CN103630633A - 一种柱前衍生化法测定苦碟子注射液中6种氨基酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种柱前衍生化法测定苦碟子注射液中6种氨基酸含量的方法。属于中药成分分析领域。其步骤如下：（1）混合对照品溶液的配制：制成含脯氨酸217.0mg·L^-1，丙氨酸37.40mg·L^-1，缬氨酸44.40mg·L^-1，异亮氨酸39.80mg·L^-1，亮氨酸43.20mg·L^-1，苯丙氨酸42.20mg·L^-1的混合对照品溶液。（2）供试品溶液的配制。（3）色谱条件：DiamonsilC₁₈(2)色谱柱(200×4.6mm,5μm)；柱温：25℃；检测波长：350nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；流动相A：水；流动相B：30mmol/LNaAc，含1％N,N-二甲基甲酰胺，pH6.40；流动相C：乙腈；进行梯度洗脱。具有操作简便易行、准确度高、重现性好等优点，为苦碟子注射液的质量控制方法研究奠定了基础。

Description

一种柱前衍生化法测定苦碟子注射液中6种氨基酸含量的方法

技术领域　

本发明涉及一种柱前衍生化法测定苦碟子注射液中6种氨基酸含量的方法。属于中药成分分析领域。 

背景技术

在现有技术中，苦碟子别名满天星，苦荬菜，主要分布于我国东北及内蒙古等地，为菊科植物抱茎苦荬菜(Ixeris sonchifolia(Bge.)Hance)的当年生干燥全草，性寒，味苦、辛，具有清热解毒、排脓止痛之功效。苦碟子(碟脉灵)注射液是以苦碟子为原料提取精制而成的静脉注射液, 具有活血化瘀，改善微循环的作用^[2]。该注射液已上市多年，疗效确切。苦碟子注射液（曾用名：碟脉灵注射液）列入国家药品标准产品（国药准字Z20025450），由通化华夏药业有限责任公司生产。 

处方：抱茎苦荬菜1000g，制成1000ml。 

制法：取抱茎苦荬菜，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，浓缩至每1ml相当于原生药0.5g，放冷至40℃以下，在搅拌下加10%氧化钙乳调节pH值至10，放置12小时，离心，离心沉淀物称重，悬浮于5.3倍量95%乙醇中（使含醇量达80%），加50%硫酸溶液调节pH值至3－4，充分搅拌使反应完全，离心，离心液加40%氢氧化钠溶液中和pH值至7.0，滤过，滤液回收乙醇，并挥尽乙醇，用注射用水稀释至每1ml相当于原生药4g，置-5℃以下放置12小时以上，滤过，滤液加0.1－0.2%药用活性炭粉末，煮沸15分钟，置-5℃以下放置24小时以上，滤过，滤液加注射用水稀释至规定量，调节pH值至7.0－7.5，滤过，灌封，灭菌即得。性状：本品为浅黄棕色至黄棕色的澄明液体。 

含量测定：本品每10ml含总黄酮以无水芦丁（C₂₇H₃₀O₁₆）计，不得少于4.0mg。含抱茎苦荬菜以腺苷（C₁₀H₁₂N₅O₄）计，不得少于0.025mg。 

功能主治：活血止痛，清热祛瘀。用于瘀血闭阻的胸痹，证见：胸闷、心痛，口苦，舌暗红或存瘀斑等。适用于冠心病、心绞痛见上述病状者。亦可用于脑梗塞者。 

用法用量：静脉滴注，一次10－40ml，一日1次；用5%葡萄糖或0.9%氯化钠注射液稀释至250－500ml后应用；14天为一疗程；或遵医嘱。 

规格：每支装（1）10ml，（2）20ml，（3）40ml。 

药理研究表明，苦碟子注射液具有扩张冠状血管，改善心肌血氧供应，增加纤维蛋白溶血酶活性，抑制血栓形成的功能，临床应用中在脑梗塞，冠心病和心绞痛的治疗方面有重要的药用价值。中药注射剂是安全风险较高的品种，相关标准的要求较高，苦碟子注射液目前在质量控制方面的研究主要集中于黄酮类、糖类和有机酸类的含量测定，然而氨基酸类成分在苦碟子注射液中含量较大且有明确药效。目前中药中氨基酸含量测定方法主要为氨基酸自动分析仪分析法、高效液相色谱法（衍生高效液相色谱法、未衍生高效液相色谱法、毛细管电泳法等。其中氨基酸自动分析仪分析法仪器价格昂贵，毛细管电泳法方法复杂，因此本文建立了同时测定6种氨基酸的柱前衍生化方法并对苦碟子注射液中的氨基酸进行了含量测定，为全面评价其质量提供依据。 

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种采用柱前衍生化法测定苦碟子注射液中6种氨基酸含量的方法，方法简便、准确，可靠，同时为其质量控制提供方法学参考依据。 

本发明的技术解决方案是：一种柱前衍生化法测定苦碟子注射液中6种氨基酸含量的方法，其步骤如下： 

（1）混合对照品溶液的配制：

精密称取脯氨酸标准品4.34 mg，丙氨酸标准品3.74 mg，缬氨酸标准品4.44 mg，异亮氨酸标准品3.98 mg，亮氨酸标准品4.32 mg，苯丙氨酸标准品4.22 mg，分别置10 mL量瓶中，先加少量80%乙醇溶解再定容至刻度，摇匀，即得对照品储备液；分别精密吸取对照品储备液适量，制成含脯氨酸217.0 mg·L^-1，丙氨酸37.40 mg·L^-1，缬氨酸44.40 mg·L^-1，异亮氨酸39.80 mg·L^-1，亮氨酸43.20 mg·L^-1，苯丙氨酸42.20 mg·L^-1的混合对照品溶液。

（2）供试品溶液的配制： 

精密量取样品1.00 mL置10 mL量瓶中，加5%碳酸氢钠溶液1.00 mL与1% 2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1.00 mL，摇匀，60 ℃水浴中暗处加热30 min后取出；用0.0l mol/L KH₂P0₄ 溶液定容至10 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

（3）色谱条件： 

Diamonsil C₁₈(2)色谱柱(200×4.6 mm, 5 μm)；柱温：25 ℃；检测波长：350 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；流动相A：水； 流动相B：30 mmol/L NaAc，含1％N,N-二甲基甲酰胺，pH 6.40；流动相C：乙腈；进行梯度洗脱。

（4）进样测定。 

本发明的优点是：建立测定苦碟子注射液中6种氨基酸类成分――脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量的测定方法，具有操作简便易行、准确度高、重现性好等优点，衍生后剩余的DNFB及其衍生物对氨基酸的测定无干扰，该方法为苦碟子注射液的质量控制方法研究奠定了基础，提供了参考。 

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。上面或以下的描述，只是本发明的具体实施方式，各种举例说明不对本发明的实质内容构成限制。  

附图说明

图1是本发明空白溶液（A）的HPLC图。 

图2是本发明混合对照品溶液（B）的HPLC图。 

图3是本发明供试品溶液（C）的HPLC图。 

具体实施方式

   柱前衍生化法测定苦碟子注射液中6种氨基酸含量的方法： 

1.仪器和材料

Waters-e2695 高效液相色谱系统(含四元泵，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱，2998 光电二极管阵列检测器；Empower 2 色谱工作站；美国Waters公司)；BT125D型分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；THZ-82型水浴恒温振荡器(金坛市荣华仪器制造有限公司)；KH 2200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)

脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：140624-200805)；所有对照品纯度经HPLC峰面积归一化法计算均大于99%；乙腈(色谱纯，SIGMA公司)；甲醇(色谱纯，天津康科德科技有限公司)；水为超纯水；2,4-二硝基氟苯(天津一方科技有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(天津一方科技有限公司)；其他试剂均为分析纯。

苦碟子注射液(吉林通化华夏药业有限公司，批号：120625、110601、120312、120109、111105、120438、111011、120209、111218、120532) 

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的配制    精密称取脯氨酸标准品4.34 mg，丙氨酸标准品3.74 mg，缬氨酸标准品4.44 mg，异亮氨酸标准品3.98 mg，亮氨酸标准品4.32 mg，苯丙氨酸标准品4.22 mg，分别置10 mL量瓶中，先加少量80%(v/v)乙醇溶解再定容至刻度，摇匀，即得对照品储备液。分别精密吸取对照品储备液适量，制成含脯氨酸217.0，丙氨酸37.40，缬氨酸44.40，异亮氨酸39.80，亮氨酸43.20，苯丙氨酸42.20 mg·L^-1的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的配制    精密量取样品1.00 mL置10 mL量瓶中，加5%碳酸氢钠溶液1.00 mL与1% 2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1.00 mL，摇匀，60 ℃水浴中暗处加热30 min后取出。用0.0l mol/L KH₂P0₄ 溶液定容至10 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。 

2.3 色谱条件    Diamonsil C₁₈(2)色谱柱(200×4.6 mm, 5 μm)；柱温：25 ℃；检测波长：350 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。流动相A：水； 流动相B：30 mmol/L NaAc(含1％N,N-二甲基甲酰胺)，pH 6.40；流动相C：乙腈；按“表1”进行梯度洗脱。 

表1  流动相洗脱梯度 

Table.1  Gradient elution of the mobile phase

Time(min)	A（％）	B（％）	C（％）
				0	10	68	22
6	10	64	26
				6.1	10	62	28
20	10	55	35

参见图1、2、3，色谱峰：1脯氨酸，2丙氨酸，3缬氨酸，4异亮氨酸，5亮氨酸，6苯丙氨酸。

2.4专属性试验及系统适用性试验    在2.3色谱条件项下，空白溶液，脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸在混合对照品溶液及苦碟子注射液供试品溶液中的HPLC图见图1。除脯氨酸外，丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸达到基线分离，各色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按丙氨酸峰计算大于3000，拖尾因子0.95～1.05。 

2.5  线性关系考察    精密吸取2.1项下混合对照品溶液1 mL，加入80%(v/v)乙醇溶液1 mL，摇匀，再精密量取该稀释溶液1 mL，按上述步骤逐级稀释，即得混合对照品的系列对照溶液。将溶液按2.2项下供试品的制备方法进行衍生，然后将溶液按2.3项下色谱条件进行测定，记录色谱图和峰面积。分别以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标，进行线性回归，得出各个氨基酸的回归方程及相关系数，见表2。 

表2  6种氨基酸的回归方程、相关系数及线性范围 (n=6) 

Table 2  Regression equation, correlation coefficient and linear range of six amino acids (n=6)

化合物	回归方程	r	线性范围/mg·L-1
				脯氨酸	Y = 4.917×104X+1.962×104	0.9996	0.678-21.7
丙氨酸	Y = 1.119×105X-1.348×103	0.9994	0.117-3.74
				缬氨酸	Y = 7.888×104X-2.687×103	0.9995	0.139-4.44
异亮氨酸	Y = 7.055×104X-2.458×103	0.9997	0.124-3.98
				亮氨酸	Y = 7.506×104X-2.848×103	0. 9994	0.135-4.32
苯丙氨酸	Y = 5.552×104X- 3.208×103	0.9996	0.132-4.22

2.6 精密度试验    按2.1项下方法制备含脯氨酸43.40 mg·L^-1、丙氨酸7.480 mg·L^-1、缬氨酸8.880 mg·L^-1、异亮氨酸7.960 mg·L^-1、亮氨酸8.640 mg·L^-1、苯丙氨酸8.440 mg·L^-1的混合对照品溶液，按2.3项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸峰面积的RSD分别为0.28%、0.4  4%、0.30%、0.39%、0.97%、0.39%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验    取苦碟子注射液（批号：110601）按2.2项下方法制备供试品溶液6份，室温放置，分别于放置后0h，0.5h，1h，2h，4h，6 h 取样，按2.3项下色谱条件进样测定，记录峰面积。脯氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸0.5 h后峰面积的RSD分别为1.7%、9.5%和5.5%，亮氨酸、异亮氨酸1 h后峰面积的RSD分别为2.0%和1.2%；缬氨酸6 h后峰面积的RSD为5.0%；表明供试品溶液在0.5 h后不稳定，实验中所需样品应新用新制。 

2.8 重复性试验    取6份苦碟子注射液（批号：110601）1.0 mL，按2.1项下方法平行制成供试品溶液，按2.3项下色谱条件进样测定，计算重复性。脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量分别为4.658、1.039、0.6812、0.4159、0.3159、0.2678 mg·L^-1，RSD分别为0.4%、2.3%、1.3%、1.2%、2.3%、2.0%。结果表明，该方法重复性良好。 

2.9 加样回收率试验    精密量取已知含量的苦碟子注射液（批号：110601）0.5 mL，平行6份，分别置于10 mL量瓶中，分别精密加入含有一定质量氨基酸的混合对照品溶液，其中脯氨酸21.82 μg、丙氨酸4.710 μg、缬氨酸2.562 μg、异亮氨酸1.592 μg、亮氨酸1.728 μg、苯丙氨酸1.266 μg，按2.2项下方法制成供试品溶液，按2.3项下色谱条件进样分析，记录峰面积，每种氨基酸分别计算加样回收率，结果见表3。 

表3  苦碟子注射液中6种氨基酸的加样回收率(n=6) 

Table 3  Recoveries rate of six amino acids (n=6)

2.10含量测定    取苦碟子注射液1.00 mL，按2.2项下方法制备10批不同批号的注射液为供试品溶液，按2.3项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算6种氨基酸类化合物的含量，结果见表4。

表4  苦碟子注射液中6种氨基酸的质量浓度 (n=10) 

Tab 4 Content of six amino acids in Kudiezi injection   C (mg·L^-1)

批号	脯氨酸	丙氨酸	缬氨酸	异亮氨酸	亮氨酸	苯丙氨酸
							120625	55.91	13.40	6.955	3.755	3.250	2.378
110601	47.08	9.820	7.067	4.375	3.034	2.854
							120312	58.17	8.063	6.304	3.771	2.918	2.319
120109	48.35	9.755	6.556	4.274	3.453	2.508
							111105	50.94	11.05	7.218	4.429	3.448	2.559
120438	55.63	8.420	5.611	3.190	2.922	2.365
							111011	45.42	9.705	6.805	3.859	3.304	2.538
120209	70.11	10.81	9.001	5.103	3.936	3.375
							111218	39.95	7.797	5.999	3.446	2.843	2.381
120532	58.87	10.69	7.613	4.447	3.542	3.036
							RSD（%）	16	17	14	14	11	13

3 讨论与结论

在梯度洗脱条件下，流动相pH值及比例、衍生化试剂DNFB的用量是保证HPLC法测定氨基酸具有良好重现性的关键环节。第一，结合本试验中所需分离的氨基酸特征，选择pH=6.4，分离效果良好。第二，流动相比例选择固定超纯水用量，线性调整乙腈和盐溶液用量可在保证洗脱能力的条件下减小对色谱仪比例阀的要求和损伤。由于氨基酸的极性不同，用同一梯度分离多种氨基酸，保留时间相差很大，导致分析时间过长，出峰效果不好。经试验确定了最佳条件，使6种氨基酸和衍生化试剂及其衍生物在较短的时间内被分离。第三，以DNFB为衍生化试剂，若加入量过少，则衍生不完全，影响含量测定结果的准确性；若加入量过多则会使衍生化试剂及副产物峰过大，影响色谱行为并对色谱柱造成伤害。实验中加入量为1.0mL，结果较理想。

由于衍生化试剂与氨基酸反应的产物较不稳定，故本试验中所有样品均新用新制，及时进行含量测定，但是因此回收率试验中样品含量实测值与按照估计值添加的标品量有所偏差，进一步导致部分氨基酸回收率偏高，回收率范围要求可适当扩大。 

通过对含量测定结果的分析我们可以看出，不同批次注射液中氨基酸含量差异很大，提示我们应该进一步建立药材中的氨基酸含量测定方法，并对药材质量进行全面有效地控制，以期更好地控制注射液质量。 

采用DNFB柱前衍生HPLC法测定苦碟子注射液中6种氨基酸的含量，具有操作简便易行、准确度高、重现性好等优点，衍生后剩余的DNFB及其衍生物对氨基酸的测定无干扰，该方法为苦碟子注射液的质量控制方法研究奠定了基础。 

Claims (1)

1.一种柱前衍生化法测定苦碟子注射液中6种氨基酸含量的方法，其特征在于其步骤如下：

（1）混合对照品溶液的配制：

精密称取脯氨酸标准品4.34 mg，丙氨酸标准品3.74 mg，缬氨酸标准品4.44 mg，异亮氨酸标准品3.98 mg，亮氨酸标准品4.32 mg，苯丙氨酸标准品4.22 mg，分别置10 mL量瓶中，先加少量80%乙醇溶解再定容至刻度，摇匀，即得对照品储备液；分别精密吸取对照品储备液适量，制成含脯氨酸217.0 mg·L^-1，丙氨酸37.40 mg·L^-1，缬氨酸44.40 mg·L^-1，异亮氨酸39.80 mg·L^-1，亮氨酸43.20 mg·L^-1，苯丙氨酸42.20 mg·L^-1的混合对照品溶液；

（2）供试品溶液的配制：

精密量取样品1.00 mL置10 mL量瓶中，加5%碳酸氢钠溶液1.00 mL与1% 2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1.00 mL，摇匀，60 ℃水浴中暗处加热30 min后取出；用0.0l mol/L KH₂P0₄ 溶液定容至10 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

（3）色谱条件：

Diamonsil C₁₈(2)色谱柱200×4.6 mm, 5 μm；柱温：25 ℃；检测波长：350 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；流动相A：水； 流动相B：30 mmol/L NaAc，含1％N,N-二甲基甲酰胺，pH 6.40；流动相C：乙腈；进行梯度洗脱；

（4）进样测定。

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