CN102043020A - 一种具有脑神经保护作用的灯盏细辛活性成分筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药活性筛选方法，具体来说提供了一种筛选灯盏细辛中具有脑神经保护作用活性成分的方法。该方法包括如下步骤：采用现代分离技术将灯盏细辛提取物分为不同极性的组分；将各组分按不同配比组成组合物；对组合物进行指纹图谱分析和神经细胞受损模型保护作用试验，将指纹图谱化学信息和药理活性信息数据经统计学处理，利用谱效相关性研究筛选出灯盏细辛中活性组分及活性成分。本发明可以快速、简便、准确地筛选灯盏细辛中具有脑神经保护作用的活性组分及成分，筛选效率高且成本较低，经深入研究有望开发出灯盏细辛治疗老年性痴呆病的有效治疗药物，具有良好应用前景。

Description

一种具有脑神经保护作用的灯盏细辛活性成分筛选方法

技术领域

本发明涉及中药活性筛选方法，具体来说提供了一种筛选灯盏细辛中具有脑神经保护作用活性成分的方法。

背景技术

灯盏细辛又名灯盏花，为菊科植物短葶飞蓬[Erigeron breviscapus(Vant.)hand-Mazz.]的干燥全草，是临床广为应用的单味中药。对于灯盏细辛的化学成分和药理活性已经进行了较多的基础研究，发现灯盏细辛及其提取物可扩张冠状动脉，增加心肌血流，减少血小板积聚、改善微循环、改善冠心病心绞痛；改善急性脑梗死临床症状、增强急性缺血性脑卒中患者神经功能的恢复、对脑缺血有明显保护作用。国内市场上已开发出该药的冻干粉针、注射液、胶囊剂、片剂、滴丸等单味药制剂，主要用于心脑血管疾病的治疗。近年来研究发现，灯盏细辛可用于治疗青光眼等眼科疾病，其作用机制与对视神经的保护有关(张静，张艺，杨文宇等，华西药学杂志，2007，22(2)：121～123)。发明人最近的研究表明，灯盏细辛具有脑神经保护作用，表现为上调神经型尼古丁受体的表达、降低乙酰胆碱酯酶活性和抗神经毒性作用(齐晓岚，黄勇，王永林等，时珍国医国药，2009，20(1)：69～71)。

神经型尼古丁受体是神经系统中一类非第2信使介导性神经递质结合的离子通道，与学习和记忆关系密切，是一类明确的具有神经保护功能的受体，其减少与阿尔茨海默氏病(Alzheimerg disease，简称AD)的发生有关。AD病是一种主要在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的神经元退行性变疾病，其主要临床表现为进行性认知功能障碍、记忆力衰退、性格和行为改变等。AD病人脑内尼古丁受体-配体结合率降低，其亚基的蛋白表达水平也降低。目前寻找可上调神经型尼古丁受体且副作用小的药物是治疗AD药物研究的方向之一。同时迄今为止，在AD的治疗上，世界上最为成熟和成功的方法是采用胆碱酯酶抑制剂，以提高患者脑内乙酰胆碱的水平、补偿胆碱能功能的缺失。

由此可见，灯盏细辛具有脑神经保护作用，对于AD的治疗具有一定的作用，经深入研究有望开发出灯盏细辛治疗老年性痴呆病的有效治疗药物。但目前对灯盏细辛具脑神经保护的有效成分的研究未见报道。为了有效开发利用灯盏细辛的药用价值，快速准确地筛选出灯盏细辛中具有脑神经保护作用的活性组分及成分具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于建立一种快速、简便、准确地筛选灯盏细辛中具有脑神经保护作用的活性组分及成分的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

灯盏细辛中具有脑神经保护作用活性成分的筛选方法。该方法包括如下步骤：

(1)采用现代分离技术将分为不同极性的组分；

(2)将各组分按不同配比组成组合物；

(3)对组合物进行指纹图谱分析；

(4)对组合物进行神经细胞受损模型保护作用试验；

(5)将指纹图谱化学信息和药理活性信息数据经统计学处理，筛选出灯盏细辛中活性组分及活性成分。

灯盏细辛提取物是采用0-95％乙醇水溶液提取，回收溶剂，冷藏，滤除不溶物，即得。

灯盏细辛提取物可采用MCI柱、大孔树脂吸附柱、聚酰胺吸附柱、硅胶柱将其分为不同极性的组分，再将不同极性的各组分按正交设计、均匀设计、析因设计组成配比不同的组合物。

灯盏细辛组分不同配比的组合物可采用HPLC或UPLC进行指纹图谱分析。

灯盏细辛组分不同配比的组合物的药理活性测试，可采用神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)神经细胞，经毒性蛋白(如β淀粉样肽)处理，复制类似阿尔茨海默氏病(AD)模型，以细胞MTT还原率、脂质过氧化产物(丙二醛，MDA)、神经型尼古丁受体α7蛋白表达等为活性指标，检测灯盏细辛各组分的不同配比组合物对抗β淀粉样肽(Aβ)对神经细胞的毒性作用。

灯盏细辛各组合物活性信息与其相应的指纹图谱化学信息可采用方差分析和相关性分析进行谱效相关性研究，灯盏细辛中、低极性组分段具有明显活性，其中所含的绿原酸、灯盏花苷、野黄芩苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、灯盏甲素、4，5-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰与抗β淀粉样肽对神经细胞毒性作用呈现正相关，为灯盏细辛脑神经保护作用的药效物质基础。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明在国内首次进行了灯盏细辛指纹图谱特征和药效相关性研究，利用数理统计方法将灯盏细辛不同配比组合物在指纹图谱上所体现的化学成分的变化和药效的变化建立了相关性。

(2)本发明在国内首次完成了灯盏细辛具有脑神经保护作用活性组分及活性成分的筛选，灯盏细辛中、低极性组分段具有明显活性，其中所含的绿原酸、灯盏花苷、野黄芩苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、灯盏甲素、4，5-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰为灯盏细辛脑神经保护作用的活性成分，经深入研究有望开发出灯盏细辛治疗老年性痴呆病的有效治疗药物，具有良好应用前景。

附图说明：

图1、灯盏细辛药材全样指纹图谱(2.飞蓬苷、4.绿原酸、7.灯盏花苷、8.野黄芩苷、9.3，4-二咖啡酰氧基奎宁酸、10.3，5-二咖啡酰氧基奎宁酸、11.灯盏甲素、12.4，5-二咖啡酰氧基奎宁酸)

图2、灯盏细辛药材高极性组分指纹图谱

图3、灯盏细辛药材中极性组分指纹图谱

图4、灯盏细辛药材低极性组分指纹图谱

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

1材料

1.1药物与试剂灯盏细辛药材产于贵阳市花溪区，由贵阳医学院生药学研究室鉴定为菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)hand-Mazz.的干燥全草；野黄芩苷、3，5-二咖啡酰氧基奎宁酸、绿原酸购于中国药品生物制品鉴定所，飞蓬苷、灯盏花苷、灯盏甲素、3，4-二咖啡酰氧基奎宁酸、4，5-二咖啡酰氧基奎宁酸等由贵阳医学院药学院提供(经H-NMR，C-NMR结构鉴定，HPLC归一化纯度＞95％)。乙腈(色谱纯，美国天地公司)；MCI GEL树脂(CHP20P，日本三菱化学)。D-MEM培养液购自Gibco Invitrogen公司(英国)；源于人脑的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y细胞)购于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司(德国)；羊抗α₇及鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体及HRP标记的抗羊及抗鼠二抗购自Santa Cruz Biotechnology Inc(美国)。聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus发光试剂、高效显影胶片购自Amersham公司。

1.2仪器WATERS超高效液相色谱(UPLC)ACQUITY系统，包括二元超高压溶剂系统、二极管阵列检测器、Empower2色谱工作站。

1.3灯盏细辛组分由贵阳医学院药学院制备提供，灯盏药材以乙醇提取，回收溶剂，加水定容为1g生药·mL^-1，冷藏，滤除不溶物。提取药液采用MCI树脂(甲醇-水梯度系统)划分为相对的高中低极性组分段，回收溶剂后，水定容到3g生药·mL^-1备用(A组分、B组分、C组分)。

2方法与结果

2.1供试样品制备按表1正交试验设计，调配9组由灯盏细辛各极性组分段所组成的配伍组分，混合均匀后统一定容到相同体积即可。

表1L₉(3⁴)正交试验因素水平

2.2配伍组分UPLC指纹图谱

2.2.1色谱条件WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×150mm，1.7μm)；流动相：0.1％磷酸溶液-乙腈，梯度洗脱(乙腈：0min～2min为4％，5min～6min为15％，9min为18％，14min为19％，18min为50％)；流速为0.35mL·min^-1；检测波长为300nm；柱温为45℃；进样前样品以甲醇稀释，滤过，进样量为1μL；。

2.2.2组分UPLC指纹图谱对灯盏细辛全样及各组分进行指纹图谱分析，对全样指纹图谱主要特征峰进行定位，共12个特征峰，其中指认8个(见图1-4)。

2.3灯盏细辛不同配伍组分对神经细胞的保护作用

2.3.1安全浓度筛查为筛选试验用样品的安全浓度，将灯盏细辛乙醇提取药液稀释为0.01mL·mL^-1～0.5mL·mL^-1，处理SH-SY5Y细胞后24小时后测定MTT还原率，以检测其对细胞是否具有毒性作用及其安全浓度范围。以灯盏细辛全样筛查安全浓度，当浓度＞0.1mL·mL^-1时SH-SY5Y神经细胞MTT还原率出现下降趋势，浓度＞0.2mL·mL^-1时细胞MTT还原率明显降低，表明浓度过高对细胞有毒性作用。因此选择0.05mL·mL^-1作为本次研究的安全浓度。

2.3.2细胞培养，β-淀粉样肽及灯盏细辛的处理：先用含15％胎牛血清的DMEM培养液培养SH-SY5Y细胞，待细胞生长稳定后，改用不含血清的DMEM培养液继续培养，培养箱中含5％CO₂，温度为37℃。在SH-SY5Y细胞中加入1μmol·L^-1的β-淀粉样肽Aβ_1-42，培养48小时。为观察灯盏细辛对Aβ毒性作用的影响，灯盏细辛各配伍组分培养24小时后，再加入1μmol·L^-1Aβ_1-42培养48小时。每个实验组均设6个复孔。

2.3.3MTT测定MTT是一种四甲基偶氮唑盐，经活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化可生成蓝紫色的还原型MTT，该产物在490nm波长处有极大的吸收峰。比色法测定MTT水平，常用来表示细胞的损伤程度和功能状况。

2.3.4MDA测定收集培养神经细胞的培养液，测定丙二醛(脂质过氧化的中间产物)含量，测定波长为532nm，操作按照试剂盒说明书进行。

2.3.5尼古丁受体亚单位蛋白表达测定参照Guan等的方法进行提取细胞膜蛋白及用西印迹(Western blotting)方法检测α₇nAChR亚单位蛋白水平。以β-Actin蛋白条带作为内参照，计算α₇nAChR蛋白条带与β-Actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为α₇nAChR蛋白质表达的相对水平比。

2.3.6指标测定结果见表2。

表2L₉(3⁴)正交设计配伍组分活性测试结果(n＝6)

注：各组配伍后分别定容到100mi，全样组直接取30ml定容到100ml。

2.4灯盏细辛组分活性方差分析

以SPSS 11.5统计学软件中General Linear Model→Univariate功能对数据进行分析处理，Between-Subjects Effects“主效应间检验”统计学检验结果，B、C组分对MTT指标(细胞损伤修复)有极显著性影响(B、C组分，P＜0.01)；B组分对MDA指标(脂质过氧化抑制)有极显著性影响(P＜0.01)；C组分对α₇nAChR蛋白表达有显著性影响(P＜0.05)。同时根据软件中SNK“一致性子集”分析，除C组分对MTT指标改善具有显著量效关系外(P＜0.05)，B、C组分对以上细胞生物学指标的影响均无明显量效关系。

2.5灯盏细辛化学成分谱效相关性分析

2.5.1利用SPSS11.5软件的双变量(Bivariate)相关分析方法，分析来源于各不同配伍组样品的12个特征色谱峰与生物活性指标的相关性。7～12号色谱峰与MTT及α₇nAChR蛋白表达指标相关显著，4号和7号色谱峰与MDA指标相关显著，且均呈现正相关关系(见表3)。研究结果提示4、7号色谱峰与对抗脂质过氧化相关，7～12号色谱峰与抑制细胞损伤和上调尼古丁受体表达相关。

表3各色谱峰与活性指标的相关系数

相关系数显著性：^*P＜0.05，^**P＜0.01

综合以上试验结果，灯盏细辛产生活性的主要成分可能为4号、7～12号色谱峰峰(分别为绿原酸、灯盏花苷、野黄芩苷、3，4-二咖啡酰氧基奎宁酸、3，5-二咖啡酰氧基奎宁酸、灯盏甲素、4，5-二咖啡酰氧基奎宁酸)；结合组分活性方差分析结果，以上物质峰亦主要出现在C组分段。可以推测，灯盏细辛对抗β淀粉样肽对神经细胞毒性作用的药效物质基础，主要集中于双咖啡酰类和黄酮类化合物。

Claims (7)

1.一种具有脑神经保护作用的灯盏细辛活性成分筛选方法，包括如下步骤：

(1)采用现代分离技术将分为不同极性的组分；

(2)将各组分按不同配比组成组合物；

(3)对组合物进行指纹图谱分析；

(4)对组合物进行神经细胞受损模型保护作用试验；

(5)将指纹图谱化学信息和药理活性信息数据经统计学处理，筛选出灯盏细辛中活性组分及活性成分。

2.根据权利要求1的筛选方法，其特征在于：灯盏细辛提取物是采用0-95％乙醇水溶液提取，回收溶剂，冷藏，滤除不溶物，即得。

3.根据权利要求1-2的筛选方法，其特征在于：灯盏细辛提取物可采用MCI柱、大孔树脂吸附柱、聚酰胺吸附柱、硅胶柱将其分为不同极性的组分。

4.根据权利要求1-3的筛选方法，其特征在于：将不同极性的各组分按正交设计、均匀设计、析因设计组成配比不同的组合物。

5.根据权利要求1-4的筛选方法，其特征在于：可采用HPLC或UPLC对组合物进行指纹图谱分析；

6.根据权利要求1-5的筛选方法，其特征在于：采用神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)神经细胞，经毒性蛋白(如β淀粉样肽)处理，复制类似阿尔茨海默氏病(AD)模型，以细胞MTT还原率、脂质过氧化产物(丙二醛，MDA)、神经型尼古丁受体α7蛋白表达等为活性指标，检测灯盏细辛各组分的不同配比组合物对抗β淀粉样肽(Aβ)对神经细胞的毒性作用。

7.根据权利要求1-6的筛选方法，其特征在于：将灯盏细辛各组合物活性信息与其相应的指纹图谱化学信息进行方差分析和相关性分析；利用谱效相关性研究发现，灯盏细辛中、低极性组分段具有明显活性，其中所含的绿原酸、灯盏花苷、野黄芩苷、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、灯盏甲素、4，5-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰与抗β淀粉样肽对神经细胞毒性作用呈现正相关，为灯盏细辛脑神经保护作用的药效物质基础。

Images