CN1484529A

CN1484529A - 治疗骨质疏松的骨碎补提取物及其提取方法

Info

Publication number: CN1484529A
Application number: CNA008201382A
Authority: CN
Inventors: 谢雁鸣
Original assignee: XIYUAN HOSPITAL CHINA CHINESE MEDICAL ACADEMY; QIHUANG PHARMACEUTICAL INVEST
Current assignee: Beijing Qihuang pharmaceutical Limited by Share Ltd
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2000-12-29
Publication date: 2004-03-24
Anticipated expiration: 2020-12-29
Also published as: CN100418521C; US20040048811A1; JP5093965B2; KR20030072577A; US7122214B2; KR100849253B1; JP2004521883A; WO2002053164A1; HK1055895A1

Abstract

一种骨碎补的提取物，其特征在于，其中总黄酮含量在30％以上，且黄酮中柚皮甙的含量在30％以上，但少于100％。所述提取物可以用于治疗骨质疏松或用于制备治疗骨质疏松的药物。所述提取物的提取方法。

Description

治疗骨质疏松的骨碎补提取物及其提取方法技术领域

本发明涉及一种骨碎补的提取物，具体说是涉及一种治疗骨盾疏松的骨碎补提取物、其制备方法以及它在治疗骨质疏松中的应用。本发明也涉及利用骨碎补的提取物治疗骨质疏松的方法。先有技术

根据文献记载，骨碎补为水龙骨科植物槲蕨 Drynaria fortune! ( Kunze ) J. Sm.或中华槲蕨（秦岭槲蕨） D. baronii ( Chist ) Diels的根茎，长久以来用于治疗骨折等疾病（《中药大辞典》， 1658 - 1660页，上海人民出版社，上海， 1979年）。马克昌等曾对骨碎补对大鼠骨质疏松症模型的影响进行了研究，实验结果提示：骨碎补浸膏有部分抑制糖皮质激素引起的骨丢失的作用（马克昌等，中医正骨， 1992， 4， 3 ) , 但其中的活性成分尚属未知。另外，周铜水等曾报道，在治疗骨损伤时，骨碎补的有效成分是柚皮甙（naringin )等（周铜水等，中草药， 1994, 25, 249 ) , 并对原药中的成分进行了含量测定（周铜水等，中国药科大学学报， 1996, 27 ( 9 ) ， 540 ) , 但对于骨碎补的上述有效成分与骨质疏松的关系并没有报道。

吴应罴等公开了一种从化州柚（ Ci trus grand is Osbeck var. tomentosa EoTt. ：)中提取柚皮甙的方法（吴应罴等，中草药， 1988, 19, 452 ) , 但其目的仅为提取柚皮甙单一成分，所采用的方法是否适用于其它药材还不可知。发明概述

本发明目的是提供一种骨碎补的提取物，该提取物可以用于治疗骨质疏松。

本发明的又一个目的是提供含有骨碎补提取物的药物组合物及其在治疗骨质疏松中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种骨碎补提取物的制备方法。本发明的再一目的是提供一种含有柚皮甙的治疗骨质疏松的药物组合物，以及利用含有柚皮甙的药物組合物治疗骨质疏松的方法。

本发明的技术方案如下：

1. 一种骨碎补的提取物，其特征在于，其中总黄酮含量在 30 %以上，且黄酮中柚皮甙的含量在 30 %以上，但少于 100 %。

2. 根据 1的提取物，其特征在于，其中总黄酮含量在 50 % 以上。

3. 根据 2的提取物，其特征在于，其中柚皮甙的含量在 90

%以下。

4. 一种药物组合物，其特征在于，其中含有根据 1 的提取物。

5. 根据 4的药物组合物，用于治疗骨质疏松。

6. 根据 1的提取物在制备用于治疗骨质疏松药物中的应用。

7. 根据 1的提取物用于治疗骨质疏松。

8. 根据 1 的提取物的制备方法，其特征在于，其中包含以下步骤：

1) 用水或醇或其混合物抽提，

2) 把提取液用树脂吸附，

3) 把吸附了提取物的树脂用水或醇或其混合物洗脱。

9. 根据 8的制备方法，其特征在于，用水进行抽提。

10. 根据 8 的制备方法，其特征在于，用醇 /水混合物进行抽提。 11. 根据 8或 10的制备方法，所述醇 /水混合物中，醇含量为 40 ~ 90 %重量。

12. 根据 8、 10或 11的制备方法，所述醇选自甲醇和乙醇。

13. 根据 12的制备方法，所述醇为乙醇。

14. 根据 13 的制备方法，其特征在于，所述树脂为大孔吸附树脂。

15. 根据 8或 14的制备方法，其特征在于，所述树脂吸附了提取液之后，先用水洗，然后用醇或醇 /水混合物洗脱。

16. 根据 15的制备方法，其特征在于，用醇 /水混合物进行抽提。

17. 根据 15或 16的制备方法，所述醇 /水混合物中，醇含量为 40 ~ 90 %重量。

18. 根据 15、 16或 17的制备方法，所述醇选自甲醇和乙醇。

19. 根据 18的制备方法，所述醇为乙醇。附图的简要说明

图 1是对照品柚皮甙的 HPLC色谱图。

图 2是柚皮甙对照品、实施例 1提取物溶液与空白溶液的 UV 光谱图。

图 3是实施例 1所得提取物的 HPLC色谙图。

图 4是比较不同工艺所得提取物溶液的薄层色谱图。

图、 5是实施例 3所得提取物的 HPLC色谱图。

图 6是实施例 4所得提取物的 HPLC色谱图。发明详述

在本发明的以下叙述中，如果没有特殊指明的话，百分含量均指重量百分比。本发明所述的骨碎补、 Rhizoma Drynariae ) 是指水龙骨科 ( Polypodiaceae S. F. Gary )槲蕨属 ( Drynaria ( Bory ) J. Sm. ) 植物 j如槲蕨 Drynaria fortune i ( Kunze ) J. Sm.、秦冷槲蕨 D. baronii ( Chist ) Diels, 中华槲蔽 . sinica Diels, 川滇槲蔽 D. delavayi Chirst, 以及 * 碎^卜科骨碎^属 ( Davallia Sm. ) 植物骨碎补 Davallia mariesii Moore ex Bak等一种或多种植物的根茎或全草。在本发明中上述作为骨碎补使用的植物可以单独或者混合使用，在本发明中对此不加限制。

经本发明人对上述植物的各种提取物的研究，现发现特定的提取物以及单体柚皮甙具有抗骨质疏松的活性。在这些具有抗骨质疏松活性的提取物中，总黄酮含量总在 30 %以上，且黄酮中柚皮甙的含量在 30 %以上。单体柚皮甙也具有抗骨质疏松活性，但其效力低于上述活性提取物。

本发明的骨碎补提取物中，总黄酮量应该在 30 % (重量）以上，优选 40 %以上，更优选 45 %以上，最优选 50 %以上。骨碎补提取物中总黄酮的含量上限没有特别限制，在 30 % ~ 100 %的范围内均具有抗骨质疏松活性。从工艺路线的选择和成本方面考虑，总黄酮的含量在 50 %以上即可较好的实现本发明的目的，如果把总黄酮的量提高到 90 %以上，不仅原料的成本要上升，而且还要增加额外的处理工序，因此总黄酮的含量最优选在 50 % - 90 %的范围内。

根据本发明人等的研究，根据本发明方法所得的骨碎补提取物中还可以含有多酚化合物。虽未发现多酚化合物对骨质疏松的明确作用，但本发明提取物这优选包含多酚化合物，因为已知多酚化合物具有抗氧化作用，含有多酚化合物有利于本提取物在制备药物中的应用。多酚的含量因提取工艺等而变化，大体在 10 ~ 50 %之间。在本发明提取物的总黄酮中，柚皮甙应不少于 30 % , 优选不少于 40 %，更优选不少于 50 % ,但总黄酮中不应该全部是柚皮甙，优选不多于 90 % , 更优选至多 80 % 。

我们提取了骨碎补的含黄酮的提取物（如上述所定义的）。通过后文实验及临床研究表明，根据本发明方法制备的骨碎补总黄酮确有较好的抗骨质疏松症效果。

虽不拘于如何理论，但本发明人认为，本发明提取物的抗骨质疏松活性不仅仅来源于柚皮甙，很可能存在其它与柚皮甙具有协同作用的成分。在本发明限定的条件下，这些成分与柚皮甙共同存在于提取物中，从而发挥抗骨质疏松活性。

以下讨论本发明骨碎补提取物的制备方法。

本发明骨碎补提取物的典型制备方法包含如下步骤：

〔药材粉碎→〕水 /醇煎煮树脂吸附→ (水洗）醇 /水洗脱"》后处理

上述方法中，药材的粉碎是本领域技术人员所熟知的常规步骤。对于粉碎的方法，本发明不加限制。粉碎后的粉末，如果粒度过粗，则有效成分难以充分提出；如果粉末过细，则会给煎煮后的分离提取液的步骤带来不利，对此，本领域技术人员可以根据实际经验加以选择，对此也不做限制。

为了提取出有效成分，可以采用水和 /或醇浸润提取的方式，但是由于有效成分的浸出不容易完全，所以采用加热抽提的方式。加热温度为室温-抽提溶剂的沸点。

加热提取时，优选在溶剂的沸点进行（回流）。

如单纯用水时， 100Ό下提取时间为 0. 5 - 3小时，提取次数 2 - 4次，每次提取加入的溶液量为生药量的 5 - 20倍。如果用醇或醇水溶液回流提取，则用量为生药量的 5 - 20倍，提取时间为 0. 5 - 3 小时，提取 2 - 4次。醇可以用甲醇和乙醇，从安全的角度等出发，优选乙醇。采用乙醇时，乙醇的浓度优逸 20 % - 90 % 。上述数量仅作为参考，实际中根据需要，本领域技术人员可以根据经验进行适当变动，应予理解，这种变化不超过本发明的范围。

获得提取液以后，根据需要可以对提取液加以过滤，然后把提取液用树脂吸附。可以用来吸附的树脂是大孔吸附树脂，例如

Dun树脂（天津南开大学树脂厂出品）、 AB- 8 树脂（天津骨胶厂出品）、 WLD树脂（四川省中药研究所出品）、 CAD - 40 (华北制药厂出品）等，但本发明方法并不受上述树脂柱型号的限制，只要是大孔吸附树脂，即可以完成本发明方法。对于树脂吸附的方法参见 CN1072089A, 该文献对树脂吸附方法进行了佯细的描述，本申请引用了文献中公开的方法，并作为本发明方法的一部分，记载在本申请文件中。

根据本发明人的研究结果，三种树树脂中以 WLD吸附容量最大，洗脱也更容易。故本提取方法优选 WLD型吸附树脂为吸附剂。吸附树脂与原药材的比例，可以在 0. 5 ~ 2: 1 (重量）之间适当选择，优选 0. 5 1. 5: 1, 最优选 1: 1左右，本领域技术人员可以根据经验适当选择。如果比例小于 0. 5: 1, 则可能吸附不完全，如果大于 1. 5: 1，则因为吸附的黄酮量不再增加，会浪费树脂，不利于成本。

在使用吸附树脂的时候，根据本领域技术人员熟悉的常识，树脂应该先进行预处理然后才能使用，预处理可以采用已知方法进行，例如可以按如下方法搡作：

将树脂装柱，先用乙醇、浓盐酸（ 1 :1 ) 冲洗，洗至流出液用等量水稀释时，不显浑浊后，改用 10倍于树脂柱体积的热水（ 80°C ) 冲洗，再用同样体积的 2 %氢氧化钠溶液沖洗，最后用水冲洗至树脂柱流出液呈中性时，再用水反冲使树脂疏松，然后将药液上柱。吸附时须控制提取液的流速，才能保证吸附完全。一般来说，工业生产时，用 360的吸附柱，内装 100kg树脂，以 10 ~ 20L/ 分钟流速进行吸附，可保证吸附完全。在此条件下，如果高于 20L/ 分钟，则难于保证吸附完全，可能降低产率。如果低于 10L/分钟，则吸附耗费时间，不利于提高生产效率。

上柱后洗脱所用的醇可以是乙醇或甲醇，从健康角度看优选乙醇，采用乙醇洗脱时，浓度优选 50 - 95 % , 从乙醇可以回收利用的角度来看，最好 70 % (因实际条件而变，也可以 ±5 % )左右。

洗脱时，醇的用量与药材的用量比例为 2倍量〜 10倍量时，用量小于 2倍时，洗脱不完全。用量超过 10倍，洗脱量不再增加，没有意义。从生产角度，优选 2 5倍量。

用醇洗脱后，收集洗脱液，回收洗脱液中的乙醇后再浓缩，最后，经喷雾干燥或冷冻干燥或直接干燥后粉碎，得到棕色或红棕色的粉末，所得粉末可以进一步精制，或直接制成适当的剂型，例如，胶嚢剂、丸剂、片剂、颗粒剂、溶液剂或注射剂等。

喷雾干燥前应先将残留液浓缩至相对密度为 1. 10-1. 18，然后喷雾干燥。真空干燥时应先将残留液浓缩至相对密度为 1. 3- 1. 4, 然后真空干燥，干燥后为进一步处理方便，可粉碎成细粉。喷雾干燥和真空千燥是常规的干燥技术，实施这一步骤并不困难，本发明对此不加限制。

如上所述本发明的提取物，可以按照常规的制剂工艺，制备成任何适用于临床使用的药物剂型，例如，胶嚢剂、丸剂、片剂、颗粒剂，溶液剂或注射剂等。其中各剂型所含提取物的量依据剂型组成、所治疗患者的状况、临床使用条件等而有所不同。大体来说，当提取物中总黄酮含量以 50 %计时，患者每天给药 0. 1 ~ 5 克，分 1 ~ 4次服用。

本发明的提取物具有良好的治疗骨质疏松症的作用。以下举出实施例、制剂例和试验例进一步说明本发明的有益效果。实施例

提取物中的黄酮以四氢硼钾显色反应定性判断。洗脱终点以薄层色谱法确定。用紫外吸光光度法对总黄酮定量。用高效液相色谱法（HPLC) 对柚皮甙定量。

四氢硼钟显色反应：用小试管接取测试液约 5ml，加入四氢硼钾约 5mg, 摇勾，加盐酸数滴，呈櫻红色或紫红色表示存在二氢黄酮类化合物，灵敏度为 55 g/ml。如不显櫻红色或紫红色，则为阴性反应。

薄层色谱法：取柚皮甙对照品，加甲醇制成每 ml 含 0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。照中国药典 1995版附录 VI B之薄层色谱法试验，吸取对照溶液和待测溶液各 4μί, 分别点于同一硅胶 G薄层板上，以苯-醋酸乙酯 -甲酸-水（ 1:12:2.5:3) 的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯（ 365nm)下检视。待测溶液的色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

紫外分光光度法对总黄酮进行含量测定：

按照中国药典 1995年版一部紫外分光光度法（附录 VA) 测定。

对照溶液的制备精密称取 105 干燥至恒重的橙皮甙对照品 10mg，置 100ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度（每 lml 含橙皮甙 0. lmg) 。

标准曲线的制备精密量取对照品溶液 0.50、 1.00、 2.00、 4.00、 5.00ml, 分别置 25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。以甲醇为空白，照紫外分光光度法（附录 VA)试验，在 284±lnm 的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

供试品溶液的制备取待测样品约 0. 25g, 精密称定，置锥形瓶中，加甲醇 50ml, 超声提取 30分钟，冷却，转移至 100ml 量瓶中，用甲醇洗涤锥形瓶，洗涤液合并到量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇勾。滤过，收集续滤液，精密量取滤液 lml，加入已装有 0. 5g聚酰胺（过 60 目筛，甲醇湿法装柱）的层析柱上，用甲醇洗脱，控制流速约为每分钟 0. 4ml, 收集洗脱液约 25ml置 100ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法按药典附录 VA 紫外分光光度法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中总黄酮浓度，计算，即得。

仪器与试剂：紫外分光光度计， UV - 260 型（日本岛津制作所），橙皮甙标准品，中国药品生物制品检定所。用 HPLC对柚皮甙进行含量测定

按照中国药典 1995年版一部高效液相色谱法（附录 VI D ) 进行测定。

色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇- 36 % 醋酸-水（ 35 : 4 : 65 ) 为流动相；检测波长 283nm。理论塔板数按柚皮甙峰计算，应不低于 3000。

对照品溶液的制备取在 110Ό干燥至恒重的柚皮甙对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，并稀释，制成每 lml含柚皮甙 50 g 的溶液，作为对照品溶渡。

供试品溶液的制备取本品约 0. 2g, 精密称定，置 150ml锥形瓶中，加入甲醇 60ml，超声提取 30分钟，取出放冷至室温，转移至 100ml量瓶中，并用甲醇洗涤锥形瓶，洗涤液并入量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，收集续滤液，精密吸取续滤液 2ml置 25ml量瓶中，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。测定法精密吸取对照溶液和供试品溶液各 ΙΟμΙ,注入高效液相色谱仪测定，即得。

仪器与试剂日本岛津 LC- 6Α高效液相色谱仪， SPD- 6AV 紫外检测器； C- R4A数据处理机，记录仪灵敏度 0.16AUFS; 色谱柱： Shimpack CLC - 0DS ( 150 6. Ommi. d. , 5μπι ) , 保护柱：自填国产 YWG C18 ( 10 χ4.6nmii. d.， ΙΟμιη ) ；上海医用分析仪器厂 TGL- 16G台式高速离心机；上海必能信超声有限公司 SB 3200型超声波清洗器。

柚皮甙对照品为中国药品生物制品检定所提供，在上述的色谱条件下，用归一化法计算本对照品柚皮甙含量〉 98%, 见图 1。在本实验条件下，柚皮甙的峰出现在保留时间约 15.26分处。

试验中所用试药、试剂均为分析纯，水为双重蒸镏水。实施例 1

称取 100克骨碎补，粉碎成粗粉，用水 1500ml煮沸 1小时，放出药液，残渣再加 1000ml水煮沸，放出药液。两次药液合并，滤过，药液流经装有经处理的 120 克 WLD 吸附树脂的吸附柱 ( 30) ，流速 4ml/分，流出液用四氢硼钾反应判断收集终点，即以流出液突然出现双氢黄酮类化合物反应-树脂已达饱和吸附为止。吸附完毕，用 500ml水洗涤树脂柱，洗液弃去，再用 400ml 70%乙醇洗脱，以四氢硼钾显色反应判断收接洗脱液的起点和终点。回收洗脱液，洗脱液回收乙醇，残留液于水浴上蒸至稠膏，真空干燥，得骨碎补提取物 1.88克。所得样品用紫外分光光度法测其总黄酮含量，总黄酮含量 55.08%, HPLC方法测定柚皮甙含量 36.6% (占总黄酮的 66.4% ) 。

图 2所得提取物、柚皮甙以及空白溶液的紫外光谱。图 2中，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。 1为柚皮甙对照品， 2为本提取物， 3为空白。由紫外光谱可见，本提取物与柚皮甙有很大不同，本提取物在 200多 nm处有一吸收峰，而柚皮甙在此仅有一肩峰。在最大吸收波长上，二者也有不同。

图 3为本提取物的 HPLC 色谱图。图中横坐标为保留时间、纵坐标为积分强度。由图可见本提取物中除柚皮甙外还至少含有另外一种化合物。实施例 2

除回流溶剂和洗脱溶剂均采用 70 %乙醇溶液以外，按照实施例 1方法操作，得提取物 1. 69克，总黄酮含量 53. 12 % , HPLC方法测定柚皮甙含量 32. 5 % (占总黄酮的 61. 2 % ) 。

图 4是几种不同工艺所得提取溶液的薄层色谱的比较。其中由左向右分别为：实施例 1的水煮提取液实施例 1，实施例 1的提取物，本实施例的提取液，本实施例的提取物，柚皮甙，由图可见，无论用水或醇提取，所得产物基本相同。实施例 3

除吸附树脂采用 AB-8树脂外，采用实施例 1相同方法操作，得到 0. 95克提取物，总黄酮含量 61. 80 %。图 5是实施例 3所得提取物的 HPLC色谱图。实施例 4

除吸附树脂采用 Dun树脂外，采用实施例 1相同方法搡作，得到 1. 07克提取物，总黄酮含量 57. 35 %。图 6是实施例 4所得提取物的 HPLC色谱图。

由上述图 3、图 5和图 6可见，采用不同种类的吸附树脂，所得的提取物中黄酮化合物的组成和含量比例基本一致。实施例 5

除骨碎补粉末量为 10克，吸附树脂量分别为 5克、 10克、 20克、 25克以外，按照实施例 1方法分别得到提取物 0.16克、 0.20克、 0.27克、 0.27克，总黄酮含量分别为 53.88 %、 52.29 %、 42.65%、 41.88%, 总黄酮收量分别为 86.2mg、 104.6mg、 115.2mg、 113. lmg, 总黄酮收率分别为 0.86 %、 1.05%、 1.15%、 1.13%。可见当药材量：吸附树脂量多于 1:2以后，对于等量药材其吸附总黄酮量几乎不再增加，说明吸附树脂量为药材量的 2 倍时，吸附已经完全。但当药材量：吸附树脂量为 1:1 时，其吸附物总黄酮含量较高，而总黄酮得量已达完全吸附量的 90.8%, 产品中总黄酮含量达 52.29%，故综合考虑在生产中，药材量：吸附树脂量为 1:1时较宜。实施例 6

用 4 根装填已处理好的 WLD 大孔吸附树脂 10g 的玻璃柱 ( Φ=20 ) , 将骨碎补药材粗粉 40g, 加 lOOOmL水煎煮一小时（微沸），滤过。滤液等分成 4份，每份各通过上述一根玻璃柱，控制流速分别为 2mlVniin、 4mL/min, 8mL/min ^ 16mL/min, 并用四氢硼钾反应检查废液中有无黄酮甙，结果如表 1。表 1

流速 (ml/min) 效果废液中双氢黄酮

2 吸附完全 -

4 吸附完全 -

8 . 吸附不完全 +

16 吸附不完全 + 从上表看出，吸附流速须控制，才能保证吸附完全。实施例 7

取骨碎补药材粗粉 300g, 按实施例 1方法获得滤液，滤液等分成三份，分别上柱（Φ=40，内装 WLD树脂 100g ) , 分别用不同浓度乙醇洗脱，收集的洗脱液经浓缩、干燥，用紫外分光光度法测定其总黄酮量，结果见表 2。表 2

由上表数据可见，乙醇浓度对洗脱效果有影响，其中 70 %乙醇洗脱效果较好。实施例 8

骨碎补药材粗粉 500g按实施例 1相同方法制得滤液，滤液上吸附柱（药材量：吸附树脂量为 1: 1 ) , 吸附完毕后，分别用 1 倍量、 2倍量、 3倍量、 5倍量、 7倍量、 10倍量的 70 %乙醇洗脱，分别收集洗脱液，回收乙醇，所得样品分别测其总黄酮含量，结果用 10倍量乙醇时，可达完全洗脱效果，各段洗脱黄酮量见表 3。表 3

表 3结果表明，当用足够量（ 10倍）乙醇进行洗脱时，能将黄酮类成分完全洗脱下来。当乙醇用量为药材量 5倍量时，其总黄酮量达整个总黄酮量的 98 % 。制剂例 1胶嚢剂

取 180g按照实施例 1方法制得的本发明提取物粉，加入淀粉 70g, 混匀，充入胶嚢，得到 1000粒本发明提取物的胶嚢（每粒含有效成分 180mg ) 。制剂例 2片剂

取 180g按照实施例 1方法制得的本发明提取物粉，与 70g淀粉混和，然后加入少量羧甲基纤维素钠的水溶液捏和制软材，按照常规方法制粒、干燥，加入少量硬脂酸镁，混合，打片。得到 1000片本发明提取物的片剂（每片含有效成分 180ing ) 。制剂例 3注射剂

取 180g按照实施例 1方法所得的本发明提取物，加入 800ml 注射用蒸馏水，加热使全溶，用微孔滤膜过滤，滤液置水箱（4 °C - 8"C )中放置 24小时，再次用微孔滤膜过滤，用医用盐酸（ 12N ) 和 NaOH水溶液（ 12N )调节 pH (为 6. 5 ) 和渗透压至等渗，加注射用蒸馏水至 1000ml, 加热灭菌，过滤，分装于安瓿中，每支 5ml (含有效成分 180mg ) 。实验例 1 本发明提取物治疗原发性骨盾疏松症的临床研究若非另外说明，本实验所用药物具有如下剂量和含量：本发明提取物：制剂例 1胶嚢，每粒含有效成分 0. 18g。阳性对照药： ot - D₃ (由以色列梯瓦制药工业有限公司生产，中美合资昆明贝克诺顿制药有限公司分装） , 每粒含有效成分 0. 5 g。

西医诊断标准原发性骨质疏松症综合诊断评分方法，参照中国老年医学会骨质疏松委员会制定的诊断标准（参见刘忠厚主编，《骨质疏松症〔M〕》第 1版，广州，化学工业出版社， 1992， 169 - 171 ) 。

共观察按上述标准诊断为原发性骨质疏松症患者 70例。采用随机对照试验方法平均分为治疗组和对照组，治疗与对照组病例数之比为 1 : 1。治疗组口服本发明提取物，每次 1粒，每日 3次。早、中、晚餐后温开水送服。对照组口服 a - D₃，每次 1粒，每日 2次。疗程均为 3个月，连续服用 2个疗程。

骨密度检查用双能 X线骨密度测量仪（美国 Lunar公司 DPX - L型双能 X线骨密度测量仪），检查部位为腰推（L₂ ~ L₄ ) 、股骨上端（股骨颈、股骨三角区、股骨粗隆），单位： g/cm²。超声波骨密度仪（以色列 METRA公司 2000 - SYS - 220型超声波骨密度仪），检查部位为胫骨中段。

两组骨密度治疗前后变化比较：

1. 两组腰推骨密度治疗前后变化比较见表 4。两组治疗前后腰推（L₂ ~ L₄ ) 骨密度变化

( X士 s, 单位 g/cm² )

由表 4可见，治疗后 3个月和 6个月治疗组腰推骨密度均有所增加，但治疗前后自身比较、 Ρ〉0. 05, 无显著性差异。对照组治疗后腰推骨密度未见改善。组间比较无显著性差异。

2. 两组股骨密度治疗前后变化比较见表 5。两组治疗前后股骨颈骨密度变化

( x±s，单位 g/ cm² )

与疗 Jt , *P<0. 05, **P<0. 01. 由表 5可见，疗后 3个月及疗后 6个月，治疗组股骨颈骨密度升高， Ρ<0. 01或 0. 05。对照组治疗后 3个月、 6个月骨密度有所升高，但经统计学处理，无显著性差异。

3. 两组股骨三角区骨密度治疗前后变化比较见表 6。两组治疗前后股骨三角区骨密度变化

( X土 s，单位 g/cm² )

与疗前 t匕较， *P<0. 05 , **p<0. 01；与对,照 ^E Jt^, *p<0. 05. 由表 6可见，治疗后 3个月及 6个月，治疗组股骨三角区骨密度升高， P〈0. 05或 0. 01; 对照组治疗 3个月，骨密度有升高，但 P〉0. 05; 治疗后 6个月，治疗组与对照组比较， P〈0. 05。

4. 两组股骨粗隆骨密度治疗前后变化比较见表 7。两组治疗前后股骨粗隆骨密度变化

( X土 s , 单位 g/cm² )

与疗前比较， **Ρ〈0. 01; 与对照组比较， **Ρ〈0. 01。由表 7可见，治疗后 3个月，治疗組与对照組股骨粗隆骨密度均有所升高，但 Ρ>0. 05; 治疗后 6个月，治疗组股骨粗隆骨密度升高， Ρ〈0. 01; 组间比较， Ρ〈0. 01, 治疗组优于对照组。

2. 4. 4 两组超声波骨密度测量治疗前后变化比较见表 8。两组治疗前后超声波骨密度变化（x±s, 单位 g/

与治疗前比较， *Ρ<0. 05, **Ρ〈0. 01 ; 与对照组比较， ' Ρ<0. 05. 由表 8可见，治疗组治疗后骨密度（超声波）与年轻成人比较的差值（ Young Adult )、与同龄人比较的差值（ Age Mached ) 、超声速度（ Speed Sound )均有所提高，治疗前后自身比较， P<0. 01；对照组治疗后 Speed Sound有所改善，治疗前后自身比较， P<0. 05。实验例 2 骨碎补提取物对大鼠骨质疏松症模型的实验研究

分别建立因给予维甲酸和去势引起的大鼠骨质疏松症模型，观察本发明的骨碎补提取物的作用。

【材料与方法】

1.药物

骨碎补提取物系根据实施例 1 方法所得，每克提取物相当于生药 66. 67g。使用时加蒸馏水配制成 0. 47mg/ml溶液灌胃。造模用维甲酸由重庆华邦制药有限公司生产，加蒸镏水配成 1. 5%混悬液。阳性对照药 a - D₃由以色列梯瓦制药工业有限公司生产，使用时加蒸馏水配制成 0. 03μ₈/ιη1溶液灌胃。 2.动物

维甲酸模型： Wistar 大鼠 60 只，雌性 16 周龄，体重 234. 85±15. 32g。去势模型： Wistar大鼠 60 只，雌性 12周龄，体重 183. 46±12. 45g。均自军事医学科学院实验动物中心。

3.试剂及仪器

骨生物力学流变仪由英国 Stevens公司生产，型号 QTS- 25。双能 X线骨密度测量仪由美国 Norland公司生产，型号 XR-26。其它试剂和仪器均为市售。

5.剂量选择及分组

( 1 ) 维甲酸组：采用随机法将 60只大鼠分为 6组。每组 10 只。空白组：每天给予等量的生理盐水；模型组：维甲酸 70mg/kg/d; a - D₃组：维甲酸 70mg/kg/d + α - D₃ 0. 002 g/kg/d；骨碎补提取物小剂量组：维甲酸 70mg/kg/d + 骨碎补提取物 54mg/kg/d ; 骨碎补提取物中剂量组：维甲酸 70mg/kg/d + 骨碎补提取物 108mg /kg/d ; 骨碎补提取物大剂量组：维甲酸 70mg/kg/d + 骨碎补提取物 216mg/kg/d。

( 2 )去势组：采用随机法将 60只大鼠分为 6组，每组 10只。除空白组不切除卵巢外，其它各組均切除双侧卵巢。模型組不给药， α - D₃组灌胃剂量 0. 002 g/kg/d, 提取物小剂量组灌胃剂量 54mg/kg/d, 中剂量组灌胃剂量 108mg/kg/d, 大剂量组灌胃剂量 216mg/kg/d。

6.实验方法

实验过程中每周称重一次，根据体重调整给药量。

维甲酸组：空白组在整个实验过程中均给予等量生理盐水，其余各组于实验第 1天至第 14天均予维甲酸灌胃， 14天后各组停用维甲酸，空白对照组、模型組给予等量生理盐水，第 15天， a - D₃组加服 a - D₃, 骨碎补提取物各剂量组分别加服相应剂量的骨碎补提取物。 14天后各组停用维甲酸，空白对照組、模型组给予等量生理盐水，其他各组处理措施不变，第 29天动物处死，进行骨密度、骨生物力学检查。

去势组：空白组及模型组给与等体积的蒸馏水灌胃， a - D₃ 组、骨碎补提取物各剂量组按上述剂量灌胃给药。 12周后，处死动物，进行骨密度、骨生物力学检查。

7.观察指标

7. 1.骨密度测定每组大鼠取第 2-4腰推及右侧股骨，检测骨密度。

7. 2.骨生物力学测定各组大鼠分离出左侧股骨，去除附着软组织及近侧端关节软骨，进行三点弯曲试验，记录载荷 -变形曲线测定骨生物力学指标。实验参数：跨距 20mm, 加载速度 10mm/min„ 骨结构力学特性参数：最大载荷、弹性载荷、最大桡度、弹性桡度，最大能量吸收；骨材料力学特性参数：首先计算股骨断面截面惯性矩，然后根据公式计算如下指标：最大应变、弹性应变、最大应力、弹性应力、弹性模量。

【结果】

1.各组大鼠骨密度变化情况，见表 9和表 10:

表 9维甲酸模型大鼠骨密度变化（X±S)

由表 9、 10 可知，骨碎补提取物各剂量组及 ct- D₃ 组与模型组比较，有明显升高股骨密度的作用；骨碎补提取物各剂量组升高股骨骨密度的程度与 a- D₃ 组比较有明显差异。 2.各组大鼠生物力学指标变化情况

2. 1.对骨结构力学指标的影响，见表 11、 12。

维甲酸模型大鼠骨结构力学指标变化（ X ±S )

o

+1

表 12去势模型大鼠结构力学指标变化（ X ±S) 組别例数最大载荷 (N) 最大桡度弹性载荷弹性桡度最大能量吸收

(N) (mm) (N - mm²) 空白组 10 118. 3+12. 40 1. 11+0. 05 96. 2±6. 00 0. 93±0. 05 575. 09±138. 50 模型組 10 76. 8±25. 00 0. 68±0. 01 62. 5±2. 50 0. 48±0. 07 425. 25+86. 10 a - - 1)₃组 10 102. 1±2. 90 0. 96±0. 10 88. 6+12. 7 0. 84+0. 06 520. 48±108. 44 提小剂量組 10 97. 0±6. 50 0. 71±0. 10 72. 1+7. 80 0. 67+0. 09 498. 55+162. 80 取中剂量组 10 110. 4±10. 20 0. 92±0. 06 91. 6±6. 70 0. 85+0. 06 543. 65+100. 78 物大剂量组 10 134. 3+9. 50 99. 4+4. 60 0. 93±0. 05 532. 37±110. 83 由上表 11、 12可知，骨碎补提取物和 a - D₃组与模型组比较升高最大载荷、最大桡度、最大能量吸收值、弹性载荷、弹性桡度有显著差异。骨碎补提取物升高最大载荷、最大桡度、最大能量吸收值、弹性载荷、弹性挠度的水平与 a - D₃ 组比较有显著差异。且中药各剂量组有一定的量效关系。

2. 2. 对骨材料力学指标的影响，见表 13、 14。

维甲酸模型大鼠骨材料力学指标变化（X±S) 组别例数最大应力弹性应力最大应变弹性应变刚性系数

(N/mm²) (N/mm²) (N/mm²) 空白组 10 309. 3+102. 8 233. 2±48. 5 0. 04+0. 009 0. 04±0. 013 41301+1359 模型組 10 1 22. 24+54. 8 70. 9 ±20. 5 0. 02±0. 004 0. 01+0. 004 14436±2648 a - D₃组 10 167. 2+44. 5 177. 6+51. 3 0. 03±0. 009 0. 03±0. 01 30561+9194 提小剂量组 10 1.01. 8+3. 1 79. 9+21. 1 0. 04+0. 004 0. 02±0. 005 14958±2347 取中剂量組 10 236. 1±59. 2 217. 5+79. 2 0. 03±0. 004 0. 03±0. 011 24919±2616 物大剂量组 10 307. 9±7. 9 333. 9±27. 1 0. 04±0. 001 0. 04±0. 007 36893±3704

表 14 去势大鼠骨材料力学指标的变化（X ±S)

由上表 13、 14可知，骨碎补提取物具有升高模型大鼠骨最大应力、弹性应力、最大应变、弹性应变、刚性系数值的作用，且与 a - D₃组比较有显著差异。

由上述测试结果可见，骨碎补提取物能提高单位骨组织体积的骨量；能增加骨组织的承载力，提高骨骼抵抗外力冲击的能力，对骨结构力学特性有一定的改善作用；对骨的几何形状及内在材料特性有一定的改善作用。工业实用， I·生

本发明的骨碎补提取物能够提高骨质疏松症患者的骨密度，可明显抑制骨吸收，减少骨量的丢失，从而治疗骨质疏松症。

Claims

权利要求

1. 一种骨碎补的提取物，其特征在于，其中总黄酮含量在 30 %以上，且黄酮中柚皮戒的含量在 30 %以上，但少于 100 %。
2. 根据权利要求 1的提取物，其特征在于，其中总黄酮含量在 50 %以上。
3. 根据权利要求 2的提取物，其特征在于，其中柚皮甙的含量在 90 %以下。
4. 一种药物组合物，其特征在于，其中含有根据权利要求 1 的提取物。
5. 根据权利要求 4的药物组合物，用于治疗骨质疏松。
6. 根据权利要求 1的提取物在制备用于治疗骨质疏松药物中的应用。
7. 根据权利要求 1的提取物用于治疗骨质疏松。
8. 根据权利要求 1的提取物的制备方法，其特征在于，其中包含以下步骤：

1) 用水或醇或其混合物抽提，

2) 把提取液用树脂吸附，

3) 把吸附了提取物的树脂用水或醇或其混合物洗脱。
9. 根据权利要求 8的制备方法，其特征在于，用水进行抽提。
10. 根据权利要求 8的制备方法，其特征在于，用醇 /水混合物进行抽提。
11. 根据权利要求 8或 10的制备方法，所述醇 /水混合物中，醇含量为 40 ~ 90 %重量。
12. 根据权利要求 8、 10或 11的制备方法，所述醇选自甲醇和乙醇。
13. 根据权利要求 12的制备方法，所述醇为乙醇。
14. 根据权利要求 13的制备方法，其特征在于，所述树脂为大孔吸附树脂。
15. 根据权利要求 8或 14的制备方法，其特征在于，所述树脂吸附了提取液之后，先用水洗，然后用醇或醇 /水混合物洗脱。
16. 根据权利要求 15的制备方法，其特征在于，用醇 /水混合物进行抽提。
17. 根据权利要求 15或 16的制备方法，所述醇 /水混合物中，醇含量为 40 ~ 90 %重量。
18. 根据权利要求 15、 16或 17的制备方法，所述醇选自甲醇和乙醇。
19. 根据权利要求 18的制备方法，所述醇为乙醇。