)。

表3：上清液处理试验结果

树脂柱	D101大孔吸附树脂				聚酰胺树脂
									洗涤	水→10％乙醇洗涤		水→15％甲醇洗涤		水→25％乙醇洗涤		水→35％甲醇洗涤
洗脱	45％乙醇	80％乙醇	40％甲醇	80％甲醇	80％乙醇	95％乙醇	80％甲醇	95％甲醇
									I1I2JKJ+KJ/KL	61.5g\8.0％25.1％3.1％0.351.7％	\7.2g69.1％7.3％76.4％9.582.9％	59.9\9.0％23.4％32.4％0.450.3％	\5.8g60.37.5％67.8％8.077.8％	56.5\12.0％30.0％42％0.452.1％	\10.757.2％8.0％65.2％7.172.8％	55.3\15.0％32.0％47％0.451.1％	\9.958.4％9.8％68.2％6.077.2％

I：终产物量；                          J：终产物量中去氧土大黄苷含量；

K：终产物量中虎杖苷含量；              J+K：终产物量中去氧土大黄苷与虎杖苷含量之和；

J/K：去氧土大黄苷与虎杖苷含量之比；    L：终产物量中二苯乙烯类化合物含量。

表2、表3显示，各提取液回收有机溶剂并加入适量的水后，离心所得沉淀经处理后所得产物中，其去氧土大黄苷和虎杖苷的含量分别在50％~85％之间和5％~15％之间；产物中总二苯乙烯类化合物的含量则在50％~90％之间。

离心所得上清液经大孔吸附树脂或聚酰胺树脂纯化所得产物II中，其去氧土大黄苷和虎杖苷的含量分别在50％~85％之间和5％~15％之间；纯化所得产物III中，其去氧土大黄苷和虎杖苷的含量分别在5％~15％之间和20％~45％之间；产物I和II中总二苯乙烯类化合物的含量则在50％~90％之间。

实施例3：由拉萨大黄制备纯品去氧土大黄苷和虎杖苷

(1)材料：

拉萨大黄根茎：拉萨大黄根茎，收购于西藏拉萨地区，除去杂质，洗净，切成片或块，晒干。批号：050902

(2)拉萨大黄提取物制备：

采用95％乙醇作为提取溶剂，按实施例2所述步骤制备拉萨大黄提取物(I)和拉萨大黄提取物(II)、(III)。

(3)纯化：

2g拉萨大黄提取物(I)、(II)或(III)，以40g 200目硅胶拌，采用硅胶柱层析纯化。采用氯仿/甲醇(V/V，8/1)作为洗脱溶剂，分部收集不同流份，标准品对照的薄层层析监测，分别合并与去氧土大黄苷、虎杖苷薄层色谱一致的流份，减压回收溶剂，50％乙醇重结晶，真空干燥。

(4)HPLC检测：

HPLC法检测所得去氧土大黄苷和虎杖苷的纯度，其不同流份产物中去氧土大黄苷的纯度在95％～99.9％之间；不同流份的虎杖苷产物的纯度亦在95％～99.9％之间。HPLC检测典型图谱见图7、8。

(5)去氧土大黄苷、虎杖苷结构确认

分别检测所得去氧土大黄苷、虎杖苷的UV、MS、¹H NMR、¹³CMR谱图，其检测数据如下：

去氧土大黄苷：白色针晶(甲醇)，mp.225-227℃。紫外灯下呈蓝紫色荧光。UV：λmax(MeOH)nm：217，308，319；negative FAB MS[m/z]：403[M-H]^-，227[M+H-C6H1106]^-；¹H NMR(acetone-d6)δppm：7.50(d，J＝8.0Hz)，7.11(s，J＝16.3Hz)，6.94(s，J＝16.3Hz)，6.93(d，J＝8.0Hz)，6.80(s)，6.67(s)，6.48(s)，4.83(1H，d，anomeric H)，3.76(3H，s，OCH3)，3.2-3.9(4H，m，sugar-H)；¹³C NMR(acetone-d6)δppm：140.7(C-1)，106.6(C-2)，160.2(C-3)，103.9(C-4)，159.5(C-5)，108.2(C-6)，130.9(C-1′)，128.9(C-2′，6′)，114.9(C-3′，5′)，160.5(C-4′)，126.4(C-α)，130.9(C-β)，55.6(-OCH3)，102.1(C-1″)，74.7(C-2″)，77.8(C-3″)，71.5(C-4″)，78.1(C-5″)，62.7(C-6″)。上述UV，MS，¹H NMR和¹³CNMR数据与文献(YoshikiKashiwada et al.Chem.Pharm.Bull.1984，32(9)：3501-3517)报道去氧土大黄苷一致(5-hydroxy-4′-methoxystilbene-3-O-glucopyranoside，deoxyrhaponticin)。

虎杖苷：白色针晶(30％乙醇)，UV：λmax(EtOH)：217，307，320。MS[m/z，rel.]：390[M]+，228(100)，227(12.51)，211(6.38)，181(8.87)；1H NMR(acetone-d6)δppm：8.48(1H，s)，8.40(1H，s)，7.43(2H，d，J＝8.5Hz)，7.10(1H，d，J＝16.OHz)，6.92(1H，d，J＝16.0Hz)，6.85(2H，d，J＝8.5Hz)，6.82-6.68(1H，s)，6.68(1H，s)，6.47(1H，s)，4.95(1H，d，J＝7.5Hz)，4.60(1H，d)，4.39(1H，d)，4.31(1H，d)，3.95-3.91(1H，m)，3.82(1H，t)，3.75-3.71(1H，m)，3.56-3.52(2H，m)，3.49-3.44(2H，m)；13CNMR(acetone-d6)δppm：159.4(C-4′)，158.5(C-3)，157.4(C-5)，130.0(C-1)，129.0(C-β，C-1′)，128.8(C-2′，6′)，125.6(C-α)，115.6(C-3′，5′)，107.31(C-6)，，105.7(C-2)，103.0(C-4)，101.1(C-1″)，77.2(C-5″)，，76.9(C-3 ″)，73.9(C-2″)，70.5(C-4″)，61.8(C-6″)。上述UV，MS，¹HNMR和¹³C NMR数据与文献(Fulvia Orsini.J.Nat.Prod.1997，60，1082~1087)报道虎杖苷一致(piceid)。

实施例6：拉萨大黄提取物的药理学作用

(1)试验样品

拉萨大黄提取物(I)：样品批号20040318。样品按照实施例2所述步骤制备，其中提取溶剂采用95％乙醇；样品之二苯乙烯类化合物含量为90％；其中去氧土大黄苷和虎杖苷的含量分别为70％和15％。

拉萨大黄提取物(II)：样品批号20040318。样品按照实施例2所述步骤制备，其中提取溶剂采用75％乙醇；样品为大孔树脂纯化产物，其大孔树脂洗脱溶剂为40％乙醇。样品之二苯乙烯类化合物含量为69.4％；其中去氧土大黄苷和虎杖苷的含量分别为63.8％和7.3％。

拉萨大黄提取物(III)：样品批号20040321。样品按照实施例2所述步骤制备，样品之二苯乙烯类化合物含量为93％；其中去氧土大黄苷和虎杖苷的航两分别为18％和37％。

去氧土大黄苷：样品批号20040418，样品纯度99.2％；

虎杖苷：样品批号20040411，样品纯度99.5％。

上述试验样品均以环糊精配制成不同浓度的供试溶液。

(2)试验动物

家兔，购自于昆明医学院实验动物中心，合格证号：滇实动证第2004010号。

SPF级ICR小鼠，购自于昆明医学院实验动物中心，合格证号：滇实动证第2004010号。

SPF级SD大鼠，购自于昆明医学院实验动物中心，合格证号：滇实动证第2004010号。

(3)试验方法

对家兔体动-静脉旁路血栓形成的影响  家免戊巴比妥钠30mg/kg iv麻醉，仰卧值固定，分离气管，插入气管插管后，再分离右颈总动脉和左颈外静脉，将一根长6m已称重5号丝线放入三段聚乙烯管中段中，以肝素溶剂对照溶液(50kU/L)充满聚乙烯管，聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，由聚乙烯管准确地注入肝素(50kU/L)抗凝，然后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉。另在股动脉处放置预留针头，以备取血。打开动脉夹，让血流从右颈总动脉流至聚乙烯管内，再返回左颈外静脉，开放血流15min以形成血栓，腹腔注射等体积不同剂量的受试药物。给药结束后45min，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量即为血栓湿重(mg)，将血栓置于60℃烤箱内干烤4h后称重，可计算得血栓干重(mg)。

对冠脉结扎致大鼠心肌缺血影响  动物称重后乙醚浅麻醉。沿胸骨左缘第3肋间快速开胸，剪开心包。冠状动脉前降支结扎，造成急性心肌缺血模型，4小时后取心脏，用生理盐水洗净，滤纸吸干，称全心重量，剪去心耳和右心室后称重(左心重)。然后将左心切成0.2cm厚的心肌片，置37℃、0.1％氯化硝基四氮唑蓝(N-BT)液染色。染色过程中不时摇动染色液使之与心肌充分接触。30分钟后立即用水冲去多余染料。梗死心肌不着色，非梗死心肌被染成着蓝黑色，剪去着色部分，将未着色的梗死区称重。观察给药后心肌梗死范围及其梗死比率：

梗死范围(g)：即N-BT染色未着色心肌；心肌梗死比率：梗死心肌重/左心重。

(4)试验结果

对小鼠体内血栓形成的影响

结果见表3。

表3拉萨大黄提取物对家免体内血栓形成的影响(n＝6，

)

组别	剂量	湿重(mg)	干重(mg)
				溶剂对照组拉萨大黄提取物(I)拉萨大黄提取物(II)拉萨大黄提取物(III)去氧土大黄苷虎杖苷	--10mg/kg30mg/kg10mg/kg30mg/kg10mg/kg30mg/kg10mg/kg30mg/kg10mg/kg30mg/kg	64.9±8.8750.3±3.94*42.2±6.54**56.2±7.8248.6±8.32*51.1±5.85*46.6±7.32**54.4±8.0250.8±6.86*53.7±5.63*43.6±7.23**	15.6±1.5812.1±0.94*9.51±0.59**13.5±1.5510.7±1.03*12.6±0.83*11.2±0.99**13.7±1.2112.0±1.10*12.1±0.95*9.66±0.89**

与空白对照组相比：*P＜0.05；**P＜0.01

实验结果表明，拉萨大黄提取物(I)、(II)、(III)具有近似的抑制血栓形成的活性，此与其化学组成基本一致。而拉萨大黄提取物(I)的抗血栓形成活性强于去氧土大黄苷，也略强于虎杖苷。已知二苯乙烯类化合物具有多靶点作用的生理学活性，此结果可能与拉萨大黄提取物(I)中不同化合物对不同靶点的互补性作用强度有关，即这些化合物存在着一定的协同作用。

对冠脉结扎致大鼠急性心肌梗塞范围的影响

结果见表4。

表4拉萨大黄提取物对家免体内血栓形成的影响(n＝10，

)

溶剂对照组	体重(g)	左心重(mg)	梗死区重(mg)
				264±22.1	692±91.6	127±16.8
	拉萨大黄提取物(I)
30mg/kg90mg/kg					268±24.5265±28.4	708±79.7694±98.8	90.2±15.2*72.5±12.3**
	拉萨大黄提取物(II)
30mg/kg90m/kg					272±20.6267±23.5	690±76.2686±93.2	89.8±14.8**82.4±13.0**
	拉萨大黄提取物(III)
30mg/kg90mg/kg					270±23.2266±25.8	705±86.9673±89.1	94.7±17.6*85.3±15.7**
	去氧土大黄苷
30mg/kg90mg/kg					263±21.5268±21.9	692±91.3701±93.6	96.2±14.2*88.5±16.3**
	虎杖苷
30mg/kg90mg/kg					265±22.2271±23.4	688±82.1700±98.6	91.8±15.5*77.3±16.7**

与空白对照组相比：*P＜0.05；**P＜0.01

以定量组织学N-BT染色法显示心肌梗塞范围，拉萨大黄各提取物组均有明显缩小心肌梗塞范围的作用，与溶剂对照组比较相差显著；本试验中亦可见拉萨大黄提取物所含成分的协同作用。

实施例7：拉萨大黄片剂制备

拉萨大黄提取物(I)：样品批号20040318。样品按照实施例2所述步骤制备，其中提取溶剂采用75％乙醇；样品之二苯乙烯类化合物含量为90％；其中去氧土大黄苷和虎杖苷的含量分别为70％和15％。

制法：称取拉萨大黄提取物(I)100g，溶解于适量乙醇中，加入900g PVP K29/32，混合均匀，使充分溶解；旋转蒸发使乙醇挥发，冷却，干燥，固化，粉碎固化物，取100克与50克乳糖、30克预胶化淀粉、10克羧甲基淀粉钠混合，过80目筛2遍，混合均匀，以1％低取代羟丙基纤维素乙醇溶液(浓度50％)为粘合剂制软材，过40目筛制粒，60℃干燥，过30目筛整粒，加入1.5克滑石粉混合均匀，压片，可制备拉萨大黄芪片1000片。

Claims (10)

1、一种拉萨大黄提取物，其特征在于拉萨大黄为蓼科植物Rheum lhasaense A.J.Li etP.K.Haiao，提取物是从拉萨大黄的根和/或根茎中提取，其中含有二苯乙烯类化合物去氧土大黄苷和/或虎杖苷，二苯乙烯类化合物是指其化合物结构中含有二苯乙烯结构单元的一类化合物，其化学结构通式为：

其中，R选自H、OH、OCH₃、-O-葡萄糖基、-O-取代的葡萄糖基。

2、根据权利要求1所述的拉萨大黄提取物，其特征在于拉萨大黄为野生或栽培的拉萨大黄，以重量百分比计，所述提取物中二苯乙烯类化合物总含量为50％~100％。

3、根据权利要求1或2所述的拉萨大黄提取物，其特征在于所述提取物中含有50％~85％去氧土大黄苷，5~15％虎杖苷，所述提取物中去氧土大黄苷与虎杖苷的含量比例为10∶1~5∶1。

4、权利要求3所述提取物，其特征在于，所述提取物中含有20％~45％的虎杖苷，5~15％的去氧土大黄苷，所述提取物中虎杖苷与去氧土大黄苷的含量比例为5∶1~2∶1。

5、权利要求1或2所述的拉萨大黄提取物，其特征在于，所述提取物是纯度为90％~100％的去氧土大黄苷，所述提取物是纯度为90％~100％的虎杖苷。

6、权利要求1或2所述的拉萨大黄提取物制备方法，其特征在于有效部位制备方法包括下列步骤：

(1)前处理：前处理步骤包括拉萨大黄原植物根或根茎的采集、净制和/或干燥、切碎或粉碎；

(2)提取：所述提取是采用水、含水或不含水有机溶剂作为提取溶剂对步骤(1)所述拉萨大黄根或根茎进行提取获得拉萨大黄提取液；所述有机溶剂包括含有1~4个碳原子的醇、酮、醚以及它们的混合物；

(3)后处理：后处理步骤包括回收或部分回收步骤(2)所得提取液中的有机溶剂得到提取浓缩液，所得提取浓缩液可加入或不加水，继而将提取液进行固液分离，分别收集固相和液相；固相可直接干燥或进行进一步结晶精制得到权利要求3所述拉萨大黄提取物(I)；液相经进一步吸附树脂层析纯化、分段洗脱、洗脱物浓缩析晶可得到权利要求3所述的拉萨大黄提取物(II)及权利要求4所述拉萨大黄提取物(III)；拉萨大黄提取物(I)和拉萨大黄提取物(II)可单独使用，也可以合并使用。

7、权利要求6所述的拉萨大黄提取物制备方法，其特征在于步骤(2)所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇或乙醚，其步骤(2)所述提取溶剂为50~100％的乙醇或甲醇水溶液。

8、权利要求7所述的拉萨大黄提取物制备方法，其特征在于去氧土大黄苷/虎杖苷采用拉萨大黄作为原料，通过/提取纯化步骤获得，获得的去氧土大黄苷的纯度为90％~100％，获得的虎杖苷的纯度为90％~100％。

9、一种拉萨大黄提取物在制备纯品去氧土大黄苷、虎杖苷中的用途。

10、一种拉萨大黄提取物在制备预防或治疗心脑血管疾病药物中的用途。

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