KR20090081461A - 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산동시분석 방법 - Google Patents

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Abstract

액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법으로서, 녹차 등의 분석대상 시료 내의 아미노산 성분들을 액체크로마토그래피(LC)의 고정상 및 이동상을 적절하게 선택함으로써 동시에 신속하고 정확하게 분석하는 방법이 개시된다. 상기 동시분석법은 간편하면서도 재현성, 정확성이 뛰어나고, 분석시간, 비용 측면에서 효율적이라는 장점이 있다.
아미노산, 히스티딘, 아스파라긴, 세린, 글루타민, 아르기닌, 글리신, 아스파르트산, 글루타민산, 트레오닌, 알라닌, 감마 아미노부티릭산, 데아닌, 프롤린, 시스테인, 리신, 티로신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 트립토판, 액체크로마토그래피(LC), 녹차

Description

액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법 {Simultaneous Determination for two or more amino acids using Liquid Chromatography}
본 발명은 두 종 이상의 아미노산들을 동시에 분석하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 시료 내의 다양한 아미노산 성분들을, 액체크로마토그래피(LC)의 고정상 및 이동상을 적절하게 선택함으로써, 동시에 신속하고 정확하게 분석하는 방법에 관한 것이다.
최근 녹차의 확산과 더불어 녹차의 성분과 효능에도 관심이 높아지고 있으며, 그와 관련한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 현재까지 알려진 녹차의 구성성분으로는 단백질, 아미노산, 카페인, 카테킨, 당질, 유기산, 비타민류 및 각종 미네랄 등의 50 여종이 넘는 유기화합물들이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 그 중에 녹차의 맛과 향을 좌우하는 결정적인 성분으로는 카테킨류와 아미노산류 등을 들 수 있다. 이러한 성분들의 함량 비율은 녹차의 종류 외에도 재배조건이나 차잎의 채엽시기 등에 따라 크게 달라지는 것으로 알려져 있다. 카테킨 성분이 많아지면 상대적으로 떫고 쓴맛이 강해지게 되고, 아미노산 성분의 함량은 감칠맛과 단맛 에 영향을 주게 된다.
다양한 종류의 아미노산 중에서 특히, 데아닌은 녹차의 독특한 풍취를 제공하는 결정하는 요소이다. 이러한 데아닌의 함량은 차잎이 어릴수록 많아지며, 데아닌의 함량이 높을수록 상대적으로 고급차로 분류되는 실정이다. 또한, 최근에는 데아닌과 감마 아미노부티릭산이 인간의 두뇌 활동과 수면의 질에 영향을 미치는 것으로 알려지면서, 이러한 성분들의 함량 비율이 녹차 등의 종류를 선별함에 있어서 중요한 기준으로 부각되고 있다. 이 밖에도, 단-감칠맛을 내는 유리아미노산, 신-감칠맛을 내는 글루타민산과 아스파라긴산, 그리고 쓴-감칠맛을 내는 알기닌 등의 필수아미노산이 있으며, 이러한 성분들의 함량 역시 녹차의 풍미와 맛이 결정하는 요소로 작용한다.
위에서 살펴본 바와 같이, 다양한 아미노산 성분들의 함량은 녹차의 품질을 결정하는 중요한 요인으로 작용한다. 이러한 아미노산 성분들의 함량을 높이기 위해서 다양한 노력과 시도들이 행해진다. 예를 들어, 차잎을 따기 전에 검은 망을 쳐서 직사광선을 차단하거나, 생옆을 따서 여러 종류의 효소처리 과정을 통해 아미노산의 분해를 억제하기도 한다. 혹은 건조 온도와 건조 시간을 최적의 조건으로 설정하여 아미노산 함량이 풍부한 녹차를 제조하고자 한다.
그러나, 종래의 아미노산 분석방법들은 개별적인 아미노산 성분에 대한 분석방법만을 제공하고 있기 때문에, 녹차 내에 포함되어 있는 다양한 아미노산들에 대한 동시적이면서도 신속한 분석에 어려움이 있었다. 또한, 녹차의 최적 가공조건(효소 처리조건, 건조 조건)을 설정하거나 녹차의 맛을 객관적으로 평가하는 기준 을 마련하는데 있어서 어려움이 많은 실정이었다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 발명자들은 심도 있는 연구와 다양한 실험들을 계속한 끝에, 액체크로마토그래피(LC)의 고정상 및 이동상을 적절하게 조절할 경우, 녹차 등의 시료 내에 포함된 다양한 종류의 아미노산 성분들을 동시에 분석할 수 있으며, 녹차의 최적 가공조건(효소 처리조건 또는 건조 조건 등)을 설정하거나 녹차의 맛을 객관적으로 평가하는 데 있어서 기준이 되는 아미노산 동시분석 방법을 제공할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 두 종 이상의 아미노산 성분들을 동시에 분석하는 방법으로서, (A) 두 종 이상의 아미노산을 함유하는 시료로부터 아미노산 성분을 분리하여 형광시약으로 유도체화하는 단계; (B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체크로마토그래피(LC)의 컬럼에 상기 유도체화된 시료를 주입하는 단계; 및 (C) 액체크로마토그래피의 이동상으로서 유기용매와 수용액의 혼합용매를 흘려주는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 동시분석 방법은 다양한 종류의 아미노산 성분들에 대하여 높은 분리도를 가지고 신속하게 분석할 수 있고, 보다 경제적이면서 효과적으로 분석할 수 있다. 또한, 녹차 중의 아미노산 함량분석을 통해 아미노산 함량이 높은 녹차의 최적 가공조건(효소 처리조건 또는 건조 조건 등)을 설정하거나 녹차의 맛을 객관적으로 평가하는 방법으로 효과적으로 응용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법은,
(A) 두 종 이상의 아미노산을 함유하는 시료로부터 아미노산 성분을 분리하여 형광시약으로 유도체화하는 단계;
(B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체크로마토그래피(LC)의 컬럼에 상기 유도체화된 시료를 주입하는 단계; 및
(C) 액체크로마토그래피의 이동상으로서 유기용매와 수용액의 혼합용매를 흘려주는 단계를 포함하는 것으로 구성되어 있다.
분석 대상 시료 중에 포함된 아미노산은 하나 또는 그 이상의 종을 포함할 수 있으며, 이러한 다수 종의 아미노산들은 컬럼 내의 충진제에 대한 친화력의 차이에 의해 컬럼 통과시간을 달리하게 된다. 일반적으로, 아미노산은 염기성을 띠는 아미노기(-NH2)와 산성을 띠는 카르복시기(-COOH) 및 유기 원자단인 R기(또는 곁가지)로 구성된 유기화합물이다. 이 3가지 작용기에 따라 각 아미노산 특유의 구조가 만들어지며, 각각 다른 화학적 특성을 가지게 된다. 화학적 특성에 따라 각 아미노산의 고유한 특징인 극성 상태의 차이가 나타나게 되고, 극성의 차이는 충진 제에 대한 친화력을 결정하는 요소가 되기 때문에 컬럼을 통과하는데 걸리는 시간, 즉 용리 시간(retention time)의 각 아미노산 별로 달리 나타나게 된다.
상기 컬럼을 통과한 아미노산들은 용리 시간에 따라 차례대로 자외부흡광광도계(UV) 상에서 흡광도의 증가인 피크(peak)를 통해 검출된다. 검출된 아미노산들은 표준 물질과의 용리 시간 비교에 의해 성분 확인이 이루어지며(정성 분석), 피크의 높이 또는 면적에 의해 시료 내에 포함된 각 종류별 아미노산의 양이 계산된다(정량 분석).
본 발명에 따라 분석 가능한 아미노산의 종류는, 특별한 제한은 없으나, 히스티딘, 아스파라긴, 세린, 글루타민, 아르기닌, 글리신, 아스파르트산, 글루타민산, 트레오닌, 알라닌, 감마 아미노부티릭산, 데아닌, 프롤린, 시스테인, 리신, 티로신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 또는 트립토판으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 두 종류 이상의 아미노산인 것이 바람직하다.
하나의 바람직한 실시예에서, 상기 시료는 다양한 종류의 차(tea) 종류 일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 시료가 녹차, 홍차 또는 커피 일 수 있으며, 이 경우에는 상기 (A) 단계에서 시료로부터 아미노산 성분들을 추출하는 과정에서 물을 추출 용매로 사용할 수 있다.
추출된 아미노산 성분들은 분자 내에 특별한 자외선흡수 기능기가 없고, 형광성 물질이 아니므로 자외부흡광광도계(UV)를 이용한 분석방법은 그대로 적용하기 어렵다는 문제점이 있다. 따라서, 형광시약을 이용하여 유도체화라는 전처리 과정을 거치게 되며, 유도체화 하기 위한 형광시약으로는 Ninhydrin, OPA(ortho- phthaladehyde), PITC(phenylisothocyanate), FMOC(Fluorenylmethoxycarbonyl chloride) 및 AccQ-Tag(6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate) 등이 가능하다. 다만, Ninhydrin와 OPA 방법은 유도체화된 화합물이 불안정하기 때문에 시간이 경과함에 따라 함량이 감소하여 정확한 분석을 저해한다는 단점이 있고, PITC와 FMOC 방법은 불순물이 과량 생성되어 22종 아미노산에 대한 분리도가 낮아질 수 있다는 단점이 있다. 따라서, 바람직하게는 AccQ-Tag(6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate)를 형광시약으로 사용할 수 있다.
22 종의 아미노산 성분들은, 염기성을 띠는 아미노기(-NH2)와 산성을 띠는 카르복시기(-COOH) 및 유기 원자단인 R기(또는 곁가지)로 구성된 유기화합물로서, 유기 원자단인 R기(또는 곁가지)에 의해 극성 차이를 보이게 된다. 그러나, 상기 아미노산들의 대부분이 극성보다는 비극성 성질이 강하기 때문에 고정상으로 비극성 컬럼이 적합하다.
따라서, 상기 (B) 단계에서 사용되는 컬럼은, 바람직하게는, 고정상으로 비극성을 갖는 옥타데실실란(C18), 도데실실란(C12) 또는 옥타실란(C8) 등으로 충진된 역상 비극성 컬럼일 수 있다. 다만, 도데실실란(C12) 또는 옥타실란(C8) 컬럼을 사용할 경우에는, 화학적 성질이 비슷한 성분들끼리 겹쳐져서 분리도가 감소하는 경우가 발생될 수 있기 때문에, 정확한 분석을 위해서는 상대적으로 비극성 성질이 강한 옥타데실실란(C18) 컬럼이 가장 바람직하다. 옥타데실실란(C18) 컬럼은, 컬럼 내부에 비극성인 탄소 18 개 체인이 충진되어 있는 것으로, 극성성분은 비극성의 컬럼 작용기와 결합하지 않기 때문에 빠르게 용출되고 비극성성분은 비극성 작용기와 결합하여 상대적으로 천천히 용출된다.
상기 컬럼의 규격은 통상적으로 사용되는 범위 내에서 가능하다. 그러나, 컬럼의 길이와 내경 및 입자사이즈는 분석시간 및 분리도와 관계가 있는 것이므로, 신속성과 선택성을 고려하여 적절한 범주에서 사용하는 것이 바람직하다. 하나의 예로서, 상기 컬럼의 규격은, 분리 효율을 고려할 때, 컬럼 길이는 8 내지 12 cm, 컬럼 내경은 2.0 내지 2.2 mm, 그리고 컬럼 입자사이즈는 1.5 내지 1.7 ㎛의 범위 내에서 선택할 수 있다. 특히, 옥타테실실란(C18) 컬럼의 경우에는, 컬럼 길이는 10 cm, 컬럼 내경은 2.1 mm, 그리고 컬럼 입자사이즈는 1.7 ㎛가 바람직하다.
상기 (C) 단계에서, 액체크로마토그래피의 이동상으로는 통상적으로 이용되는 에탄올, 메탄올 또는 아세토나이트릴 등과 같은 다양한 종류의 유기용매들이 사용 가능하다. 다만, 상기 유기용매들만을 사용한 경우에는 몇몇 극성도가 비슷한 아미노산 성분들이 분리되지 않는 경우가 발생하였다.
이러한 문제점을 해결하기 위해서, 하나의 실시예에서, 상기 이동상으로 유기용매에 수용액을 일정비율로 섞은 혼합용매를 사용하였으며, 상기 유기용매는 극성도가 상대적으로 낮은 아세토나이트릴일 수 있다. 또한, 하기 실험예 등을 통해, 아세토나이트릴에 수용액인 물을 여러 비율로 혼합하여 분석조건을 조절했을 때 60% 아세토나이트릴(아세토나이트릴 : 물 = 60 : 40) 혼합용매를 사용한 경우, 22 종의 아미노산 성분들에 대하여 가장 높은 분리도를 나타냄을 알 수 있었다.
다만, 상기와 같이, 이동상으로 60% 아세토나이트릴 혼합용매를 사용할 경우 에는, 수용성 용매로 물을 사용함에 따라서 몇몇 아미노산 성분들의 피크가 비극성이거나 피크 분리가 관찰될 수 있다. 이러한 문제점들은 0.2% 포믹산(formic acid)를 사용하여 pH를 조절함으로써 해결 가능하며, 이때 염기성인 아미노기(-NH2)와 산성인 카르복시기(-COOH) 등에 대한 적합한 완충용액으로 20 mM 암모늄포메이트(ammonium formate)가 바람직하게 사용될 수 있다.
또 다른 하나의 바람직한 실시예에서, 상기 (C) 단계에서 이동상으로는, 22종 아미노산을 겹치지 않고 선택성 있게 동시에 이동시킬 수 있도록 하기 위하여, 유기용매인 60% 아세토나이트릴(아세토나이트릴 : 물 = 60 : 40) : 20 mM 암모늄포메이트를 시간에 따른 최적의 혼합부피인 0.1 : 99.9 내지 100 : 0로 혼합된 용매를 사용할 수 있다.
상기 60% 아세토나이트릴과 20 mM 암모늄포메이트의 시간에 따른 혼합 부피는 용리 시간에 따라서 적절한 범주 내에서 조절 가능하다. 바람직하게는, 용리 시간에 따른 혼합 부피는, 제 1 단계에서는 0.1 : 99.9 내지 1 : 99이고, 제 2 단계에서는 9.0 : 91 내지 25 : 75이고, 제 3 단계에서는 100 : 0 내지 90 : 10 그리고 제 4 단계에서는 5 : 95 내지 15 : 85일 수 있다. 상기 각 단계별 시간은 특별한 제한 없이 적용 가능하며, 본 발명에 따른 하나의 실시예에서, 전체 용리 시간을 10 분으로 할 경우에, 제 1 단계는 최초 5분, 제 2 단계는 5 분에서 8 분, 제 3 단계는 8 분에서 8.2 분 그리고 제 4 단계는 8.2 분 이후 시간으로 표현될 수 있다. 이러한 용리 시간대별 혼합 부피(60% 아세토나이트릴 : 20 mM 암모늄포메이 트)는 22 종의 아미노산 성분들의 피크들이 겹치지 않고 최적으로 분리될 수 있는 조건을 고정상과 이동상 및 성분들의 극성차이를 고려하여 설정한 것이다.
위와 같은 분석방법을 통하여, 예를 들어, 녹차 중 아미노산의 함량으로 녹차의 품질을 확인할 수 있고, 효소처리 및 건조온도 등 최적 가공조건을 설정 할 수 있으며, 특정 아미노산의 함량으로부터 녹차의 맛을 객관적으로 평가할 수 있다. 또한, 아미노산 성분 중에서 차의 맛을 결정하는 아미노산 성분으로는 데아닌, 글루타민산, 아르기닌, 아스파르트산, 감마 아미노부티릭산 등이 알려져 있으며, 이러한 아미노산 성분들의 함량분석을 통해 차의 풍미를 결정할 수 있는 비율과 함량에 대한 기준을 설정할 수 있다.
이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상술하지만, 하기 실험예 및 실시예 등은 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
[실험예 1] 분석을 위한 최적 조건 선정
분석대상 시료 내에 포함된 22 종의 아미노산에 대하여 높은 분리도를 가지고 정확하게 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하여 최적 조건을 결정하였다.
1-1. 분석방법의 선정
분석대상 시료 중 아미노산 성분을 물로 추출한 후, AccQ-Tag 시약을 이용하여 유도체화 하였다. 그럼 다음, 시료 내에 포함된 아미노산 성분들을 고성능 액 체크로마토그래피(UPLC)에 자외부흡광광도계(UV)를 이용한 방법을 적용하였다.
1-2. 최적의 컬럼 선정
22 종의 아미노산들은 염기성을 띠는 아미노기(-NH2)와 산성을 띠는 카르복시기(-COOH) 및 유기 원자단인 R기(또는 곁가지)로 구성된 유기화합물로서, 유기 원자단인 R기(또는 곁가지)에 의해 극성 차이를 보이게 된다. 상기 아미노산들의 대부분이 극성보다는 비극성 성질이 강하기 때문에 고정상으로 비극성 컬럼이 적합한 것으로 판명되었으며, 특히 상대적으로 비극성 성질이 강한 옥타데실실란(C18)으로 충진된 컬럼을 선택하였다. 사용된 컬럼의 규격은, 분리도와 신속성을 고려하였는 바, 컬럼 길이는 10 cm, 컬럼 내경은 2.1 mm, 컬럼 입자사이즈는 1.7 ㎛로 하였다.
1-3. 분리도 향상을 위한 이동상 조건 설정
다양한 유기용매들 중에서 극성도가 가장 낮은 아세토나이트릴에 물을 여러 비율로 혼합하여 분석조건을 조절하여 실험을 실시하였다. 결과적으로, 아세토나이트릴과 물을 60 : 40의 비율로 혼합하여 제조한 혼합용매를 사용한 경우에 가장 높은 분리도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
또한, 아세토나이트릴의 수용액 용매로 물을 사용함과 동시에 20 mM 암모늄포메이트(ammonium formate)를 완충용액으로 사용하였고, 0.2% 포믹산(formic acid)를 이용하여 pH를 조절하였다.
22 종의 아미노산 성분들의 피크들이 겹치지 않고 최적으로 분리될 수 있는 조건을 고정상과 이동상 및 성분들의 극성 차이를 고려하여 설정하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같다.
[표 1]
시간(분) 60% 아세토나이트릴 (%) 20 mM 암모늄포메이트 (%)
0 0.1 99.9
0.54 0.1 99.9
5.74 9.1 90.9
7.74 21.2 78.8
8.04 100 0
8.64 10 90
8.73 10 90
1-4. 분석을 위한 최적 조건
상기 1-1 내지 1-3의 조건하에서, 분석대상 시료를 고성능 액체크로마토그래피(UPLC)/자외부흡광광도계(UV)를 이용하여 분석하였다. 시료로부터 분리해 낸 아미도산 성분들을 AccQ-Tag 시약으로 유도체화 한 다음, 액체크로마토그래피에 주입시키고, 고정상으로는 AccQ-Tag Ultra(길이: 10 cm, 내경: 2.1 mm, 입자사이즈: 1.7 ㎛) 컬럼, 이동상으로는 60% 아세토나이트릴과 20 mM 암모늄포메이트를 사용하였다. 이동상의 유속은 0.7 mL/분이고, 시료 주입량은 1 ㎕이며, 자외부흡광광도계 파장은 260 nm에서 분석하였다. 분석시 컬럼의 온도는 60℃로 조절하였다. 이하, 본 발명에 따른 실시예들은 하기 표 2의 조건에서 수행되었다.
[표 2]
컬럼 AccQ-Tag Ultra C18 컬럼(2.1 mm x 10 cm, 1.7 ㎛)
이동상 용매 a(60% 아세토나이트릴):용매 b(20 mM 암모늄포매이트)
이동상조건 시간(분) a (%) b (%)
0.0 0.1 99.9
0.54 0.1 99.9
5.74 9.1 90.9
7.74 21.2 78.8
8.04 100 0
8.64 10 90
8.73 10 90
유속 0.7 mL/min.
온도 60℃
주입량 1 ㎕
검출파장 260 nm
[실험예 2] 22종 아미노산의 동시분석
상기 실험예 1에서 선정한 최적 조건을 이용하여, 시료 내에 존재하는 22종 아미노산 성분들을 동시에 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
2-1. 분석기기( UPLC - UV )
본 발명에 따른 실험예 및 실시예에서는, 액체크로마토그래피는 워터스(Waters)사의 UPLC을 사용하였으며, 여기에 자외부흡광광도계(UV)가 연결된 시스템을 사용하였다. 컬럼은 워터스(Waters)사의 AccQ-Tag 컬럼(2.1 mm x 10 cm)을 연결하여 사용하였고, 데이터 처리는 워터스사의 Empower II 프로그램을 사용하였다.
또한, 22종 아미노산의 표준품으로부터 얻어진 액체크로마토그램을 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하면, 아미노산의 용출 순서는 His-Asn-Ser-Gln-Arg-Gly-Asp-Glu-Thr-Ala-GABA-The-Pro-Cys-Lys-Tyr-Met-Val-Lle-Leu-Phe-Trp의 순임을 확인할 수 있다.
2-2. 표준품
6종 자외선차단 성분 동시분석에 사용되는 표준품은 하기 표 3과 같다.
[표 3]
성분명 INCI 약어 제조사 Lot No.
히스티딘 Hisdidine His Sigma 70K0075
아스파라긴 Asparagine Asp 10K5406
세린 Serin Ser 20K0412
글루타민 Glutamine Gln 50K0237
아르기닌 Argine Arg 35K1821
글리신 Glycine Gly 128H1419
아스파르트산 Aspartic acid Asn 80K1052
글루타민산 Glutamic acid Glu 30K0436
트레오닌 Threonine Thr 20K0338
알라닌 Alanine Ala 27H0548
감마 아미노부티릭산 Gamma-Aminoburytic acid GABA 045K00721
데아닌 Theanine The 태양화학 -
프롤린 Proline Pro Sigma 80K0621
시스테인 Cysteine Cys 70K0351
리신 Lysine Lys 80K0617
티로신 Tyrosine Tyr 99H0113
메티오닌 Methionine Met 20K0340
발린 Valine Val 30K0332
이소류신 Isoleucine lle 59H07111
류신 Leucine Leu 39F0706
페닐알라닌 Phenylalanine Phe 60K0873
트립토판 Tryptophane Trp 10K0893
[실시예 1] 녹차 중 22 종 아미노산의 동시분석
시중에서 상용화되고 있는 일본산 녹차(A)와 국내산 녹차(B)를 대상으로 본 발명에 따른 아미노산 동시분석 실험을 실시하였다. 먼저, 각각의 시료들(A, B)을 약 1 g씩 취하고, 이들을 각각 60℃ 물로 30분 동안 초음파를 이용하여 아미노산 성분을 추출하고 잘 분산시켰다. 그럼 다음, 0.2 ㎛ PVDF 멤브레인 필터로 여과하고, AccQ-Tag 시약으로 유도체화하였다. 유도체화 된 시료 용액들 각각 1 ㎕씩을 고성능 액체크로마토그래피/자외부흡광광도계에 주입하고 분석하였다.
분석 결과로 나온 크로마토그램들은 각각 하기 도 2a(일본산 녹차, A)와 도 2b(국내산 녹차, B)에 도시하였으며, 농도 측정 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
[표 4]
아미노산 성분 아미노산 농도(㎍/g)
일본산 녹차(A) 국내산 녹차(B)
Ser 180.445 193.477
Gln 887.379 929.707
Arg 1437.371 383.359
Asp 501.791 626.579
Glu 699.927 935.125
Thr 75.219 78.023
Ala 81.663 84.87
GABA 397.023 521.467
The 5071.293 4351.018
Lys 41.332 44.547
Tyr 70.420 81.686
Met 75.074 105.734
Val 71.956 103.283
Leu - 42.916
Phe - 102.025
Trp - 80.252
분석된 아미노산 성분들을 정량하기 위한 검량곡선은 0.5∼18 ㎍/㎖의 범위에서 작성되었으며, 22 종 모두 R=0.99이상의 양호한 직선성을 나타내었음을 도 3a(일본산 녹차, A)와 도 3b(국내산 녹차, B)를 통해 확인할 수 있다. 또한, 분석결과 녹차 중에 존재하는 22종 아미노산의 검출한계는 약 0.1 ㎍/g이었다.
한편, 시료 중의 함량분석 결과를 확인하기 위하여, 22종 아미노산 중에서 함량을 알고 있는 감마 아미노부티릭산과 데아닌 성분을 녹차 추출물에 일정량의 표준품을 첨가하여 분석함으로써 회수율을 구하였다. 하기 표 5에는 녹차 중의 감마 아미노부티릭산과 데아닌 성분의 초기농도, 첨가된 표준품의 농도 및 회수율 결과가 나타나 있다.
[표 5]
화합물 초기농도 (㎍/㎖) 첨가한양 (㎍/㎖) 측정된 양 (㎍/㎖) 회수율(%)
감마 아미노부티릭산 397.0 100.8 497.5 99.8
50.4 446.8 99.9
25.2 423.0 100.2
데아닌 5071.3 512 5587.9 100.1
256 5326.3 100.0
128 5197.3 100.0
상기 표 5를 통해서, 감마 아미노부티릭산과 데아닌의 경우에는 ±0.2%의 오차 범위 내에서 전량 회수되고 있음을 확인할 수 있다.
[실시예 2] 홍차 중에서 22종 아미노산의 동시분석
시중에서 상용화되고 있는 홍차를 대상으로 각 시료들(홍차 C, D)을 약 1 g씩 취하여 60℃ 물로 30 분 동안 초음파로 추출하여 잘 분산시켰다. 그런 다음, 0.2 ㎛ PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 AccQ-Tag 시약으로 유도체화한 후, 각각의 시료용액 1 ㎕씩(C, D)을 고성능 액체크로마토그래피/자외부흡광광도계에 주입하고 분석하였다. 상기 분석결과로 나온 크로마토그램을 도 4a(홍차 C)와 4b(홍차 D)에 각각 도시하였으며, 농도 측정 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
[표 6]
아미노산 성분 아미노산 농도(㎍/g)
홍차 C 홍차 D
His 1.267 1.134
Asn 1.773 1.608
Ser 4.805 4.416
Gln 40.830 37.200
Arg 56.284 51.675
Gly 0.266 0.257
Asp 18.278 16.455
Glu 24.048 21.875
Thr 2.307 2.097
Ala 2.602 2.351
GABA 12.916 11.235
The 199.342 181.991
Pro 0.908 0.865
Cys 0.643 0.590
Lys 2.571 2.364
Tyr 1.242 1.159
Met 3.302 2.935
Val 2.218 1.893
Ile 0.423 0.383
Leu 0.522 0.496
Phe 0.858 0.793
Trp 1.385 1.276
도 1은 22 종 아미노산 성분의 표준액 이온크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2a와 2b는 각각 일본산 녹차(A, 도 2a)와 국내산 녹차(B, 도 2b) 시료에서 22 종의 아미노산을 동시분석한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3a와 3b는 각각 일본산 녹차(A, 도 3a)와 국내산 녹차(B, 도 3b) 시료에서 22 종의 아미노산 성분들을 정량하기 위한 검량곡선을 도시한 것이다.
도 4a와 4b는 각각 홍차 시료들(C, D)에서 22 종의 아미노산을 동시분석한 크로마토그램을 나타낸 것이다.

Claims (13)

  1. (A) 두 종 이상의 아미노산을 함유하는 시료로부터 아미노산 성분을 분리하여 형광시약으로 유도체화하는 단계;
    (B) 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 액체크로마토그래피(LC)의 컬럼에 상기 유도체화된 시료를 주입하는 단계; 및
    (C) 액체크로마토그래피의 이동상으로서 유기용매와 수용액의 혼합용매를 흘려주는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산은 히스티딘, 아스파라긴, 세린, 글루타민, 아르기닌, 글리신, 아스파르트산, 글루타민산, 트레오닌, 알라닌, 감마 아미노부티릭산, 데아닌, 프롤린, 시스테인, 리신, 티로신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성되는 군으로부터 선택되는 두 종류 또는 그 이상의 아미노산인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 시료는 차인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 차는 녹차, 홍차 또는 커피인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 형광시약은 Ninhydrin, OPA(ortho-phthaladehyde), PITC(phenylisothocyanate), FMOC(fluorenylmethoxycarbonyl chloride) 또는 AccQ-Tag(6-aminoquinoly-N-hydroxysuccinimidly carbamate)인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 형광시약은 AccQ-Tag(6-aminoquinoly-N-hydroxysuccinimidly carbamate)인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 컬럼은 옥타데실실란(C18), 도데실실란(C12) 또는 옥타실란(C8)으로 충진된 역상 비극성 컬럼인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 컬럼은 옥타데실실란(C18)으로 충진된 역상 비극성 컬럼인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 컬럼은 컬럼 길이는 8 내지 12 cm, 컬럼 내경은 2.0 내지 2 mm 그리고 컬럼 입자사이즈는 1.5 내지 1.7 ㎛인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 혼합용매는 아세토나이트릴과 수용액의 혼합물인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 혼합용매는 60% 아세토나이트릴 (아세토나이트릴 : 물 = 60 : 40)과 20 mM 암모늄 포메이트(ammonium formate)의 혼합물인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 60% 아세토나이트릴과 20 mM 암모늄 포메이트(ammonium formate)의 시간에 따른 혼합 부피비가 0.1 : 99.9 내지 100 : 0인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 60% 아세토나이트릴과 20 mM 암모늄 포메이트(ammonium formate)의 시간에 따른 혼합 부피비는,
    용리 시간에 따라서, 제 1 단계에서는 0.1 : 99.9 내지 1 : 99이고, 제 2 단 계에서는 9.0 : 91 내지 25 : 75이고, 제 3 단계에서는 100 : 0 내지 90 : 10 그리고 제 4 단계에서는 5 : 95 내지 15 : 85인 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피를 이용한 두 종 이상의 아미노산 동시분석 방법.
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Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101134532B1 (ko) * 2009-10-12 2012-04-13 주식회사 하동 발아미의 ｇａｂａ 함량 분석방법
KR101286068B1 (ko) * 2011-01-21 2013-07-15 재단법인 하동녹차연구소 데아닌 고함유 차나무 선별방법
CN103630633A (zh) * 2013-12-20 2014-03-12 通化华夏药业有限责任公司 一种柱前衍生化法测定苦碟子注射液中6种氨基酸含量的方法
CN103713077A (zh) * 2013-12-26 2014-04-09 晨光生物科技集团股份有限公司 高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法
CN103940936A (zh) * 2014-01-20 2014-07-23 天津市敬业精细化工有限公司 一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法
CN104155378A (zh) * 2014-08-14 2014-11-19 蚌埠丰原医药科技发展有限公司 一种快速分析氨基酸混合物的方法
CN104698108A (zh) * 2015-03-26 2015-06-10 中国药科大学 一种利用固定化酶筛选I型17β羟类固醇脱氢酶抑制剂的方法
CN104897832A (zh) * 2015-05-14 2015-09-09 金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂 转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法
CN104914190A (zh) * 2015-06-23 2015-09-16 福建省农业科学院农业工程技术研究所 一种茶叶种类鉴别和21种特征成分含量测定的方法
CN105527362A (zh) * 2015-12-17 2016-04-27 天津市天津医院 一种生肌膏中氨基酸指纹图谱的分析方法
KR20170116688A (ko) * 2016-04-12 2017-10-20 대한민국(농촌진흥청장) 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 프로폴리스 내 파라쿠마린산 및 계피산의 동시 분석법
CN108918694A (zh) * 2018-05-02 2018-11-30 未名生物医药有限公司 一种msx残留的hplc柱前衍生化检测方法
CN109115917A (zh) * 2018-10-16 2019-01-01 华熙福瑞达生物医药有限公司 一种γ-氨基丁酸含量的测定方法
CN109187825A (zh) * 2018-06-01 2019-01-11 四川新绿色药业科技发展有限公司 一种天花粉或含天花粉为原料制备的药物的含量测定方法
CN111398436A (zh) * 2020-03-02 2020-07-10 浙江工业大学 一种水源水中多种游离氨基酸同时检测的固相萃取-液相检测方法
CN114113349A (zh) * 2020-08-26 2022-03-01 湖南农业大学 一种基于二维液相色谱-紫外衍生法同时测定生物基质中5种氨基酸类神经递质的方法
CN114441681A (zh) * 2022-01-28 2022-05-06 山东省食品药品检验研究院 一种测定特殊医学配方食品中20种游离氨基酸和l-羟脯氨酸的方法
CN114527228A (zh) * 2020-12-21 2022-05-24 天津世纪伟康生物科技有限公司 一种绿色精准的γ-氨基丁酸含量测定方法
CN114585916A (zh) * 2019-10-15 2022-06-03 中外制药株式会社 含有用具有Fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的定量法
CN114577942A (zh) * 2022-03-08 2022-06-03 山东省食品药品检验研究院 一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法
CN114577943A (zh) * 2022-03-08 2022-06-03 山东省食品药品检验研究院 一种间接测定婴幼儿配方乳粉及调制乳粉中天冬氨酸和谷氨酸的方法
CN114441681B (zh) * 2022-01-28 2024-06-04 山东省食品药品检验研究院 一种测定特殊医学配方食品中20种游离氨基酸和l-羟脯氨酸的方法

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101134532B1 (ko) * 2009-10-12 2012-04-13 주식회사 하동 발아미의 ｇａｂａ 함량 분석방법
KR101286068B1 (ko) * 2011-01-21 2013-07-15 재단법인 하동녹차연구소 데아닌 고함유 차나무 선별방법
CN103630633A (zh) * 2013-12-20 2014-03-12 通化华夏药业有限责任公司 一种柱前衍生化法测定苦碟子注射液中6种氨基酸含量的方法
CN103713077A (zh) * 2013-12-26 2014-04-09 晨光生物科技集团股份有限公司 高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法
CN103940936A (zh) * 2014-01-20 2014-07-23 天津市敬业精细化工有限公司 一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法
CN104155378A (zh) * 2014-08-14 2014-11-19 蚌埠丰原医药科技发展有限公司 一种快速分析氨基酸混合物的方法
CN104698108A (zh) * 2015-03-26 2015-06-10 中国药科大学 一种利用固定化酶筛选I型17β羟类固醇脱氢酶抑制剂的方法
CN104897832A (zh) * 2015-05-14 2015-09-09 金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂 转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法
CN104914190A (zh) * 2015-06-23 2015-09-16 福建省农业科学院农业工程技术研究所 一种茶叶种类鉴别和21种特征成分含量测定的方法
CN105527362A (zh) * 2015-12-17 2016-04-27 天津市天津医院 一种生肌膏中氨基酸指纹图谱的分析方法
KR20170116688A (ko) * 2016-04-12 2017-10-20 대한민국(농촌진흥청장) 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 프로폴리스 내 파라쿠마린산 및 계피산의 동시 분석법
CN108918694A (zh) * 2018-05-02 2018-11-30 未名生物医药有限公司 一种msx残留的hplc柱前衍生化检测方法
CN109187825B (zh) * 2018-06-01 2021-09-28 四川新绿色药业科技发展有限公司 一种天花粉或含天花粉为原料制备的药物的含量测定方法
CN109187825A (zh) * 2018-06-01 2019-01-11 四川新绿色药业科技发展有限公司 一种天花粉或含天花粉为原料制备的药物的含量测定方法
CN109115917A (zh) * 2018-10-16 2019-01-01 华熙福瑞达生物医药有限公司 一种γ-氨基丁酸含量的测定方法
CN114585916A (zh) * 2019-10-15 2022-06-03 中外制药株式会社 含有用具有Fmoc骨架的保护基保护的氨基的化合物的定量法
CN111398436A (zh) * 2020-03-02 2020-07-10 浙江工业大学 一种水源水中多种游离氨基酸同时检测的固相萃取-液相检测方法
CN114113349A (zh) * 2020-08-26 2022-03-01 湖南农业大学 一种基于二维液相色谱-紫外衍生法同时测定生物基质中5种氨基酸类神经递质的方法
CN114113349B (zh) * 2020-08-26 2024-01-23 湖南农业大学 一种基于二维液相色谱-紫外衍生法同时测定生物基质中5种氨基酸类神经递质的方法
CN114527228A (zh) * 2020-12-21 2022-05-24 天津世纪伟康生物科技有限公司 一种绿色精准的γ-氨基丁酸含量测定方法
CN114441681A (zh) * 2022-01-28 2022-05-06 山东省食品药品检验研究院 一种测定特殊医学配方食品中20种游离氨基酸和l-羟脯氨酸的方法
CN114441681B (zh) * 2022-01-28 2024-06-04 山东省食品药品检验研究院 一种测定特殊医学配方食品中20种游离氨基酸和l-羟脯氨酸的方法
CN114577942A (zh) * 2022-03-08 2022-06-03 山东省食品药品检验研究院 一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法
CN114577943A (zh) * 2022-03-08 2022-06-03 山东省食品药品检验研究院 一种间接测定婴幼儿配方乳粉及调制乳粉中天冬氨酸和谷氨酸的方法
CN114577943B (zh) * 2022-03-08 2024-01-23 山东省食品药品检验研究院 一种间接测定婴幼儿配方乳粉及调制乳粉中天冬氨酸和谷氨酸的方法
CN114577942B (zh) * 2022-03-08 2024-02-23 山东省食品药品检验研究院 一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法

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Aristoy et al. Essential amino acids
Kuronen et al. Reversed-phase liquid chromatographic separation and simultaneous profiling of steroidal glycoalkaloids and their aglycones
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Gandía‐Herrero et al. Development of a protocol for the semi‐synthesis and purification of betaxanthins
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