CN106432385A - 一种高纯度灯盏花素提取物及制剂的制备方法及用途 - Google Patents
一种高纯度灯盏花素提取物及制剂的制备方法及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种高纯度灯盏花素提取物及制剂的制备方法及用途。本发明以灯盏细辛为原料，采用动态超声逆流提取或加热回流提取，过滤，离心，调pH值至2.0～7.0，大孔吸附树脂柱层析，应用动态轴向压缩工业色谱分离制备，或采用高速逆流色谱分离制备，冷冻或喷雾干燥，即得高纯度灯盏花素提取物。用本发明方法可在较低温下短时间完成提取，分离周期短、效率高，节省提取容积用量，降低生产成本、减少能耗和环境污染，所得的灯盏花素纯度可达95%以上。通过添加各种药用辅料可制成普通片剂、薄膜包衣片、胶囊剂、分散片、滴丸剂、颗粒剂、缓控释制剂等固体口服制剂，以及喷雾剂、气雾剂、冻干粉针、注射液，用于治疗心脑血管疾病,疗效显著,安全可靠。
Description
技术领域
本发明属植物及中药提取物领域，特别涉及一种高纯度灯盏花素提取物及制剂的制备方法及用途。
背景技术
心脑血管疾病是当今世界上严重危害人类健康与生命的头号杀手，其发病率和死亡率已超过恶性肿瘤而跃居世界第一位。据世界卫生组织(WHO)报告，全世界每年1700万人死于心脑血管疾病，占死亡人口的30.3％，估计到2030年全球心脑血管疾病死亡人数将达到2330万【Go AS,Mozaffarian D,Roger VL,Benjamin EJ,Berry JD,Borden WB,etal.Heart disease and stroke statistics--2013update:a report from the AmericanHeart Association.Circulation.2013；127(1):e6-e245】。据国家卫计委统计，我国城市人口死亡率最高的是心脑血管疾病。全国心脑血管血管疾病患者2.3亿人，每年死于心脑血管疾病的总人数是260万人，每小时有300人被心脑血管疾病夺去了生命。并且该病的发病率呈逐年上升趋势，年龄呈年轻化。目前，心脑血管疾病用药已成为世界医药市场的第一大类药品。
灯盏细辛俗称灯盏花, 为菊科飞蓬属植物短葶飞蓬(Erigeron breviscapus(Vant.) Hand.-Mazz)的干燥全草, 主要分布于我国云南、四川、贵州等省, 尤以云南所产灯盏花闻名于世, 产量约占全国的90%，具有活血化淤、舒筋、止痛，改善微循环的特殊功效【雷婷，王建超，刘光明.灯盏花素在心脑血管疾病中的药理作用研究进展，医学综述，2009,15 (18) : 2844-2846】。灯盏花素是从短亭飞蓬中提取的黄酮类有效成分,主要为灯盏花乙素(4',5,6-三羟基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷)和灯盏甲素(4′, 5 二羟基黄酮-7-O-葡萄糖酸苷) (结构见式1)。其中，灯盏花乙素是其主要活性成分，含量>95%。药理学研究表明，灯盏花素具有扩张脑血管，降低脑血管阻力，增加脑部血流量，改善微循环；抗血小板聚集，抗凝血、抑制血栓形成，改善血液流变性【Lu J, Cheng C, Zhao X, et al. PEG-scutellarin prodrugs: synthesis, water solubility and protective effect oncerebral ischemia/reperfusion injury. Eur JMed Chem. 2010; 45 (5): 1731-1738】；抑制神经细胞凋亡及兴奋性氨基酸(EAA)的毒性，抑制炎症反应，减轻血脑屏障损伤，明显增加脑缺血及再灌注后脑组织Na+-K+～ATP酶和Ca2+～ATP酶活性，改善脑组织能量代谢，减轻脑水肿【Zhang HF, Hu XM, Wang LX, et al. Protective effects ofscutellarin against cerebral ischemia in rats: evidence for inhibition of theapoptosis-inducing factor pathway. Planta Med. 2009; 75 (2): 121-126】；显著增加冠脉血流量，缩小心肌梗塞范围，抑制脂质过氧化，减轻自由基损伤，抑制蛋白激酶C，减轻细胞内Ca2+超载，提高机体耐缺氧等作用。目前，临床主要用于心脑血管疾病的治疗，疗效确切，对冠心病、心绞痛、急性心肌梗死、脑血栓、脑供血不足、中风后遗症、缺血性脑血管病的急性期、恢复期及脑梗塞所致的瘫痪等症状，总有效率达90%以上。同时也可用于闭塞性血管疾病、脉管炎、慢性肾功能衰竭、糖尿病及其并发症、肾病综合征、慢性肺源性心脏病等的治疗。
灯盏花乙素（Scutellarin） 灯盏花甲素（Apigenin-7-O-glucuronide）
式1 灯盏花乙素和灯盏花甲素结构
灯盏花素和注射用灯盏花素已被2015版《中国药典》收录，全国有近百家制药企业生产灯盏花素制剂，产量呈逐年递增趋势。作为一种重要的植物药中间体，其提取物亦用于出口，灯盏花素的原料与制剂年产值已突破百亿元。目前，现有灯盏花素的提取分离工艺路线过于粗糙，导致产品主要成份的纯度偏低，杂质含量较高，有些灯盏花素注射液临床使用后，偶见胸闷、乏力、皮疹、全身发痒、心悸等不良反应。因此，针对现有提取分离工艺的不足，寻求一种质量稳定、精制纯化工艺合理的高纯度灯盏花素的制备方法及其相关制剂的研发，具有重要的临床治疗意义和广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用动态超声逆流提取或加热回流提取，结合大孔吸附树脂柱层析、动态轴向压缩工业色谱或高速逆流色谱分离制备高纯度灯盏花素提取物的方法，该工艺过程简单，质量可控。用这种方法制备出的高纯度灯盏花素，可通过添加药用辅料制成医学上可接受的各种剂型，用于临床治疗冠心病、心绞痛、急性心肌梗死、脑血栓、脑供血不足、中风后遗症、缺血性脑血管病的急性期、恢复期及脑梗塞所致的瘫痪。同时也可用于闭塞性血管疾病、脉管炎、慢性肾功能衰竭、糖尿病及其并发症、肾病综合征、慢性肺源性心脏病等症状。
本发明方法通过以下步骤实现：将丁灯盏细辛粉碎至10～20目，加6～20倍体积水或体积百分比浓度为10%～80%的醇溶液，或丙酮溶液，或异丙醇溶液，动态超声逆流提取或加热回流提取2～3次，每次0.5～2h，过滤，合并提取液，减压回收提取溶剂，适当浓缩至浓度为0.4～2.0 g生药/ml，离心或过滤后，加稀盐酸调节pH至2.0～7.0得上柱溶液，上柱溶液以2BV/h～4BV/h的流速通过大孔吸附树脂层析柱，上柱溶液按照固形物与干树脂的比例为1：5～10，先用4～6BV的蒸馏水洗涤树脂柱床，洗脱流速为2BV/h～4BV/h，弃去水洗脱液；再用体积百分比浓度为10%～80%的醇洗脱剂洗脱，洗脱流速为2BV/h～4BV/h，合并洗脱液减压回收醇，减压浓缩至相对密度为1.05～1.30，加入200～300目的柱层析硅胶填料，加甲醇拌匀后烘干，过动态轴向压缩反向工业制备色谱柱，二氯甲烷-甲醇、氯仿-甲醇或甲醇-水(6：1～2：1)为流动相梯度洗脱，分别收集含灯盏花素的主段洗脱液，合并，减压浓缩，加入10倍量二氯甲烷-甲醇（8：1～5：1）重结晶，过滤，减压回收溶剂，冷冻干燥、喷雾干燥或减压干燥，即得高纯度灯盏花素（HPLC检测纯度≥95%）。
或取灯盏细辛的大孔树脂粗提物，加入正己烷-乙酸乙酯-甲醇/乙醇-水系统或正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水系统的下相中，震荡使完全溶解，进行高速逆流色谱(HSCCC)分离制备。高速逆流色谱分离条件：检测波长为335 nm，主机温度为25℃，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统或正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水系统（2：8：4：4～6或3：7：3～4：6～8），正己烷-乙酸乙酯（固定相）为上相，甲醇/乙醇-水或正丁醇-水（流动相）为下相。将固定相以10～30 ml/min流速装满色谱分离柱，调整高速逆流色谱仪主机转速为600～900 rpm/min，同时以2.0～6.0 ml/min的流速泵入流动相，待两相达到动态平衡，开启进样阀，样品液进样，采集数据并记录紫外色谱图，在335 nm波长下回收目的流分，减压回收溶剂，冷冻或喷雾干燥，得高纯度灯盏花素提取物（HPLC检测纯度≥95%）。
本发明所述的大孔吸附树脂为聚苯乙烯类型中极性、弱极性和非极性大孔树脂，包括ADS-17、ADS-750、LSA-21、LX-26、XDA-6、D101、D113、D151、D152、D3520、H103、HPD100A、HPD-300、HPD400、HPD500、HPD-650、HPD-700、HPD-750、HPD-800、HPD-820、DM301、X-5、S-8、SP825、CAD45、860021、NKA-Ⅱ或NKA-9的一种或几种，优选大孔吸附树脂D152、HPD-400或HPD-650型。离心分离时，离心速度在3000～10000转/分钟范围内。动态轴向压缩(DAC)工业制备色谱填料为100～300目的柱层析硅胶，洗脱流动相为二氯甲烷-甲醇、氯仿-甲醇或甲醇-水系统(6：1～2：1)梯度洗脱。高速逆流色谱(HSCCC)所用洗脱溶剂为正己烷-乙酸乙酯-甲醇/乙醇-水系统或正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水系统。
本发明的优点是：
1．本发明首次利用动态超声逆流提取工艺，结合大孔吸附树脂柱层析和动态轴向压缩工业制备色谱或高速逆流色谱分离技术，制备纯度高达95％以上灯盏花素提取物，并可通过添加各种药用辅料制成多种剂型，为开发出治疗心脑血管疾病、闭塞性血管疾病、脉管炎、慢性肾功能衰竭、糖尿病及其并发症、肾病综合征、慢性肺源性心脏病等病症的中药五类新药提供了物质基础；
2．本发明设计合理，工艺简单，采用动态超声醇提取法，大孔吸附树脂柱层析结合动态轴向压缩工业色谱或高速逆流色谱分离技术，获得高纯度的灯盏花素提取物，无环境污染，操作简便快捷，成本较低，非常适合工业化生产；
3．本发明所选用的大孔吸附树脂纯化方法，具有吸附量大，解吸率高，树脂再生后可反复使用等优点；动态轴向压缩(DAC)工业制备色谱是一种高效的分离技术，与传统制备色谱相比，具有负载样品量大，装填填料时间短、色谱柱效高、分离速度快等特点，可达到接近分析柱的柱效；高速逆流色谱分离技术(HSCCC)具有无载体快速高效分离、回收率高、分离量大、操作简单等优点，近年来被广泛地应用于天然活性成分的分离制备，因此具有很好的应用前景。
所得到的高纯度灯盏花素提取物，通过添加各种药用辅料可制成普通片剂、薄膜包衣片、胶囊剂、分散片、滴丸剂、颗粒剂、缓控释制剂等固体口服制剂，以及喷雾剂、气雾剂、冻干粉针、注射液等剂型。
附图说明
图1 是本发明高纯度灯盏花素提取物及制剂的制备工艺流程图。
图2 是高纯度灯盏花素提取物的HPLC色谱图。
图3 是采用高纯度灯盏花素为原料制备的三角形分散片。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1 动态超声逆流提取结合大孔吸附树脂柱层析和动态轴向压缩工业制备色谱分离技术制备高纯度灯盏花素提取物
将灯盏细辛药材10 kg粉碎至20～30目，加8倍量体积百分比浓度为70%的乙醇，于频率30 kHz，超声功率20kW连续逆流提取3，每次40 min，过滤，合并提取液，减压回收提取溶剂，适当浓缩至浓度为0.6 g生药/ml，加1 mol/L盐酸调pH值至4，以2BV/h的流速通过HPD650大孔吸附树脂层析柱，上样液按固形物质量与干树脂的比例为1：6，径高比为1：8，先用4 BV的蒸馏水洗涤树脂柱床，洗脱流速为2 BV/h，弃去水洗脱液；再用体积百分比浓度为50%的乙醇洗脱，洗脱流速为2 BV/h，洗脱液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.15 (50℃测得)，加入200～300目的柱层析硅胶填料，加甲醇拌匀后烘干，过动态轴向压缩反向工业制备色谱柱，二氯甲烷-甲醇(5：1～3：1)为流动相梯度洗脱，分别收集含灯盏花素的主段洗脱液，合并，减压浓缩，加入10倍量二氯甲烷-甲醇（8：1）重结晶，过滤，减压回收溶剂，冷冻干燥或喷雾干燥，测得灯盏花乙素含量≥95%（HPLC法，重量百分比）。
实施例2 加热回流提取结合大孔吸附树脂柱层析和高速逆流色谱分离制备高纯度灯盏花素提取物
在粉碎至20～30目的2kg灯盏细辛药材中，加15倍量体积百分比浓度为80%的乙醇，加热回流提取3次，每次1.5 h，过滤，合并提取液，浓缩至浓度为1.0 g生药/ml，过滤后加1mol/L盐酸调pH值至4～5，以3BV/h的流速通过HPD400大孔吸附树脂层析柱，上样液按固形物质量与干树脂的比例为1：8，径高比为1：10，先用6 BV的水洗涤树脂，洗脱流速为4 BV/h，弃去水洗脱液；再用体积百分比浓度为60%的甲醇洗脱，洗脱流速为3 BV/h，洗脱液减压回收甲醇，浓缩至相对密度为1.25 (50℃测得)，减压干燥，加入正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水系统的下相中，震荡使完全溶解，进行高速逆流色谱(HSCCC)分离制备。高速逆流色谱分离条件：检测波长为285 nm，主机温度为25℃，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统（2：8：4：4～6或3：7：3～4：6～8），正己烷-乙酸乙酯（固定相）为上相，甲醇/乙醇-水或正丁醇-水（流动相）为下相。将固定相以10 ml/min流速装满色谱分离柱，调整高速逆流色谱仪主机转速为900 rpm/min，同时以2.0 ml/min的流速泵入流动相，待两相达到动态平衡，开启进样阀，样品液进样，采集数据并记录紫外色谱图，在335 nm波长下回收目的流分，减压回收溶剂，冷冻或喷雾干燥，测得灯盏花乙素含量95%（HPLC法，重量百分比）。
实施例3加热回流提取结合大孔吸附树脂柱层析和动态轴向压缩工业制备色谱分离技术制备高纯度灯盏花素提取物
灯盏细辛5 kg适度粉碎，加10倍量的60%甲醇，于频率30 kHz，超声功率20kW连续超声逆流提取3次，每次0.5 h，过滤，合并提取液，减压回收甲醇，加水调节浓度至1.5 g生药/ml，加1 mol/L盐酸调pH值至6，以2BV/h的流速通过SP825大孔吸附树脂层析柱2次，上样液按固形物质量与干树脂的比例为1：9，径高比为1：8，先用4 BV的水洗涤树脂，洗脱流速为2BV/h，弃去水洗脱液；再用体积百分比浓度为70%的乙醇洗脱，洗脱流速为3 BV/h，洗脱液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.15 (50℃测得)，加入200～300目的柱层析硅胶填料，加甲醇拌匀后烘干，过动态轴向压缩反向工业制备色谱柱，氯仿-甲醇(6：1～4：1)为流动相梯度洗脱，分别收集含灯盏花素的主段洗脱液，合并，减压浓缩，加入10倍量二氯甲烷-甲醇（5：1）重结晶，过滤，减压回收溶剂，冷冻干燥或喷雾干燥，测得灯盏花乙素含量92%（HPLC法，重量百分比）。
实施例4 动态超声逆流提取结合大孔吸附树脂柱层析和高速逆流色谱分离制备高纯度灯盏花素提取物
灯盏细辛5kg适度粉碎，加12倍量的50%乙醇，于频率30 kHz，超声功率20kW连续超声逆流提取3次，每次1.5 h，过滤，合并提取液，减压回收乙醇，加水调节浓度至1.2 g生药/ml，加1 mol/L盐酸调pH值至3～5，以3BV/h的流速通过D152大孔吸附树脂层析柱2次，上样液按固形物质量与干树脂的比例为1：10，径高比为1：8，先用4 BV的水洗涤树脂，洗脱流速为2BV/h，弃去水洗脱液；再用体积百分比浓度为50%的乙醇洗脱，洗脱流速为3 BV/h，洗脱液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.15 (50℃测得)，减压干燥，加入正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水系统的下相中，震荡使完全溶解，进行高速逆流色谱(HSCCC)分离制备。高速逆流色谱分离条件：检测波长为285 nm，主机温度为25℃，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统（3：7：3～4：6～8），正己烷-乙酸乙酯（固定相）为上相，甲醇/乙醇-水或正丁醇-水（流动相）为下相。将固定相以20 ml/min流速装满色谱分离柱，调整高速逆流色谱仪主机转速为600 rpm/min，同时以3.0 ml/min的流速泵入流动相，待两相达到动态平衡，开启进样阀，样品液进样，采集数据并记录紫外色谱图，在335 nm波长下回收目的流分，减压回收溶剂，冷冻或喷雾干燥，测得灯盏花乙素含量90%（HPLC法，重量百分比）。
实施例5
灯盏细辛5 kg适度粉碎，加13倍量的30%乙醇，加热回流提取3次，每次2.0 h，过滤，合并提取液，减压回收乙醇，加水调节浓度至0.8 g生药/ml，加1 mol/L盐酸调pH值至6.5，以2BV/h的流速通过HPD700大孔吸附树脂层析柱2次，上样液按固形物质量与干树脂的比例为1：6，径高比为1：8，先用4 BV的水洗涤树脂，洗脱流速为2 BV/h，弃去水洗脱液；再用体积百分比浓度为70%的乙醇洗脱，洗脱流速为3 BV/h，洗脱液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.20 (50℃测得)，加入200～300目的柱层析硅胶填料，加甲醇拌匀后烘干，过动态轴向压缩反向工业制备色谱柱，二氯甲烷-甲醇(5：1～2：1)为流动相梯度洗脱，分别收集含灯盏花素的主段洗脱液，合并，减压浓缩，加入10倍量二氯甲烷-甲醇（6：1）重结晶，过滤，减压回收溶剂，冷冻干燥或喷雾干燥，测得灯盏花乙素含量88%（HPLC法，重量百分比）。
实施例6
灯盏细辛5 kg适度粉碎，加10倍量的20%乙醇，加热回流提取2次，每次2h，过滤，合并提取液，减压回收乙醇，加水调节浓度至0.5 g生药/ml，加1 mol/L盐酸调pH值至7.0，以3BV/h的流速通过860021大孔吸附树脂层析柱2次，上样液按固形物质量与干树脂的比例为1：6，径高比为1：8，先用4 BV的水洗涤树脂，洗脱流速为2 BV/h，弃去水洗脱液；再用体积百分比浓度为60%的乙醇洗脱，洗脱流速为3 BV/h，洗脱液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.20(50℃测得)，加入200～300目的柱层析硅胶填料，加甲醇拌匀后烘干，过动态轴向压缩反向工业制备色谱柱，二氯甲烷-甲醇(5：1)为流动相洗脱，分别收集含灯盏花素的主段洗脱液，合并，减压浓缩，加入15倍量二氯甲烷-甲醇（7：1）重结晶，过滤，减压回收溶剂，冷冻干燥或喷雾干燥，测得灯盏花乙素含量76%（HPLC法，重量百分比）。
高纯度灯盏花素提取物制剂的制备
实施例7 灯盏花素滴丸的制备
高纯度灯盏花素提取物25 g，加入75 g的熔融混合基质PEG6000：PEG4000 (1:1)，搅拌均匀后转移至贮液瓶中，密闭并保温在75℃，用定量泵滴丸机由上往下滴制，冷却剂为二甲基硅油，滴头口径（内/外径）：2.1/2.5 mm，滴速：30丸/分钟，滴距：8 cm，每丸25mg，收集滴丸，吸去表面冷却剂，干燥，即得。
实施例8 灯盏花素分散片的制备
分散片处方：
原料药 80 g (20%)
乳糖 50 g （12.5%）
可压性淀粉 102.5 g (25.63%)
微晶纤维素（MCC） 100 g (25%)
羧甲基淀粉钠（CMS-Na） 27.5 g (6.87%)
交联聚维酮 (PVPP) 37.5 g (9.38%)
微粉硅胶 2.5 g (0.63%)
95% 乙醇溶液 适量
制成 1000片 (0.4 g/片)
取高纯度灯盏花素提取物80g，与可压性淀粉102.5 g、微晶纤维素100g、乳糖50 g、羧甲基淀粉钠27.5 g、交联聚维酮37.5 g混匀，加95％乙醇适量制成软材， 24目筛制粒，60℃干燥，加入微粉硅胶2.5 g混匀后，22目筛整粒，压制成片，片型为三角形异形片，片重400mg，每片含灯盏花乙素80 mg。
实施例9 灯盏花素注射用冻干粉针的制备
高纯度灯盏花素15 g，加入20g甘露醇，加注射用水至200ml溶解，用1mol/L的NaOH溶液调pH至7.5，加入0.5%活性炭，保持pH至7.5，加热微沸15分钟，在此过程中不断搅拌，冷却至50℃左右滤过，冷却至室温后经0.45μm微孔滤膜过滤，按每瓶2ml分装于5ml的西林瓶内，115℃流通蒸汽灭菌30分钟，冷冻干燥，取出后压盖包装即得。
实施例10灯盏花素胶囊剂的制备
取高纯度灯盏花素40g，与乳糖20g、淀粉60g混匀，加95％乙醇制成软材，用14目筛制粒后，置60℃～70℃干燥后于12目筛整粒，套入1号空心胶囊中即得，每粒胶囊含药80 mg。
实施例11灯盏花素普通片剂的制备
取高纯度灯盏花素25 g，与淀粉45 g、微晶纤维素15g、乳糖12 g、羧甲基淀粉钠8g混匀，加10％淀粉浆适量制成软材，加入微粉硅胶0.5g，混匀后30目筛制粒，24目筛整粒，压制成片，理论片重400mg，每片含药100 mg。
高纯度灯盏花素提取物的药理活性研究
实施例12高纯度灯盏花素提取物对大鼠脑缺血的保护作用
1. 实验材料
1.1 实验药物
灯盏花素提取物(自制，纯度＞95%)，尼莫地平片( 亚宝药业集团股份有限公司，批号090806，每片20 mg)。
1.2 实验动物
健康雄性SD大鼠，体重：180-220 g；（上海斯莱克实验动物有限责任公司提供）
1.3 实验试剂
水合氯醛(上海山浦化工公司)
NaCl注射液(哈药集团制药六厂)
10%水合氯醛配制：称取10 g水合氯醛，溶解于100 ml生理盐水中。
2，3，5-三苯基氯化四氮唑( TTC)，美国Sigma公司
超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，丙二醛(MDA)试剂盒，一氧化氮(NO)试剂盒（南京建成生物工程研究所）
2. 实验动物分组：
健康SD大鼠60只，体重：180-220g。购入后适应性饲养7天，随机分为6组，每组10只，即假手术组、模型组、尼莫地平对照组（20 mg/kg）、灯盏花素高剂量组（40 mg/kg）、灯盏花素中剂量组（20 mg/kg）、灯盏花素低剂量组（10 mg/kg），每天灌胃给药2次，连续7天。假手术组和模型组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液。
3. 大脑中动脉栓塞脑缺血-再灌注(ischemia-reperfusion, IR)损伤模型建立：
参照Longa等的方法制备IR模型[1，2]。将SD大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定在实验台上。取颈正中线切口，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。将直径为0.23 mm的尼龙线经CCA插入ICA，进线深度为16～19 mm。阻断左侧大脑中动脉血流2 h，拔出尼龙线予以再灌注4 h。假手术组只分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，不闭塞大脑中动脉。术中严格控制室温在25℃左右。
4. 神经功能体征评价
在实验造模清醒后及给药后1天、3天、7天等时点对每只大鼠进行神经功能缺损评分，所有检测由对大鼠分组不知情的同一人次完成，按照MACO大鼠行为学评分标准[1-3]，进行5分制神经功能评分，分数越高，提示实验动物神经损伤越严重。评分标准如下：
表1 神经功能评分标准
| 实验动物活动情况 | 评分 | 神经功能缺损程度 |
| 肢体活动正常 | 0 | 无神经损伤体征 |
| 不能完全伸展右侧前肢 | 1 | 轻度局灶性损伤 |
| 行走时有右侧旋转 | 2 | 中度局灶性损伤 |
| 自主运动时有右侧倾倒 | 3 | 重度局灶性损伤 |
| 无自主活动并伴有意识障碍 | 4 | 极重度损伤 |
5. TTC染色测定大鼠脑梗死面积百分比；
5.1 TTC染色
神经功能学评分后大鼠断头处死，迅速取脑，生理盐水漂洗后置-20℃冰箱中冷冻30min，切除嗅球、小脑和低位脑干，间隔3 mm连续做脑组织冠状切片。将脑组织冠状切片置2％的2，3，5氯化四唑（Triphenyl tetrazolium chloride，TTC）生理盐水溶液中37℃避光温浴30min，期间每隔10 min翻动一次使脑片染色均匀。TTC可被线粒体过氧化氢酶还原，生成红色、光敏脂溶性的Formazen，将正常脑组织染成红色，缺血梗死区因无此反应而呈现白色。
5.2 大鼠脑梗死面积百分比的计算
脑组织切片经TTC染色30min后，4%的多聚甲醛固定并经图像扫描后用Image/J图像分析软件测量梗死面积，计算梗死脑组织面积占总面积的百分比。
6. 脑组织中SOD、MDA、NO含量的测定
按照试剂盒说明书测定脑组织中的SOD、MDA、NO含量。SOD的测定用黄嘌呤氧化酶法按操作步骤进行, 于550 nm处, 用分光光度计测吸光度。MDA的测定用硫代巴比妥酸法按操作步骤进行, 于532 nm处, 用分光光度计测吸光度。NO的测定用硝酸还原酶法, 于550 nm处, 用分光光度计测吸光度。
7. 统计学处理
采用统计学软件包SPSS16.0进行统计学分析。资料用±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用方差分析。
8.实验结果：
8.1 灯盏花素提取物对脑缺血再灌注大鼠脑梗塞面积和神经功能评分的影响
实验结果显示，模型组小鼠脑梗死面积明显增大，并出现严重的神经功能散失症状，与假手术组比较具有显著性差异；灯盏花素各剂量组均能有效改善神经功能损失症状( P＜0.05和P＜0.01)，并可显著降低大鼠脑梗死面积，与模型组比较具有统计学差异；其中盏花素中剂量组的作用效果，与尼莫地平对照组类似。
表2灯盏花素提取物对脑缺血再灌注大鼠脑梗塞面积和神经功能评分的影响
| 组别 | 动物数 | 脑梗死面积(%) | 神经功能评分 |
| 假手术组 | 10 | 0.00 ± 0.00 | 0.00 ± 0.00 |
| 模型组 | 10 | 38.8 ± 4.7△△ | 3.42 ± 0.47△△ |
| 对照组 | 10 | 27.2 ± 3.5** | 1.93 ± 0.43* |
| 高剂量组 | 10 | 23.6 ± 2.9** | 1.74± 0.29** |
| 中剂量组 | 10 | 26.7 ± 5.2** | 2.11 ± 0.31* |
| 低剂量组 | 10 | 30.9 ± 3.6* | 2.56± 0.29** |
注:与假手术组比较，△ P<0.05，△△ P <0.01;
与模型组比较，* P <0.05，** P<0.01
8.2灯盏花素提取物对脑缺血再灌注大鼠脑组织SOD、MDA和NO含量的影响
实验结果表明，与模型组比较，假手术组大鼠脑组织中的SOD活力明显降低、MDA、NO含量明显增加。与模型组比较，灯盏花素各剂量组大鼠脑组织中的SOD活力明显增加，其中，灯盏花素高、中剂量组大鼠脑组织MDA、NO含量明显降低；与阳性对照药尼莫地平组比较, 灯盏花素高、中剂量组大鼠脑组织MDA、NO含量明显降低。
表3灯盏花素对脑缺血再灌注大鼠脑组织SOD、MDA和NO含量的影响(±s)
| 组别 | 动物数 | SOD (U/ml) | MDA (nmol/ml) | NO(μmol/L) |
| 假手术组 | 10 | 36.57 ± 7.82 | 1.51 ± 0.49 | 0.82 ± 0.23 |
| 模型组 | 10 | 13.28 ± 4.64△△ | 2.42 ± 0.57△△ | 3.69 ± 0.53△△ |
| 对照组 | 10 | 25.31 ± 8.62** | 2.18 ± 0.61* | 1.91 ± 0.37** |
| 高剂量组 | 10 | 29.18 ± 6.86** | 1.79 ± 0.26** | 1.47 ± 0.26** |
| 中剂量组 | 10 | 26.91 ± 7.25** | 1.93 ± 0.38* | 1.86 ± 0.31** |
| 低剂量组 | 10 | 19.48 ± 5.73* | 2.25 ± 0.29** | 2.52 ± 0.46* |
注:与假手术组比较，△ P<0.05，△△ P <0.01;
与模型组比较，* P <0.05，** P<0.01。
Claims (12)
1.一种高纯度灯盏花素提取物及制剂的制备方法及用途，其特征在于提取工艺过程包括：动态超声逆流提取或加热回流提取；分离过程包括：大孔吸附树脂柱层析、动态轴向压缩(DAC)工业色谱或高速逆流色谱(HSCCC)分离制备。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度灯盏花素提取物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：将灯盏细辛全草粉碎，加6～20倍体积水或体积百分比浓度为10%～80%的醇溶液，或丙酮溶液，或异丙醇溶液，动态超声逆流提取或加热回流提取2～3次，每次0.5～2h，过滤，合并提取液，减压回收提取溶剂，适当浓缩至浓度为0.4～2.0 g生药/ml，离心或过滤后，加稀盐酸调节pH至2.0～7.0得上柱溶液，上柱溶液以2BV/h～4BV/h的流速通过大孔吸附树脂层析柱，上柱溶液按照固形物与干树脂的比例为1：5～10，先用4～6BV的蒸馏水洗涤树脂柱床，洗脱流速为2BV/h～4BV/h，弃去水洗脱液；再用体积百分比浓度为10%～80%的醇洗脱剂洗脱，洗脱流速为2BV/h～4BV/h，合并洗脱液减压回收醇，减压浓缩至相对密度为1.05～1.30，加入200～300目的柱层析硅胶填料，加甲醇拌匀后烘干，过动态轴向压缩反向工业制备色谱柱，二氯甲烷-甲醇、氯仿-甲醇或甲醇-水(6：1～2：1)为流动相梯度洗脱，分别收集含灯盏花素的主段洗脱液，合并，减压浓缩，加入10倍量二氯甲烷-甲醇（8：1～5：1）重结晶，过滤，减压回收溶剂，冷冻干燥、喷雾干燥或减压干燥，即得淡黄绿色的高纯度灯盏花素（HPLC检测纯度≥95%）；
或取灯盏细辛的大孔树脂粗提物，加入正己烷-乙酸乙酯-甲醇/乙醇-水系统或正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水系统的下相中，震荡使完全溶解，进行高速逆流色谱（HSCCC）分离制备；高速逆流色谱分离条件：检测波长为285 nm，主机温度为25℃，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统或正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水系统（2：8：4：4～6或3：7：3～4：6～8），正己烷-乙酸乙酯（固定相）为上相，甲醇/乙醇-水或正丁醇-水（流动相）为下相；
将固定相以10～30 ml/min流速装满色谱分离柱，调整高速逆流色谱仪主机转速为600～900 rpm/min，同时以2.0～6.0 ml/min的流速泵入流动相，待两相达到动态平衡，开启进样阀，样品液进样，采集数据并记录紫外色谱图，在335 nm波长下回收目的流分，减压回收溶剂，冷冻或喷雾干燥，得淡黄绿色的高纯度灯盏花素提取物（HPLC检测纯度≥95%）。
3.根据权利要求2所述的一种高纯度灯盏花素提取物的制备方法，所用提取溶剂为水、乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇其中的一种或几种的混合物。
4.根据权利要求2所述的一种高纯度灯盏花素提取物的制备方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂为聚苯乙烯类中等极性、弱极性和非极性大孔吸附树脂，型号选用ADS-17、ADS-750、LSA-21、LX-26、XDA-6、D101、D113、D151、D152、D3520、H103、HPD100A、HPD-300、HPD400、HPD500、HPD-650、HPD-700、HPD-750、HPD-800、HPD-820、DM301、X-5、S-8、SP825、CAD45、860021、NKA-Ⅱ或NKA-9的一种或几种。
5.根据权利要求2所述的一种高纯度灯盏花素提取物的制备方法，其特征在于，大孔吸附树脂柱层析所用洗脱溶剂为乙醇-水系统或甲醇-水系统，优选乙醇-水系统；动态轴向压缩工业色谱所用流动相为二氯甲烷-甲醇、氯仿-甲醇或甲醇-水系统(6：1～2：1)梯度洗脱；高速逆流色谱所用洗脱溶剂为正己烷-乙酸乙酯-甲醇/乙醇-水系统或正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水系统。
6.根据权利要求1方法制备的一种高纯度灯盏花素提取物及制剂的制备方法及用途，其特征在于，通过添加各种药用辅料制成医学上可接受的各种药物制剂如：普通片剂、薄膜包衣片、胶囊剂、分散片、滴丸剂、颗粒剂、缓控释制剂等固体口服制剂，以及喷雾剂、气雾剂、冻干粉针、注射液等剂型。
7.根据权利要求6制备的一种高纯度灯盏花素提取物及制剂的制备方法及用途，其特征在于，制剂中主药的质量百分比为10%～80%，药学上可以接受的辅料质量百分比为20%～90%。
8.根据权利要求6所述的一种高纯度灯盏花素提取物制剂，包括：普通片剂、薄膜包衣片、分散片、缓释或控释片剂，其特征在于所述片芯由10%～70%质量百分比的主药，10%～60%质量百分比的稀释辅料，10%～50%质量百分比的缓释或控释辅料，1%～15%质量百分比的崩解辅料，1%～20%质量百分比的黏合辅料，0.3%～5%质量百分比的润滑辅料组成。
9.根据权利要求6所述的高纯度灯盏花素提取物制剂，其特征在于，片芯所用稀释辅料为淀粉、乳糖、糊精、蔗糖、微晶纤维素、磷酸氢钙、硫酸钙中的一种或几种的混合物；崩解辅料是指羧甲基淀粉钠(CMS-Na)、低取代羟丙基纤维素(L-HPC)、交联羧甲基纤维素钠(cCMC-Na)、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、交联聚维酮、羟丙基淀粉中的一种或几种的混合物；黏合辅料是指微晶纤维素、羟丙甲基纤维酮（HPMC）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、体积百分比为50%～95%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP K25)乙醇溶液、淀粉浆、糖浆的一种或几种的混合物；润滑辅料是指滑石粉、硬脂酸镁、微粉硅胶中的一种或几种的混合物。
10.根据权利要求6所述的高纯度灯盏花素提取物制剂，其特征在于，所述片剂的外观为圆形片或异型片，包括：三角形片、椭圆形片、菱形片。
11.根据权利要求6所述的高纯度灯盏花素提取物制剂，其特征在于，所述滴丸剂的基质为泊洛沙姆-188 (Poloxamer-188)、聚乙二醇-4000 (PEG-4000)、聚乙二醇-6000 (PEG-6000)、木糖醇、药用淀粉、硬脂酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸脂中的一种或几种的混合物，滴入冷却剂为二甲基硅油、液体石蜡、植物油中的一种或几种的混合物；
滴丸制备条件：药物与基质配比为1：4～1: 2，药液温度70℃～90℃，采取保温滴制，滴头口径（内/外径）：2.1/2.5 mm～3.0/5.0 mm，滴速：20 d/min～30 d/min，滴距：4～10 cm。
12.根据权利要求1方法制备的一种高纯度灯盏花素提取物及其制剂，对心脑血管疾病, 如：冠心病、心肌梗塞、心绞痛，闭塞性血管疾病、脉管炎等；脑供血不足、中风后遗症、缺血性脑血管病的急性期、恢复期及后遗症，如：脑血栓、脑溢血所致的后遗症瘫痪、痴呆等，有显著疗效。
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