KR100849253B1 - 골다공증의 치료를 위한 골쇄보 추출물 및 그 추출방법 - Google Patents

골다공증의 치료를 위한 골쇄보 추출물 및 그 추출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 골쇄보(Rhizoma Drynariae)추출물 (이하 "RDE")을 제공하는 것이며, RDE는 골다공증의 치료에 유용하다.
다른 목적은 RDE를 포함하는 조성물을 제공하고, 이를 골다공증의 치료에 이용하는 것이다.
또 다른 목적은 RDE의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 골다공증의 치료를 위해 나린진(naringin)을 포함하는 조성물 및 그 조성물로 골다공증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
Figure R1020037008536
골쇄보, 골다공증, 나린진

Description

골다공증의 치료를 위한 골쇄보 추출물 및 그 추출방법 {DRYNARIA EXTRACTIONS FOR TREATING OSTEOPOROSIS AND THEIR EXTRACTION PROCESS}
본 발명은 골쇄보(Rhizoma Drynariae) 추출물(이하 "RDE")에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로, 골다공증의 치료를 위한 RDE, 그 제조방법 및 골다공증 치료에의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 추출물로 골다공증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
골쇄보(Rhizoma Drynariae)는 Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm 또는 D. baronii(Chist)Diels의 뿌리이며, 오랜동안 뼈골절의 치료에 사용되어 왔다( Zhong Yao Da Ci Dian (중국 전통 의학 용어( Lexicon of Traditional Chinese Medicine )), 1658~1660, 북경 인민일보, 북경, 1979). Ma Ke-Chang 등은 골쇄보(Rhizoma Drynariae)가 쥐의 골다공증 모델에 미치는 영향을 연구하였으며, 그 결과 RDE가 특히 글루코코르티코이드 유도 골손실(glucocorticoid-induced bone loss)을 억제함이 밝혀졌으나(Ma Ke-Chang 등, Zhong Yi Zheng Gu (골 경화(Bone Setting) 1992, 4, 3), 그 활성 성분은 알려져 있지 않다. 또한, Zhou Tong-Shui 등은 골손상의 치료를 위한 골쇄보(Rhizoma Drynariae)의 유효 성분은 나린진(naringin)과 그 유사체임을 보고하였다(Zhou Tong-Shui 등, Zhong Cao Yao (중국 약초 의약 (Chinese Herbal Medicine) 1994, 25, 249). 그리고 이들은 또한 골쇄보(Rhizoma Drynariae) 식물을 분석하였으나(Zhou Tong-Shui 등, Zhong Guo Yao Ke Da Xue Xue Bao (중국 약학 대학의 간행물 (Journal of China Pharmaceutical University), 1996, 27, (9), 540), 상기의 활성 성분과 골다공증에 대한 그 효능과의 관계를 밝히지 못하였다.
Wu Ying-Pi 등은 단일 성분의 나린진을 얻기 위해 당유자나무(Citrus grandis Osbeck var. tomentosa Hort)에서 나린진을 추출하는 방법을 밝혔다(Wu Ying-Pi 등, Zhong Cao Yao , 1988, 19, 452). 따라서, 그러한 방법이 다른 의약 물질에 적합할 수 있는지 여부는 알려지지 않았다.
본 발명의 목적은 골쇄보(Rhizoma Drynariae)추출물 (이하 "RDE")을 제공하는 것이며, RDE는 골다공증의 치료에 유용하다.
다른 목적은 RDE를 포함하는 조성물을 제공하고, 이를 골다공증의 치료에 이용하는 것이다.
또 다른 목적은 RDE의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 골다공증의 치료를 위해 나린진을 포함하는 조성물 및 그 조성물로 골다공증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 기술적인 실시예는 다음과 같다:
1. 총 플라보노이드의 함량이 추출물의 중량 기준으로, 30% 이상이고, 총 플라보노이드중의 나린진의 함량이 총 플라보노이드의 중량 기준으로, 30% 이상 100% 미만인 골쇄보 추출물.
2. 제 1에 있어서, 총 플라보노이드의 함량이 50% 이상인 것을 특징으로 하는 추출물.
3. 제 2에 있어서, 나린진의 함량이 90% 이하인 것을 특징으로 하는 추출물.
4. 제 1에 따른 추출물을 포함하는 약제학적 조성물.
5. 제 4에 있어서, 골다공증의 치료에 사용되는 조성물.
6. 골다공증의 치료를 위한 약제의 제조에 사용되는 제 1에 따른 추출물.
7. 골다공증의 치료에 사용되는 제 1에 따른 추출물.
8. 다음의 단계들을 포함하는 제 1에 따른 추출물의 제조 방법:
1) 물, 알콜, 또는 그 혼합물로 골쇄보를 추출하는 단계;
2) 수지를 이용하여 추출물을 흡착하는 단계; 및
3) 물, 알콜, 또는 그 혼합물로 추출물이 흡착된 수지를 용출시키는 단계.
9. 제 8에 있어서, 물로써 추출을 행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
10. 제 8에 있어서, 알콜/물의 혼합물로써 추출을 행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
11. 제 8 또는 제 10에 있어서, 알콜/물의 혼합물내의 알콜 함량이 40~90%(중량%)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
12. 제 8, 제 10 또는 제 11에 있어서, 알콜은 메탄올 및 에탄올로부터 선택 되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
13. 제 12에 있어서, 알콜은 에탄올인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
14. 제 13에 있어서, 수지는 큰세공 흡착 수지인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
15. 제 8 또는 제 14에 있어서, 추출물의 흡착 후 알콜 또는 알콜/물의 혼합물로 용출하기 전에, 상기 수지를 물로 세정하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
16. 제 15에 있어서, 용출은 알콜/물의 혼합물로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
17. 제 15 또는 제 16에 있어서, 알콜 함량이 알콜/물의 혼합물의 40~90%(w/w)인 제조 방법.
18. 제 15, 제 16 또는 제 17에 있어서, 알콜은 메탄올 및 에탄올로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
19. 제 18에 있어서, 알콜은 에탄올인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
본 발명의 다음 설명에서, 퍼센트(%)는 특별히 언급된 바 없으면 중량%를 의미한다.
본 발명에서, 골쇄보(Rhizoma Drynariae)는 Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm, D. baronii(Chist)Diels, D.sinica Diels 및 D.delavayi Chirst 등, 또는 Davallia Sm 종 유래의 Davallia mariesii Moore ex Bak와 같은 Drynaria (Bory)J.Sm, Polypodiaceae S.F.Gary 종의 뿌리 또는 식물 전체이다.
본 발명에서, 골쇄보(Rhizoma Drynariae)로 사용되는 식물은 상기의 종 하나 또는 여러 종의 혼합일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명자들은 철저한 조사를 수행하여, 골쇄보(Rhizoma Drynariae)에서의 특수 추출물 또는 단일 화합물인 나린진이 골다공증 개선 활성을 가짐을 발견하였다. 골다공증에 저항하는 활성을 가지는 추출물 중에, 총 플라보노이드의 함량은 항상 30% 보다 많고, 플라보노이드중의 나린진의 함량은 항상 30% 보다 많다. 나린진 화합물 자체 또한 골다공증 개선 활성을 가지지만, 그 효능은 상기의 활성 추출물보다 낮다.
본 발명에서, RDE에 함유된 총 플라보노이드는 30%(중량%) 이상이며, 바람직하게는 40% 이상, 좀 더 바람직하게는 45% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 50% 이상이다. 비록 총 플라보노이드 함량에 대한 특별한 상한은 없지만(이는 상기 추출물에서 30% ~ 100%에 이를 수 있음), 제조 방법과 비용과의 균형을 고려하면, 총 플라보노이드 함량이 50% 이상인 한, 본 발명의 목적은 충분히 성취될 수 있다. 만약 그 함량이 90% 이상이라면, 비용이 높을 뿐 아니라, 기타의 과정이 필요하다. 따라서 가장 바람직한 총 플라보노이드 함량은 50% ~ 90% 범위이다.
본 발명의 방법에 따르면, 본 발명의 RDE는 또한 폴리페놀 화합물을 포함한다. 비록 폴리페놀 화합물이 골다공증에 저항한다는 증거는 없지만, 본 발명의 추출물은 바람직하게는 폴리페놀을 함유할 수 있으며 폴리페놀이 항산화 활성이 있으므로, 약제학적 제제의 사용에 있어 폴리페놀 화합물이 본 발명의 추출물에 도움이 될 수 있다. 폴리페놀 함량은 방법에 따라 다를 수 있으나, 그 함량은 보통 10% ~ 50% 범위내이다.
본 발명에서, 총 플라보노이드에 대한 나린진의 함량은 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 좀 더 바람직하게는 50% 이상이지만, 나린진이 총 플라보노이드의 100% 여서는 안되며, 바람직하게는 90% 이하, 좀 더 바람직하게는 80% 이하여야 한다.
본 발명자들은 플라보노이드를 함유하는 RDE(상기에서 정의한 바와 같음)를 추출하였다. 실험 결과 및 임상 시험은 본 발명의 방법에 의해 생산된 RDE가 골다공증에 신뢰할만한 효과가 있음을 나타낸다.
비록 알려진 이론에 의해 증명되지는 않았으나, 본 발명의 추출물의 항골다공증 활성이 나린진에 근거할 뿐만 아니라, 나린진과 함께 상승효과를 가질지도 모르는 다른 화합물에도 근거함이 타당하다. 본 발명의 제한하에서, 이러한 성분은 나린진과 함께 존재하며 항골다공증 활성을 보여준다.
RDE의 생산 방법은 다음과 같다.
전형적인 제조 방법은 다음의 단계를 포함한다:
[생약 분쇄] →물/알콜로 달임(decoction) →수지(resin) 흡착 →(물세정) →알콜/물로 용출 …후가공
상기 과정중, 골쇄보(Rhizoma Drynariae)를 분쇄하는 수단은 당업자에게 보편화된 방법이며 특별한 제한은 없다. 만약 분말의 입상이 너무 거칠면, 유효 성분이 충분히 추출될 수 없다; 만약 입상이 너무 정교하면 달임후에 추출된 용액의 분리가 어려울 수 있다. 이것은 당업자의 경험에 의해 쉽게 결정될 수 있고 특별한 제한은 없다.
효능있는 성분을 추출하기 위해, 물 및/또는 알콜에 의한 침지추출이 채택될 수 있다. 그러나 효능 성분이 완전히 추출되지 않을 수 있으므로, 열 추출이 바람직하고, 가열 온도는 상온에서부터 추출 용매의 끓는점까지의 범위로 할 수 있다.
열 추출 온도는 추출 용매(환류액(reflux))의 끓는점에서 행하는 것이 바람직하다.
생약이 물로만 추출되는 경우에는, 그 추출은 100℃에서 0.5 ~ 3 시간동안 2 ~ 4번 반복 수행되며, 물의 부피는 매번 생약 중량의 5 ~ 20배이다. 추출이 환류 온도에서 알콜 또는 알콜 수용액으로 수행되는 경우에는, 생약은 0.5 ~ 3 시간동안 2 ~ 4번 반복 수행되며, 용매의 부피는 매번 생약 중량의 5 ~ 20배이다. 알콜은 메탄올 또는 에탄올이며, 에탄올이 안전성면에서 좀 더 바람직하다. 이경우, 에탄올의 농도는 20 ~ 90% 범위가 바람직하다. 그리고 상기의 모든 데이터는 단지 참조용이다. 당업자의 경험에 기초하여 변형가능하며, 이러한 변형은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해되어야 한다.
바람직하게는, 우선 획득한 추출물은 여과시키고, 다음으로 수지(resin)로 흡착시키며, 이 수지는 D101 수지(천진의 남개대학 레진공장 제조), AB-8 수지(천진 골-겔(Bone-gel) 공장 제조), WLD 수지(사천지방의 중국 전통 의학 연구소 제조) 및 CAD-40 수지(화북 제약 제조) 등과 같은 큰세공 흡착 수지(macropore adsorption resin)를 사용한다. 본 발명의 방법은 수지 모델에 한정되지 않는다. 수지 흡착에 관한 상세한 설명은 CN1072089A에 설명되어 있으며, 본 발명에서 참조되었고, 본 발명의 일부로 포함되었다.
본 발명자들의 연구에 의하면, WLD 수지는 상기 수지들 중에 가장 높은 흡착력을 가지며, 용출되기가 훨씬 쉽다. 그래서 흡착제로써 WLD 수지의 사용이 선호된다. 생약에 대한 수지 양의 비율은 0.5 ~ 2 : 1 (w/w), 바람직하게는 0.5 ~ 1.5 : 1, 가장 바람직하게는 약 1: 1 의 범위이며, 이는 당업자에 의해 잘 결정될 수 있다. 만약 그 비율이 0.5 : 1 보다 작으면, 흡착이 불완전할 수 있다. 만약 그 비율이 1.5 : 1 보다 크면, 흡착된 플라보노이드(flavonoid)가 더 많이 증가하지 않을것이며, 경제적인 단점이 생길 수 있다.
흡착 수지를 사용하는 동안, 당업자에게 잘 알려진 바에 따르면, 수지가 사용전에 알려진 방법에 따라 사전 처리되어야 하며, 예를 들면 다음과 같은 사전 처리가 가능하다.
칼럼(column)에 수지를 충진(packing)시킨다,
상기 칼럼을 용리액(eluent)과 같은 부피의 물로 희석하여 깨끗해질때까지 에탄올-농축 HCl (1 : 1)로 세정한다,
상기 칼럼을 수지 칼럼의 10배 부피의 뜨거운 물(약 80℃)로 세정한다,
상기 칼럼을 수지 칼럼과 같은 부피의 2% 수산화나트륨(sodium hydroxide)으로 세정한다,
마지막으로 상기 칼럼을 용출액이 중성이 될때까지 물로 세정한다.
그다음, 상기 수지는 느슨해질때까지 물로 역세정(reverse-rinse)하고, 그 용액을 용출되도록 업로드(upload)한다.
흡착동안, 유속(flow-rate)은 완벽한 흡착이 보장되도록 조절되어야 한다. 일반적으로, 공업적 제조시에는, 100kg의 수지로 충진된 칼럼(직경 360mm)이 사용되는 반면, 그 흡착은 유속을 10 ~ 20 L/min로 적용한다면, 완전히 보장될 수 있다. 그러한 경우에, 유속이 20 L/min 보다 크면, 완전히 흡착되기 어렵고 수율이 낮아질 수 있다; 만약 10 L/min 보다 작으면, 생산성 증가에 단점이 될 수 있다.
흡착후에, 수지는 에탄올 또는 메탄올과 같은 알콜로 용출될 수 있고, 에탄올이 건강의 관점에서 바람직하다. 에탄올 사용시, 그 농도는 50 ~ 95% 가 바람직하고, 에탄올의 재사용면에서 70%(±약 5%)가 가장 바람직하다.
용출시, 생약에 대한 알콜양의 비율은 2 ~ 10의 범위이다. 만약 그 비율이 2보다 작으면, 용출은 불완전하며, 10 보다 크면, 그 용출 성분들이 더이상 증가하지 않고, 경제적으로 바람직하지 않다. 제조면에서는, 2 ~ 5배가 바람직하다.
용출후에, 그 용리액(eluent)은 모아서 재사용을 위해 에탄올을 제거한 후 농축시킨다. 마지막으로, 갈색 또는 적갈색 분말은 분말 건조(spray-drying), 동결건조(lyophilizing) 또는 정상 건조 및 정상 분쇄에 의해 얻어질 수 있다. 상기 분말은 정제(refine)되거나 캡슐, 알약, 정제, 과립, 용액 또는 주사와 같은 적당한 제제내로 직접 채워질 수 있다.
잔류물의 상대적 밀도는 분말 건조전에 1.10 ~ 1.18로 조절되며, 진공 건조(vacuum drying)전에는 1.3 ~ 1.4로 조절된다. 건조 후에, 그 결과물은 미세 분말로 분쇄되어 앞으로의 과정을 가능케 한다. 분말 건조 및 진공 건조는 건조를 위한 통상의 기술이고, 제한은 없다.
본 발명의 상기 RDE는 보통의 제조 과정으로 캡슐, 알약, 정제, 과립, 용액 또는 주사와 같은 임상적 사용에 적당한 약제학적 제제로 제조될 수 있다. 각 타입의 제제 투약은 처방의 조성, 환자의 상태, 임상적 조건에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, RDE내에 총 플라보노이드 함량이 50%일 경우, 구강 투여량은 환자당 1 ~ 4 회분으로 0.1 ~ 5.0g/day 로 한다.
본 발명의 RDE는 골다공증을 개선시키는 활성이 뛰어나다. 다음의 실시예는 본 발명을 설명하는 데에 제공되며, 이에 한정되지는 않는다.
도 1은 대조군으로서 나린진 표준시약의 HPLC 크로마토그래피를 나타낸다.
도 2는 나린진 표준시약, 실시예 1의 추출물 용액, 바탕 용액(blank solution)의 UV 분광분석도(spectrograph)를 나타낸다.
도 3은 실시예 1의 추출물의 HPLC 크로마토그래피를 나타낸다.
도 4는 다른 방법으로 추출한 용액의 TLC 크로마토그래피를 나타낸다.
도 5는 실시예 3의 추출물의 HPLC 크로마토그래피를 나타낸다.
도 6은 실시예 4의 추출물의 HPLC 크로마토그래피를 나타낸다.
RDE내 플라보노이드는 붕화수소 칼륨(potassium borohydride(KBH4)) 색반응에 의해 정성이 가능하다. 그리고 용출 종결은 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 측정한다. 그리고 UV 분광기가 총 플라보노이드의 정량 분석에 이용된다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 나린진을 정량적으로 분석하는데 이용된다.
붕화수소 칼륨(Potassium borohydride) 색반응: KBH4 (약 5mg)를 샘플 용액 약 5㎖가 들어있는 시험관에 첨가하여 흔들고, 여기에 몇 방울의 염산을 첨가한다. 체리색(cherry red) 또는 자홍색은 디하이드로플라보논(dihydroflavonone)(감도 55㎍/ml)이 존재함을 나타낸다. 체리색(cherry red) 또는 자홍색이 나타나지 않으면 존재하지 않음을 나타낸다.
TLC: 메탄올에 용해된 나린진 표준시약 0.5mg/ml은 대조 용액(control solution)으로 사용된다. Pharmacopoeia Sinica (1995) appendix Ⅵ B 에 따른 TLC 방법에 기초하여, 대조 용액과 시험 용액을 각각 4㎕씩 실리카 겔-G 판(silica gel-G plate)에 적용하고, 그 다음 상층의 벤젠-에틸 아세테이트-포름산-물(1:12:2.5:3) 혼합물로 용출시킨다. 용출 후, 상기 판을 떼어서 말리고, 알루미늄 클로라이드(AlCl3) 용액으로 스프레이하고, 마지막으로 365nm의 UV하에서 측정한다. 시험 샘플은 판의 대응하는 위치에 있는 대조 용액과 같은 색의 형광 얼룩을 나타낸다.
총 플라보노이드의 UV 분광기 정량 분석:
이 분석은 Pharmacopoeia Sinica (1995) appendix ⅤA 에 따른 UV 분광학적 방법에 기초한다.
대조 용액의 제조: 105℃에서 일정 중량까지 건조된 10mg의 헤스페리딘 표준시약(Hesperidin standard)은 정확히 무게를 달아서 부피 플라스크(volumetric flask)(100ml)에서 메탄올(100ml)에 녹인다.(최종 농도: 0.1mg/ml)
표준 곡선: 표준 용액 0.50ml, 1.00ml, 2.00ml, 4.00ml, 그리고 5.00ml를 정확히 피펫팅하고, 각각 최종 25ml의 부피가 되도록 메탄올로 희석한다. 메탄올은 바탕 용액으로 사용된다. UV 측정은 appendix ⅤA 에 따라 수행되며, 흡광도는 284±1nm 에서 측정한다. 측정 곡선은 X 축에 농도를, Y 축에 흡광도를 나타낸다.
샘플 용액 제조: 정확하게 잰 시험 샘플(0.25g)을 원뿔 플라스크(conical flask)에서 메탄올(50ml)에 녹여 초음파로 30분동안 추출하고, 식힌 후 부피 플라스크(100ml)에 옮긴다. 그리고 원뿔 플라스크는 메탄올로 세정하고 그 세정액을 부피 플라스크에 옮긴다. 그리고 그 용액은 메탄올로 100ml까지 희석한 후 여과한다. 그 여과액을 모아서 정확히 1ml 부피를 크로마토그래피 칼럼에 적용한다(고체상으로서 60메쉬의 체를 통과한 0.5g의 폴리아미드로 충진됨). 그 다음 상기 칼럼을 약 0.4ml/min의 유속으로 메탄올로 희석시킨다. 약 25ml의 용리액을 모아 메탄올로 100ml까지 희석시킨다.
측정: Pharmacopoeia Sinica (1995) appendix ⅤA 에 따른 UV 분광학적 방법에 기초하여, 샘플 용액의 흡광도를 측정하고, 표준 곡선으로부터 총 플라보노이드 농도를 읽는다.
기기 및 시약: UV 분광기, 모델 UV-260 (시마쯔(shimazu)사, 일본), 헤스페리딘 표준시약(Hesperidin standard)(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products)
HPLC에 의한 나린진 측정
본 시험은 Pharmacopoeia Sinica (1995) appendix Ⅵ D 의 HPLC 방법이다.
크로마토그래프 조건: C-18-알킬실란 결합형 실리카 겔이 고체상으로 사용되고, 메탄올-(36% 아세트산)-물(35:4:65) 혼합물이 유동상으로 사용되며, 283nm에서 파장을 측정한다. 이론단의 수는 나린진의 피크(peak)로부터 계산되고, 3000보다 작아서는 안된다.
대조 용액의 제조: 105℃에서 일정 중량까지 건조된 나린진 표준시약은 정확히 무게를 달아서 메탄올에 녹이고, 메탄올로 최종 농도 50㎍/ml이 되도록 희석시킨다.
샘플 용액의 제조: 정확하게 잰 시험 샘플(0.2g)을 원뿔 플라스크(150ml)에 옮기고 메탄올 60ml를 첨가한다. 초음파 추출을 30분동안 행한 후, 그 용액을 꺼내서 상온에서 식힌다. 그 다음, 이 샘플 용액을 부피 병(volumetric bottle)(100ml)에 옮긴다. 원뿔 플라스크를 메탄올로 세정하고, 이 메탄올은 상기 부피 병내의 내용물에 합해진다. 획득한 용액은 메탄올로 100ml까지 희석하고, 균질하게 흔든 후 여과시킨다. 본 여과액을 모으고, 2ml의 여과액을 정확히 피펫팅하여 25ml의 부피 병에 옮기고, 샘플 용액을 얻기 위한 부피까지 메탄올로 희석한다.
측정: 대조 용액(10㎕) 및 샘플 용액(10㎕)을 각각 분석을 위해, HPLC 시스템에 주입한다.
기기 및 시약: HPLC: LC-6A (시마쯔(shimazu)사, 일본); UV 측정기: SPD-6AV; 데이터 프로세서 (C-R4A), 데이터 기록기의 감도 0.16AUFS; 크로마토그래프 칼럼: 심팩(Shimpack) C18 칼럼(OLC-ODS 150×6.0mm i.d., 5㎛); 보호 칼럼: YMG C18 칼럼 (10×4.6mm i.d., 10㎛); 초원심분리: TGL-16G (상하이 의학 분석 기구 공장); 초음파 클리너: SB 3200 (상하이 Bi'nengxin 초음파 주식회사)
나린진 표준시약은 National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products 에서 얻는다. 상기의 스펙트럼 조건하에서, 본 표준시약에 포함된 나린진은 표준화된 방법에 의해 98% 보다 많은 것으로 계산된다(도 1 참조). 본 실험 조건하에서, 나린진의 피크는 약 15.26분의 체류 시간(retention time)에 나타난다.
본 실시예에서 사용된 모든 시약 및 용매는 분석적으로 퓨어 그레이드(pure grade)이다. 물은 2차 증류하였다.
실시예 1
100g의 골쇄보(Rhizoma Drynariae)를 분쇄하여 물 1500ml로 1시간 동안 달였다. 그 추출액을 취하고 물 1000ml을 첨가하여 다시 달였다. 상기 달인 용액은 모아서 여과하였다. 이 여과액은 120g의 WLD 수지로 충진된 사전 처리된 칼럼(직경 30mm)에 유속 4ml/min으로 적용하고, 용출 분획의 종결점은 KBH4 색반응에 의해 결정하였다. 즉, 디하이드로플라보논(dihydroflavonone)의 갑작스런 출현은 용출-수지(effluent-resin)에의 흡착이 포화되었음을 의미한다. 흡착후에, 본 칼럼은 500ml의 물로 세정하고 이 세정액은 재사용하지 않았다. 용출은 400ml의 70% 에탄올로 수행하였다. 용출의 출발 및 종결점은 KBH4 색테스트에 의해 결정되고, 용출액은 모으고 에탄올은 재사용하였다. 잔류물은 걸쭉한 반죽을 얻기위해 중탕조에서 증발시키고, 그 다음 진공에서 건조시켜 1.88g의 추출물을 얻었다. 따라서 획득한 RDE는 UV 분광기에 의해 측정한 바로는 총 플라보노이드 함량이 55.08% 였고, HPLC로 측정한 바로는 나린진 함량이 36.6% 였다(즉, 총 플라보노이드의 66.4%).
도 2는 RDE, 나린진, 바탕 용액의 UV 스펙트럼을 나타낸다(X 축: 파장; Y 축: 흡광도; 1: 나린진 표준 시약; 2: 본 발명의 추출물; 3: 바탕 용액). UV 스펙트럼으로부터, RDE와 나린진의 큰 차이점을 관찰할 수 있다. RDE는 약 200nm에서 흡수 피크가 나타나고, 반면 나린진은 그 파장에서는 낮은 피크만 나타난다. 그리고 최고 흡수 파장에서 또한 차이가 있다.
도 3은 추출물의 HPLC를 나타내고, 추출물에는 적어도 1개 이상의 다른 미지의 화합물이 존재한다.(X 축: 체류 시간; Y 축: 총 강도).
실시예 2
70% 에탄올이 환류 및 용출 용매로 사용되는 외에 실시예 1과 같은 방법으 로 하여, 1.69g의 추출물을 획득하고, 총 플라보노이드 함량은 53.12%이며, 나린진은 HPLC에 의해 32.5%로 측정되었다(총 플라보노이드의 61.2%).
다른 과정에 의해 추출된 몇몇 추출 용액을 TLC로 비교한 결과는 도 4에 나타내었고, 왼쪽에서부터 오른쪽으로 차례로 추출 용매 및 실시예 1의 추출물, 추출 용매 및 본 실시예의 추출물 및 나린진이다. 그 결과, 추출물은 물 또는 알콜에 의해 추출된 것과 실질적으로 같았다.
실시예 3
AB-8 수지가 WLD 수지 대신 사용되는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 하여, 0.95g의 추출물을 얻었고, 총 플라보노이드 함량은 61.80%였다. 도 5는 실시예 3의 추출물의 HPLC를 나타낸다.
실시예 4
D101 수지가 WLD 수지 대신 사용되는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 하여, 1.07g의 추출물을 얻었고, 총 플라보노이드 함량은 57.35%였다. 도 6은 실시예 4의 추출물의 HPLC를 나타낸다.
비록 다른 타입의 수지가 흡착제로 사용되어도, 추출물에 포함된 플라보노이드의 조성 및 함량 비율은 일반적으로 같다는 것을 도 3, 4 및 5로부터 알 수 있다.
실시예 5
10g의 골쇄보(Rhizoma Drynariae) 분말을 매번 사용하고, 5g, 10g, 20g, 25g의 수지가 각각 사용되는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 하여, 각각 0.16g, 0.20g, 0.27g 및 0.27g의 추출물을 얻었고, 이때 총 플라보노이드 함량은 각각 53.88%, 52.29%, 42.65%, 41.88%였다. 총 플라보노이드 수득량은 각각 86.2mg, 104.6mg, 115.2mg, 113.1mg이며, 총 플라보노이드 비율은 각각 0.86%, 1.05%, 1.15% 및 1.13%였다. 상기 데이터는, 같은 양의 생약으로부터 추출된 총 플라보노이드는 수지에 대한 생약의 중량 비율이 1:2 보다 클때 거의 증가하지 않음을 나타내며, 이는 수지가 생약의 양의 2배일때 흡착이 완전하다는 것을 의미한다. 수지에 대한 생약의 중량 비율이 1:1 일때, 흡착된 총 플라보노이드가 비교적 많다: 상기 추출물은 총 흡착물의 90.8%를 차지하며, 이때 총 플라보노이드 함량은 52.29%이다. 따라서, 생약:수지의 비율이 1:1 일때가 바람직하다.
실시예 6
40g의 분쇄화된 골쇄보(Rhizoma Drynariae)를 1000ml의 물에서 1시간동안 약한불에서 달이고, 이것을 여과하여 평균 4분획으로 나누었다. 4개의 유리 칼럼(직경 20mm)을 사전처리한 WLD 큰세공 흡착 수지(macropore adsorption resin) 10g으로 충진시켰다. 달인 각 분획을 각각 2ml/min, 4ml/min, 8ml/min 및 16ml/min의 유속으로 같은 칼럼에 적용하고, 그 용출액내에 플라보노이드 글리코사이드가 존재하 는지를 시험하기 위하여 KBH4 색반응을 수행하였다. 결과는 표 1에 나타내었다.
표 1
유속 (ml/min) 결과 용출액내 플라보노이드
2 완전히 흡착됨 -
4 완전히 흡착됨 -
8 불완전히 흡착됨 +
16 불완전히 흡착됨 +
유속을 조절함으로써 완전히 흡착시킬 수 있다고 결론지을 수 있다.
실시예 7
300g의 분쇄화시킨 골쇄보(Rhizoma Drynariae)를 실시예 1과 같은 방법으로 처리하여 여과액을 얻었다. 이 여과액을 평균 3분획으로 나누어 각각 칼럼(직경 40mm, 100g의 WLD 수지 충진)에 적용하고, 다른 농도의 에탄올로 용출시켰다. 본 용출액을 농축 및 건조시켰으며, 이때 총 플라보노이드 함량은 UV 분광기로 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.




표 2
Figure 112003022382419-pct00001
에탄올 농도는 용출 결과에 영향을 미치며, 약 70%의 농도가 바람직하다고 결론지을 수 있다.
실시예 8
500g의 분쇄화시킨 골쇄보(Rhizoma Drynariae) 분말을 실시예 1과 같은 방법으로 처리하여 여과액을 얻고, 이것을 칼럼(생약:수지의 중량 비율은 1:1)에 적용하였다. 흡착후에, 본 수지를 70% 에탄올로 생약의 양(v/w)의 1ｘ, 2ｘ, 3ｘ, 5ｘ, 7ｘ 및 10ｘ 부피로 용출시키고, 용리액은 따로 모으고, 에탄올은 재사용하였다. 그 다음 총 플라보노이드는 별도로 측정하였다. 그 결과, 10배의 에탄올로 용출할때 그 용출이 완전함을 알 수 있고, 이를 표 3에 나타내었다.



표 3
70% 에탄올
1ｘ 2ｘ 3ｘ 5ｘ 7ｘ 10ｘ
흡착제(%) 0.47 8.76 1.99 0.47 0.44 0.22
플라보노이드(%) 0.21 53.11 64.26 51.42 24.87 6.72
플라보노이드(mg) 0.987 4652.436 1278.774 241.674 109.428 14.784
총 플라보노이드 퍼센트(%) 0.016 73.871 20.304 3.837 1.737 0.235
표 3의 결과는 충분한 양의 에탄올(10배)로 용출시킬 때, 총 플라보노이드가 완전히 용출될 수 있음을 보여준다. 에탄올의 양이 RD의 5배일 때, 용출된 총 플라보노이드는 총 플라보노이드의 98%에 이른다.
제조예 1, 캡슐(capsule)
실시예 1과 같은 방법으로 얻어진 180g의 RDE 분말에, 70g의 녹말을 첨가하였다. 이 두성분을 잘 혼합하여 1000개의 캡슐에 채웠다. 각 캡슐은 180mg의 유효 성분을 포함한다.
제조예 2, 정제(tablet)
실시예와 같은 방법으로 얻어진 180g의 RDE 분말에, 70g의 녹말을 첨가하였다. 그 다음, 본 혼합물을 적은 양의 수성 CMC-Na로 반죽하고 환약으로 만들어 보통의 방법에 따라 건조시킨 후, 여기에 적은 양의 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate)를 첨가하고 잘 혼합하여 1000개의 정제를 제조 하였다. 각 정제는 180mg의 유효 성분을 포함한다.
제조예 3, 주사 제제(injectable formulation)
실시예와 같은 방법으로 얻어진 180g의 RDE 분말에, 800ml의 주사 가능한 증류수를 첨가하였다. 그 혼합물을 가열하여 녹인 후, 미세공의 여과막으로 여과하고, 4℃ ~ 8℃에서 24시간 동안 저장하고, 다시 여과하여, 의학 등급(medical grade)의 염산 용액(12N) 및 수산화 나트륨 용액(12N)으로 pH 6.5 및 등장액으로 맞춘 후, 주사 가능한 증류수를 첨가하여 1000ml이 되게 하고, 가열 멸균 및 여과를 하고, 앰풀(ampoul)(앰풀당 5ml)로 분획하였다. 각 앰풀은 180㎎의 유효 성분을 포함한다.
시험예 1. 초기 골다공증에 대한 본 발명의 RDE의 임상 시험
추가적인 설명이 없으면 다음의 투여량 및 함량을 가지는 약이 사용된다.
본 발명에 있어서의 추출물: 제조예 1의 캡슐, 각 캡슐은 0.18g의 유효 성분을 포함한다. 양성 대조 의약(positive control medicine): α-D3, (TEVA PHARMACEUTICALS사(이스라엘)에 의해 합성, Sino-US Kunming BARKER NORTON PHARMACEUTICAL사에 의해 제조), 각 캡슐은 0.5㎍의 유효 성분을 함유한다.
진단 표준: 노인병학 중국 협회의 골다공증 특수 위원회(Specialized Committee of Osteoporosis of Chinese Association of Geriatrics)에 의해 확립된 진단 표준에 따른 초기 골다공증에 대한 종합 진단 등급(Comprehensive Diagnostic Grades for Primary Osteoporosis).(참조. Gu-zhi-shu-song-zheng[M], p169~171, LIU Zhonghou eds. Chemical Industrial Press, Guangzhou, 1992)
상기의 진단 표준에 따라서, 70 가지의 골다공증을 무작위로 RDE로 처리한 치료군과 α-D3로 처리한 대조군으로 나눈다. RDE는 1일 3회 180mg을 경구 투여하고, 6달동안 2주기의 치료를 행한다. 그리고 α-D3는 1일 2회 0.5㎍을 6달동안 경구투여한다.
허리(L2-L4) 및 상부-대퇴골(경부 대퇴골, 대퇴골의 삼각대, 대퇴골의 돌기)의 골밀도는 각각 2중-에너지 X-레이 골 밀도 측정기(Double-Energy X-ray Bone Density Meter)(LUNAR DPX-L DEXA 골 밀도 측정기, 미국)에 의해 측정하였다. 단위는 g/㎠ 이다. 그리고 초음파 골 밀도 측정기(Ultrasonic Bone Densitometer)(모델 2000-SYS-220, 메트라(METRA)사, 이스라엘)를 이용하여 중간부의 경부 골 밀도를 측정하였다.
2 그룹에서 치료전 및 치료후의 골밀도를 비교:
1. 표 4는 치료전 및 치료후 허리(L2-L4)의 골 밀도 결과를 나타낸다:
Figure 112003022382419-pct00002

치료군을 3개월 또는 6개월 치료한 결과, 골 밀도가 증가하였으나, 중요한 차이는 없다(P＞0.05). 대조군에서는 개선이 없다. 또한 두 그룹사이에 중요한 차이는 없다.
2. 표 5는 치료전 및 치료후, 경부 대퇴골의 골 밀도 결과를 나타낸다:
Figure 112003022382419-pct00003

치료군에서 치료전 및 치료후를 비교한 결과, 경부 대퇴골의 골 밀도가 상당히 증가하였다(P＜0.05, P＜0.01). 그러나, 대조군 그룹내에서는 중요한 차이가 없 었다.
3. 표 6은 치료전 및 치료후, 대퇴골의 삼각대의 골 밀도 결과를 나타낸다:
Figure 112003022382419-pct00004
치료군에서 치료전 및 치료후를 비교한 결과, 대퇴골의 삼각대의 골 밀도가 상당히 증가하였다(P＜0.05, P＜0.01). 대퇴골의 삼각대의 골 밀도는 중요한 차이없이 치료 3개월 후에 증가하였다(P＞0.05). 그리고 또한 치료 6개월 후에 치료군과 대조군 사이에는 차이가 있다(P＜0.05).
4. 표 7은 치료전 및 치료후, 대퇴골 돌기의 골 밀도 결과를 나타낸다:
Figure 112003022382419-pct00005
치료군내에서 치료전 및 치료 6개월 후간에는 상당한 차이가 있다(P＜0.01). 그리고 또한 치료 6개월 후에 치료군과 대조군간에도 중요한 차이가 있다(P＜0.01).
5. 표 8은 2 그룹에서의 치료전 및 치료후, 초음파 골 밀도 결과를 나타낸다:
Figure 112003022382419-pct00006
치료군과 젊은 성인 및 노인군 사이의 골 밀도(초음파 측정) 차이값이 상당히 증가하였다(P＜0.01). 그리고 치료군(P＜0.01) 및 대조군(P＜0.05)내에서의 자체비교결과, 건강해지는 속도가 상당히 증가하였다.
시험예 2, 쥐의 골다공증 모델에 있어 RDE의 실험적 연구
쥐의 트레티노인(tretinoin) 유도 및 난소절제된(OVX) 골다공증 모델에서, 본 발명의 RDE의 효과를 관찰한다.
[시약 및 방법]
1. 의약
RDE는 실시예 1에 따라 제조되었다(단위 그램 추출물은 66.67g의 생약과 등가이다). 투약전에 RDE는 증류수에 녹여서 0.47mg/ml의 농도로 맞추었다. 그리고 투약은 위관을 통해서 행한다. 트레티노인은 Chongqing Huabang Pharmaceuticals, Ltd. 제품이며, 증류수에 1.5% 농도로 현탁하였다. 대조 시약인 α-D3 은 TEVA PHARMACEUTICALS(이스라엘)사 제품이며, 사용하기 전에 증류수에 녹여서 0.03㎍/ml의 농도로 하고, 소화관으로 경구 투여하였다.
2. 동물
트레티노인 유도 골다공증 쥐: 60마리의 암컷 위스터 쥐(Wister rat), 나이 16주, 평균 몸무게 234.85±15.32g. 난소절제된(OVX) 쥐: 60마리의 암컷 위스터 쥐(Wister rat), 나이 12주, 평균 몸무게 183.46±12.45g. 모든 동물은 중국 국방 의학 협회의 실험 동물 센터에서 구입한다.
3. 시약 및 기기
골 신체역학 유량계(Bone Biomechanics Rheometer)는 스티븐스사(Stevens Company)(영국,모델 QTS-25) 제품이다. X 선 골-밀도-측정기(X-ray Bone-density-meter)는 놀랜드사(Norland Company)(미국,모델 XR-26) 제품이었다. 그 외는 모두 시판되는 것을 구입하였다.
4. 투여량 선택 및 그룹
(1) 트레티노인 유도 그룹: 60마리의 쥐를 무작위로 6개의 그룹으로 나누었다(그룹당 10마리). 대조 그룹: 대조군 동물은 생리 식염수(PSS/d)만을 투여하였다. 모델 그룹: 트레티노인은 70mg/kg/day씩 경구투여한다; α-D3 그룹: 트레티노인 및 α-D3 는 모두 각각 70mg/kg/day 및 0.002 ㎍/kg/day씩 경구투여한다; RDE 저투여량 그룹: 트레티노인 및 RDE는 각각 70mg/kg/day 및 54mg/kg/day씩 경구투여한다; RDE 중투여량 그룹: 트레티노인 70mg/kg/day 및 RDE 108mg/kg/day; RDE 고투여량 그룹: 트레티노인 70mg/kg/day 및 RDE 216mg/kg/day.
(2) 난소절제된(OVX) 쥐 그룹: 60마리의 쥐를 무작위로 6개의 그룹으로 나누었다(그룹당 10마리). 대조군 동물은 정상 쥐이다. 그 외의 모든 그룹은 양 난소를 제거하였다. 모델 그룹은 단지 생리 식염수(PSS)만을 투여하였다; α-D3 그룹: α-D3는 0.002 ㎍/kg/day씩 경구투여한다; 그리고 RDE는 난소절제된(OVX) 쥐에 각각 54, 108, 216 mg/kg/day씩 경구투여하고, 이는 RDE 그룹의 저투여량, 중투여량, 고투여량에 대응된다.
5. 방법:
각 동물에 투여된 양은 매주말에 각 몸무게로부터 계산한다.
트레티노인 유도 골다공증 그룹: 대조군은 실험동안 생리 식염수(PSS)를 투여하였다. 그 외 그룹은 같은 날(지정 연구일 제1일) 치료를 시작하였고, 14일 동안 매일 1회 트레티노인을 경구투여하였으며, 그 후에 트레티노인 투여를 중지하였 다. 대조 그룹 및 모델 그룹은 제15일에 생리 식염수(PSS)를 투여하였고, α-D3 그룹은 α-D3를 투여하였으며, RDE 그룹은 14일 동안 RDE의 대응하는 투여량을 경구투여한다. 마지막 농도는 죽이기 전에 제28일에 투여한다. 골 밀도 및 골 신체역학의 조사는 제29일에 수행하였다.
난소절제된(OVX) 쥐 그룹: 대조 그룹 및 모델 그룹은 모두 증류수로 구강 투여하고, 그 외 모든 그룹은 12주 동안 상기 방법에 따라 치료를 시작하고 그 후에, 본 동물을 희생시켜 골 밀도 및 골 신체역학 조사를 수행한다.
6. 측정:
6.1. 골 밀도 측정은 각 동물의 제2~4 허리 척추골 및 오른쪽 대퇴골로 행한다.
6.2. 골 신체역학 측정: 각 동물의 왼쪽 대퇴골의 3지점에서의 휨 시험(bending test)을 수행하였다; 신체역학 지표를 측정하기 위해 하중-변형 곡선을 작성한다. 실험 조건: 거리 20mm, 하중 속도 10mm/min. 골 구조 역학 지표: 파손 하중(load), 탄성 하중, 최대 반지름, 탄성 반지름, 최대 에너지 흡수; 골 물질 역학 지표: 우선 공식에 따라 대퇴부 관성력을 계산하고, 그 다음 최대 변형(strain), 탄성 변형, 최대 응력(stress), 탄성 응력 및 탄성 계수를 계산하였다.

[결과]
1. 각 그룹의 쥐의 골 밀도(표 9 및 표 10)
표 9. 쥐에서 트레티노인 유도 골다공증의 골 밀도
Figure 112003022382419-pct00007

표 10. 난소절제된(OVX) 쥐 그룹의 골 밀도
Figure 112003022382419-pct00008
표 9 및 표 10으로부터 RDE 그룹 및 α-D3 그룹의 대퇴부 골 밀도는 모델 그룹과 비교하여 현저히 증가하였다. 그리고 RDE 그룹 및 α-D3 그룹사이의 대퇴부 골 밀도의 증가 정도에 상당한 차이가 있다.
2. 각 그룹에서 쥐의 골 신체역학 측정
2.1 골 구조 역학 지표에 대한 영향, 표 11 및 표 12 참조.




Figure 112003022382419-pct00009

Figure 112003022382419-pct00010

상기 표 11 및 표 12로부터, RDE 그룹 및 α-D3 그룹에서 모든 골 구조 역학 지표는 모델 그룹과 비교하여 상당히 증가하였음을 알 수 있다. 또한 RDE 그룹 및 α-D3 그룹사이의 모든 골 구조 역학 지표의 증가 정도에 상당한 차이가 있다. 그리고 RDE 그룹에 있어서, 어느 정도의 투여량-결과사이의 상관 관계가 있음을 알 수 있다.
2.2 골 구조 역학 지표에 대한 영향, 표 13 및 표 14 참조.
Figure 112003022382419-pct00011
Figure 112003022382419-pct00012


표 13 및 표 14로부터, RDE는 골다공증 모델 쥐의 골 최대 응력, 탄성 응력, 최대 하중, 탄성 하중 및 강성 계수를 증가시킴을 알 수 있다. 그리고 RDE 그룹 및 α-D3 그룹사이의 이들 지표에는 상당한 차이가 있다.
상기 결과로부터, RDE는 골 밀도를 증가시키고, 지지 능력 및 충격 저항 능력를 향상시켜서 골 구조 역학 성질을 증대시키며, 기하학적 구조 및 내부 물질 성질을 증대시킴을 알 수 있다.
본 발명에서 RDE는 골다공증 환자의 골 밀도를 증가시키며, 골 흡수를 상당히 억제하고, 항골손실 활성을 가진다. 따라서 골다공증 치료 목적을 달성할 수 있다.

Claims (24)

  1. 총 플라보노이드의 함량이 추출물의 중량 기준으로, 30% 이상이고, 총 플라보노이드중의 나린진의 함량이 총 플라보노이드의 중량 기준으로, 30% 이상 100% 미만인 골쇄보 추출물을 포함하는 골다공증 치료에 사용되는 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 골쇄보 추출물의 총 플라보노이드의 함량이 추출물의 중량 기준으로 50% 이상인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 골쇄보 추출물의 총 플라보노이드중의 나린진의 함량이 총 플라보노이드의 중량 기준으로 90% 이하인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 다음의 단계들을 포함하는, 총 플라보노이드의 함량이 추출물의 중량 기준으로, 30% 이상이고, 총 플라보노이드중의 나린진의 함량이 총 플라보노이드의 중량 기준으로, 30% 이상 100% 미만인 골쇄보 추출물의 제조 방법:
    1) 물, 알콜, 또는 그 혼합물로 골쇄보를 추출하는 단계;
    2) 수지를 이용하여 추출물을 흡착하는 단계; 및
    3) 물, 알콜, 또는 그 혼합물로 추출물이 흡착된 수지를 용출시키는 단계.
  9. 제 8항에 있어서, 물로써 추출을 행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 알콜/물의 혼합물로써 추출을 행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  11. 제 8항 또는 제 10항에 있어서, 알콜/물의 혼합물내의 알콜 함량이 40~90%(중량%)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  12. 제 8항 또는 제 10항에 있어서, 알콜은 메탄올 및 에탄올로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 알콜은 에탄올인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 수지는 큰세공 흡착 수지인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  15. 제 8항에 있어서, 추출물의 흡착 후 알콜 또는 알콜/물의 혼합물로 용출하기 전에, 상기 수지를 물로 세정하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 용출은 알콜/물의 혼합물로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 알콜 함량이 알콜/물의 혼합물의 40~90%(w/w)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  18. 제 15항에 있어서, 알콜은 메탄올 및 에탄올로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 알콜은 에탄올인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  20. 제 14항에 있어서, 추출물의 흡착 후 알콜 또는 알콜/물의 혼합물로 용출하기 전에, 상기 수지를 물로 세정하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 용출은 알콜/물의 혼합물로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 알콜 함량이 알콜/물의 혼합물의 40~90%(w/w)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  23. 제 20항에 있어서, 알콜은 메탄올 및 에탄올로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 알콜은 에탄올인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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