CN114577942B

CN114577942B - 一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法

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Publication number: CN114577942B
Application number: CN202210226892.1A
Authority: CN
Inventors: 卢兰香; 刘艳明; 薛霞; 张艳侠; 孙立臻; 程志; 郑文静; 王骏; 祝建华
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2022-03-08
Filing date: 2022-03-08
Publication date: 2024-02-23
Anticipated expiration: 2042-03-08
Also published as: CN114577942A

Abstract

本发明公开了一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法，包括以下步骤：谷氨酰胺、天冬酰胺、色氨酸提取：样品中加入灰色链霉菌蛋白酶溶液酶解提取谷氨酰胺、天冬酰胺、色氨酸，通过AQC衍生；其他氨基酸和牛磺酸提取：样品中加入盐酸（含巯基乙酸）水解提取后，通过AQC衍生；标准溶液的配制：采用液相色谱‑质谱测定。采用改进酸水解和创新酶解技术，建立了UPLC‑MS/MS特殊医学用途配方食品中氨基酸和牛磺酸的测定方法，为医用食品中氨基酸和牛磺酸检测标准的制定提供参考，为殊医学用途婴儿配方食品的质量控制和监管提供技术支持。

Description

一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法。

背景技术

特殊医学用途配方食品是指为了满足进食受限、消化吸收障碍、代谢紊乱或特定疾病状态人群对营养素或膳食的特殊需要，专门加工配制而成的配方食品。氨基酸作为人体营养所需蛋白质的基本物质，常被加入到特医食品中，起到促进发育、调节人体代谢等作用，是医用食品需要关键控制的主要成分之一。此外针对一些苯丙氨酸等氨基酸代谢障碍需求医用食品，特殊氨基酸是必须把控的成分。特殊医学用途食品通则《GB 29922-2013》与《GB 25596-2010》规定了允许使用和限制使用的22种氨基酸成分及其他类氨基酸成分。牛磺酸被称为类氨基酸物质，结构与氨基酸类似，虽然不参与蛋白质合成，但它却与胱氨酸、半胱氨酸的代谢密切相关。食品安全国家标准GB 29922-2013和GB 25596-2010规定了氨基酸的种类和牛磺酸的含量要求，但是并未给出相应的检测方法。国内食品中氨基酸的检测标准仅有GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》，该标准仅规定了16种氨基酸的检测方法，不能全面覆盖氨基酸的检测要求；而GB 5009.169-2016《食品中牛磺酸的测定》检测范围不包括特殊医学用途婴儿配方食品。目前，国内外报道的氨基酸与牛磺酸检测涉及的研究对象大多为生物样品或普通食品，对特殊医学用途配方食品的检测鲜有报道。由于特殊医学用途配方食品与生物样品或普通食品基质差异较大，其相关的检测方法难以应用于此类食品。

目前，氨基酸和牛磺酸的检测技术主要有氨基酸分析仪、高效液相色谱仪、液相色谱-串联质谱仪等。其中，氨基酸分析仪用途专一、灵活性差且分析时间长。液相色谱分析法虽然普适性广，但对色谱分离条件要求较高，难以通过调整色谱条件实现性质相似的多种目标物的有效分离，准确定性定量存在一定的问题。液相色谱-串联质谱法可以实现不同质荷比共洗脱化合物的准确定性与定量，可以有效减少色谱运行时间，具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，更适合于多种氨基酸和牛磺酸的分析检测。液相色谱-串联质谱法的检测技术主要有直接测定和间接分析两种。由于氨基酸与牛磺酸极性强、分子量小，复杂基质中特征离子受基体干扰严重，不适合质谱检测器直接检测。化学衍生化法可改变目标物的色谱与质谱特性，改善色谱分离效果、提升质谱信号强度。常用衍生化试剂有异硫氰酸苯酯(PITC)、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、邻苯二甲醛(OPA)、9-芴脂(FMOC)、OPA-FMOC联用、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)、6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)、茚三酮等。AQC与伯胺或仲胺反应均生成稳定的衍生物脲，操作简单，衍生速度快，过量的试剂能自然水解，不需要特殊的处理或提取；且不受样品基质干扰，与其他衍生试剂相比更适用于特殊医学用途配方食品等复杂基质中氨基酸的分析。

由于特殊医学用途配方食品基质的多样性、特殊性和复杂性，造成了样品前处理的复杂性，而水解方式是氨基酸分析的关键步骤。目前，氨基酸分析前处理水解技术主要包括酸水解、碱水解和酶水解。碱水解一般用来单独分析色氨酸，酶水解多用于分析Ｄ-型氨基酸，在从蛋白质水解得到的Ｌ-型氨基酸应用方面很少。常规的酸水解会氧化含硫氨基酸，破坏色氨酸，并使天冬酰胺和谷氨酰胺完全水解为天冬氨酸和谷氨酸。因此，目前氨基酸分析存在检不出、检不准、检不全的问题。

发明内容

本研究采用AQC柱前衍生，鉴于特殊医学用途配方食品基质的复杂性和氨基酸种类的多样性，采用改进酸水解和创新酶解技术，建立了UPLC-MS/MS特殊医学用途配方食品中氨基酸和牛磺酸的测定方法，为医用食品中氨基酸和牛磺酸检测标准的制定提供参考，为殊医学用途婴儿配方食品的质量控制和监管提供技术支持。

本发明的目的在于提供一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法。该方法能够实现不同性质氨基酸与牛磺酸的全面水解测定，选择性好，灵敏度高，定性、定量准确，可满足特殊医学用途配方食品中氨基酸和牛磺酸的准确测定。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法，包括以下步骤：

（1）谷氨酰胺、天冬酰胺、色氨酸提取：样品中加入灰色链霉菌蛋白酶溶液酶解提取谷氨酰胺、天冬酰胺、色氨酸，通过AQC衍生；

（2）其他氨基酸和牛磺酸提取：样品中加入盐酸（含巯基乙酸）水解提取后，通过AQC衍生；

（3）标准溶液的配制：

标准储备液10.0 mmol/L：分别准确称取适量标准品于10 mL容量瓶中，分别用0.1mol/L盐酸定容至刻度；

标准工作溶液：将以上各标准储备液稀释，配成混合标准溶液，使用前逐级稀释至各组分均为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的系列标准工作溶液；

氨基酸为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；

（4）采用液相色谱-质谱测定：天冬氨酸的含量为步骤（2）中的天冬氨酸的浓度减去步骤（1）中测得的天冬氨酸的含量；谷氨酸的含量为步骤（2）中的谷氨酸的浓度减去步骤（1）中测得的谷氨酸的含量；色氨酸的含量为步骤（1）中测得的含量。

进一步地，液相色谱的条件为：色谱柱：AccQ-Tag Ultra C18，2.1 mm×100 mm，1.7 µm；流动相：A. 10 mmol/L甲酸铵缓冲溶液、B.乙腈；进样体积1 µL；柱温40℃；检测波长260 nm，梯度洗脱程序见表：

进一步地，质谱条件为：离子源：喷射流电喷雾离子源；离子化模式：正离子模式（ESI+）；干燥气温度250℃；干燥气流量7 L/min；雾化气压力45 psi；鞘气温度350℃；鞘气流量， 12 L/min；毛细管电压4000 V；喷嘴电压0 V；采集模式：多反应监测。

具体地，步骤（1）中谷氨酰胺、天冬酰胺和色氨酸的测定：

提取：样品混匀后称取0.1g于50 mL螺纹带盖的离心管中，加入0.5 mL10 mg/mL灰色链霉菌蛋白酶溶液、0.1mol/L，pH 8.5的3.0 mL Tris缓冲液、200 μL甲醇，涡旋混匀，超声20 min后，于50℃恒温水浴振荡器中振荡18 h ~ 20 h，然后将样品置于90℃加热15-20分钟；取出样品，冷却至室温，将试样溶液转移至25 mL容量瓶中，用水定容至刻度；充分摇匀后，精确量取100 μL至5 mL容量瓶中，加入50 μL 12种氨基酸混合标准溶液内标，然后用超纯水定容至5 mL，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用；

衍生：移取10 μL标准工作溶液或上述样品提取液于6 mm×50 mm试管的底部，加入70 μL AccQ-Fluor硼酸盐缓冲液涡旋混合后，加入20 μL AccQ-Fluor衍生剂（6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯），立即涡旋混合，室温下放置1 min，将样品溶液转移至微量自动进样样品瓶中，加盖密封，置于55℃加热装置上加热10 min，冷却至室温后上机测定。

具体地，步骤（2）中除谷氨酰胺、天冬酰胺、色氨酸、天冬氨酸及谷氨酸外，其他氨基酸和牛磺酸的提取：样品混匀后称取0.1g于水解管中，加入10 mL 6mol/L盐酸含0.05%巯基乙酸，充入高纯氮气后封口，将已封口的水解管放入110℃的电热鼓风恒温箱内，水解22h后，取出，冷却至室温；将水解管内试样溶液全部液体转移到25 mL容量瓶内，用水定容至刻度；充分摇匀后，精确量取100 μL至5 mL容量瓶中，加入50 μL 12种氨基酸混合标准溶液内标，然后用超纯水定容至5 mL，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用；

有益效果

本研究鉴于GB 29922和GB 25596中涉及的氨基酸及牛磺酸成分检测方法缺失无法满足监管需求的问题，基于AQC靶向衍生技术，采用改进的酸水解和创新的酶水解技术，发展了UPLC-MS/MS测定特殊医学用途配方食品中氨基酸及牛磺酸的精准检测的分析方法。

针对常规酸水解含硫氨基酸氧化损失导致不能准确定量的问题，引入还原剂巯基乙酸，通过考察巯基乙酸的用量对蛋氨酸、胱氨酸及其他氨基酸的影响，实现了蛋氨酸、胱氨酸及大部分氨基酸的准确测定。针对酸水解时天冬酰胺和谷氨酰胺被完全水解成天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸完全被破坏，导致天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸检不出而天冬氨酸与谷氨酸检不准的问题，发展到了创新的酶水解技术，通过考察酶的浓度、酶水解时间及温度等酶水解条件对天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸的影响，有效解决了天冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸的测定难题。由酸水解结合酶水解，采用差减法实现了天冬氨酸与谷氨酸的准确测定。

针对特殊医学用途配方食品的基质复杂性且无空白基质的特点，引入同位素内标，采用同位素内标法定量，提高了方法的准确性；采用同位素内标代替目标物评价基质效应，并将基质效应考察应用于色谱条件的选择中，有效降低了共流出物对目标物的干扰，从而降低了基质效应，提高了分析方法的准确性和稳定性。

该方法实现了GB 29922和GB 25596中涉及的不同性质氨基酸与牛磺酸的全面水解测定，选择性好，灵敏度高，定性、定量准确，可满足特殊医学用途配方食品中氨基酸和牛磺酸的准确测定。

本研究填补了殊医学用途配方食品中氨基酸和牛磺酸的检测技术缺失，有效解决了氨基酸与牛磺酸检测中检不全、检不出、检不准等技术难题，对医用食品生产质量控制和政府监管具有重要意义。

附图说明

图1酸水解对不同氨基酸和牛磺酸回收率的影响；

图2 不同水解方式对天冬酰胺、谷氨酰胺及色氨酸提取效果的影响；

图3 不同浓度的巯基乙酸对胱氨酸和蛋氨酸提取的影响；

图4 不同酶解条件对天冬酰胺、谷氨酰胺及色氨酸提取的影响；

图5 不同灭活方法对天冬酰胺与谷氨酰胺提取的影响；

图6不同色谱柱对氨基酸和牛磺酸基质效应的影响；

图7 不同流动相对氨基酸和牛磺酸分离的影响（1. Asp; 2. Glu; 3. Ser; 4.Asn; 5. Gly; 6. Gln; 7. His; 8. Tau; 9. Cit; 10. Thr; 11. Arg; 12. Ala; 13.Pro; 14. Cys; 15. Tyr; 16. Val; 17. Met; 18. Orn; 19. Ile; 20. Lys; 21. Leu;22. Phe; 23. Trp.）；

图8 谷氨酸（A）和赖氨酸（B）的二级全扫描质谱图及碎片离子；

图9 特殊医学用途配方食品中氨基酸和Tau的含量。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品：天冬氨酸（Asp）（纯度≥99.7%）、丝氨酸（Ser）（纯度≥99.9%）、谷氨酸（Glu）（纯度≥98.0%）、组氨酸（His）（纯度≥99.9%）、精氨酸（Arg）（纯度≥91.3%）、苏氨酸（Thr）（纯度≥99.9%）、脯氨酸（Pro）（纯度≥99.5%）、酪氨酸（Tyr）（纯度≥99.6%）、缬氨酸（Val）（纯度≥99.4%）、蛋氨酸（Met）（纯度≥98.3%）、赖氨酸（Lys）（纯度≥88.1%）、异亮氨酸（Ile）（纯度≥99.5%）、亮氨酸（Leu）（纯度≥99.9%）、苯丙氨酸（Phe）（纯度≥99.4%）、谷氨酰胺（Gln）（纯度≥99.2%）、色氨酸（Trp）（纯度≥99.6%），均购自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；甘氨酸（Gly）（纯度≥99.0%）中国计量科学研究院；牛磺酸（Tau）（纯度≥99.8%） Sigma-Aldrich公司；天冬酰胺（Asn）（纯度≥98.7%）上海安谱实验科技股份有限公司；丙氨酸（Ala）（纯度≥99.8%）、胱氨酸（(Cys)₂）（纯度≥99.9%）、半胱氨酸（Cys）（纯度≥90.1%）、瓜氨酸（Cit）（纯度≥99.9%），均购自北京曼哈格生物科技有限公司；鸟氨酸（Orn）（纯度≥98.0%）上海甄准生物科技有限公司。

12种氨基酸混合标准溶液内标(含丙氨酸-D₄、苯丙氨酸-¹³C₆、亮氨酸-D₃、缬氨酸-D₈、精氨酸-¹³C-D₄、瓜氨酸-D₂、谷氨酸-D₃、酪氨酸-¹³C₆、鸟氨酸-D₂、蛋氨酸-D₃、天冬氨酸-D₃、甘氨酸-¹³C-¹⁵N，除甘氨酸-¹³C-¹⁵N浓度为2500 μmol/L外，其余浓度均为500 μmol/L)Cambridge Isotope Laboratories Inc.公司。

实验用特殊医学用途配方食品均为市售。

Waters AccQ-Tag氨基酸测定试剂盒(AccQ-Fluor试剂盒(包括硼酸缓冲液1、衍生剂粉2A、稀释液2B))；灰色链霉菌蛋白酶（活力≥3.5 U/mg） Sigma-Aldrich公司；巯基乙酸（分析纯）天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸(浓度≥36%,优级纯) 国药集团化学试剂有限公司；Tris 生工生物工程（上海）股份有限公司；乙腈(色谱纯) 美国Fisher公司；甲酸铵(色谱纯) 美国Fisher公司；有机微孔滤膜(0.22 µm) 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent1290 Infinity Ⅱ液相色谱系统和Agilent 6470三重四极杆液质联用系统，配有喷射流电喷雾（Jet ESI）电离源，使用 Agilent Mass Hunter 采集软件（B.08.00版）和 Agilent Mass Hunter 定量分析软件（B.07.00版）进行数据采集和分析 (美国Agilent公司)；AB204-S型电子天平瑞士Mettler Toledo公司；SB-800DTD型超声波清洗器中国宁波新芝生物科技股份有限公司；恒温水浴振荡器优莱博技术(北京)有限公司；MS3涡旋混合器德国IKA公司； Milli-Q超纯水制备器美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液(10.0 mmol/L)：分别准确称取适量(精确至0.1 mg)标准品于10 mL容量瓶中，分别用0.1 mol/L盐酸定容至刻度。

标准工作溶液：将以上各标准储备液稀释，配成混合标准溶液，使用前逐级稀释至各组分均为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L（均含甘氨酸-¹³C-¹⁵N浓度为25 μmol/L，其它标记氨基酸浓度为5 μmol/L）的系列标准工作溶液，待用。

1.3.2 AccQ-Fluor衍生剂的制备

吸取2B瓶中1 mL AccQ-Fluor稀释剂放入装有AccQ-Fluor衍生剂粉末的2A瓶中，加盖密封，涡旋10 s，在55℃加热装置上加热2A瓶，直至AccQ-Fluor衍生剂粉末全部溶解，加热时间不超过10 min。密封，室温下保存于干燥器中，有效期一周。

1.3.3 样品前处理

1.3.3.1 谷氨酰胺、天冬酰胺和色氨酸的测定：

提取：样品混匀后称取0.1g(精确到0.0001 g)于50 mL螺纹带盖的离心管中，加入0.5 mL灰色链霉菌蛋白酶溶液（10 mg/mL）、3.0 mL Tris缓冲液（0.1mol/L，pH 8.5）、200 μL甲醇，涡旋混匀，超声20 min后，于50℃恒温水浴振荡器中振荡18 h ~ 20 h，然后将样品置于90℃加热15-20分钟。取出样品，冷却至室温，将试样溶液转移至25 mL容量瓶中，用水定容至刻度。充分摇匀后，精确量取100 μL至5 mL容量瓶中，加入50 μL 12种氨基酸混合标准溶液内标，然后用超纯水定容至5 mL，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用。

衍生：移取10 μL标准工作溶液或上述样品提取液于6 mm×50 mm试管的底部，加入70 μL AccQ-Fluor硼酸盐缓冲液(Buffer 1)涡旋混合后，加入20 μL AccQ-Fluor衍生剂，立即涡旋混合，室温下放置1 min，将样品溶液转移至微量自动进样样品瓶中，加盖密封，置于55℃加热装置上加热10 min，冷却至室温后上机测定。

1.3.3.2 其他氨基酸（除谷氨酰胺、天冬酰胺、色氨酸、天冬氨酸及谷氨酸外）和牛磺酸的测定：

提取：样品混匀后称取0.1g(精确到0.0001 g)于水解管中，加入10 mL 6mol/L盐酸（含0.05%巯基乙酸），充入高纯氮气后封口，将已封口的水解管放入110℃的电热鼓风恒温箱内，水解22 h后，取出，冷却至室温。将水解管内试样溶液全部液体转移到25 mL容量瓶内，用水定容至刻度。充分摇匀后，精确量取100 μL至5 mL容量瓶中，加入50 μL 12种氨基酸混合标准溶液内标，然后用超纯水定容至5 mL，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用。

衍生：步骤同1.3.3.1中衍生的操作步骤。

1.3.3.3 天冬氨酸与谷氨酸的测定：

1.3.3.2步骤中测得的天冬氨酸的摩尔浓度减去1.3.3.1测得的天冬酰胺的摩尔浓度即为天冬氨酸的摩尔浓度，得出天冬氨酸的含量；1.3.3.2步骤中测得的谷氨酸的摩尔浓度减去1.3.3.1测得的谷氨酰胺的摩尔浓度即为谷氨酸的摩尔浓度，得出谷氨酸的含量。

1.3.3.4 空白实试验

除不加试样外，其他操作步骤同试样的操作步骤。

1.3.4 分析条件

1.3.4.1 色谱条件

色谱柱：AccQ-Tag Ultra C18 (2.1 mm×100 mm，1.7 µm)；流动相：A.甲酸铵缓冲溶液(10 mmol/L)、B.乙腈；进样体积1 µL；柱温40℃；检测波长260 nm，梯度洗脱程序见表1：

表1 HPLC梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution program

1.3.4.2 质谱条件

离子源：喷射流电喷雾离子源(Jet ESI)；离子化模式：正离子模式（ESI+）；干燥气温度250℃；干燥气流量7 L/min；雾化气压力45 psi；鞘气温度350℃；鞘气流量, 12 L/min; 毛细管电压4000 V；喷嘴电压0 V；采集模式：多反应监测(MRM)；氨基酸和牛磺酸质谱参数见表2。

表2. 氨基酸和牛磺酸衍生物的质谱参数

Table 2 Optimized parameters of MS/MS for amino acids and taurinederivatives

注：^*为定量离子

1.4 基质效应评价

通过在纯溶剂与样品中添加同水平同位素内标，测定二者的峰面积响应值，评价基质效应 (Matrix effect）。Matrix effect factor (MEF, %)=(A-B)/A×100，其中MEF为基质效应因子，A为纯溶剂中内标的峰面积响应值，B为样品提取液中内标的峰面积响应值。MEF为0表示无基质效应，绝对值越大基质效应越强，在-15%~15%之间，表示基质效应影响不明显。

1.5 数据处理

通过与仪器配套的Agilent Mass Hunter采集软件和Agilent Mass Hunter定量分析软件完成数据采集与处理，Origin 8.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 水解方式的选择

水解是氨基酸分析准确性的关键。实验以某早产/低出生体重婴儿配方特殊医学用途婴儿配方食品为代表，按照样品前处理1.3.3.2步骤考察了酸水解对不同氨基酸和牛磺酸回收率的影响（图1）。

图1表明，酸水解过程中牛磺酸和大部分氨基酸回收率正常，但是Asp和Glu回收率偏高，Asn、Gln及Trp回收率为零。原因可能是在酸水解过程中Asn和Gln被完全水解成Asp和Glu，Trp完全被破坏。

为了进一步证明Asn与Gln是否转化为Asp和Glu，回收率实验只在在试样中加入Asp和Glu。实验表明Asp回收率为98.1%，Glu回收率为95.9%。因此，进一步验证了酸水解过程中Asn转化为Asp、Glu转化为Gln，导致Asp和Glu回收率偏高，亦无法准确测得Asp和Glu在样品中的含量。因此，1.3.3.2步骤的酸水解方法适合于除Asp、Glu、Asn、Gln、Trp之外的氨基酸和牛磺酸。

由于酸水解过程中天冬酰胺和谷氨酰胺被完全水解成天冬氨酸和谷氨酸；色氨酸完全被破坏，实验以某早产/低出生体重婴儿配方特殊医学用途婴儿配方食品为代表，考察了酶水解、弱化的酸水解及其组合模式对天冬酰胺、谷氨酰胺及色氨酸提取效果的影响（图2）。具体考察条件如下：

A.样品按照样品前处理1.3.3.1酶解18 h ~ 20 h；

B.样品用0.1 mol/L盐酸溶解后在121℃下水解30 min，调节试样溶液的pH至pH8.5；再按照样品前处理1.3.3.1酶解18 h ~ 20 h；

C.样品用6 mol/L盐酸溶解后在121℃下水解30 min，调节试样溶液的pH至pH8.5；再按照样品前处理1.3.3.1酶解18 h ~ 20 h；

D.样品用Tris缓冲液（0.1mol/L，pH 8.5）溶解后在121℃下水解30 min；再按照样品前处理1.3.3.1酶解18 h ~ 20 h；

E.样品按照样品前处理1.3.3.1酶解18 h ~ 20 h后，调节试样溶液的pH至pH 1.0在121℃下水解30 min；

F.样品用0.1 mol/L盐酸溶解后在121℃下水解30 min。

实验表明（图2），单独的酶水解模式（A）样品中Asn、Gln、Trp的提取效果良好且回收率正常。酶水解和弱化的酸水解组合模式（B、C、E）的水解方法，Asn、Gln、Trp的提取均存在不同程度的降低，回收率的影响趋势基本一致，且当酸的浓度增大到6 mol/L（C）时，样品中的Asn、Gln、Trp均被完全破坏；缓冲溶液水解与酶水解组合（D）时，Gln提取效果与回收率正常，而Asn与Trp有一定程度的降低；弱化的酸水解模式（F），蛋白质无法水解出游离的Asn、Gln、Trp且回收率异常。因此，Asn、Gln、Trp水解方式选择单独的酶水解模式（A）。

由于酶水解方法较温和，Asp与Glu无法水解完全，而前处理1.3.3.2酸水解测定的Asp是Asp与Asn的和、Glu是Glu与Gln的和，所以Asp、Glu的摩尔浓度由酸水解测定的Asp、Glu的摩尔浓度分别减去酶水解测定的Asn、Glu的摩尔浓度得出，从而间接测出Asp与Glu的含量。

2.1.2 酸水解中巯基乙酸浓度的优化

由于常规酸水解适用于大部分氨基酸，而蛋氨酸和胱氨酸为含硫氨基酸，含硫氨基酸在游离或肽键合状态都不稳定，易于发生氧化、烷基化等反应导致测定值比实际含量值偏低。巯基乙酸(thioglycolic acid，TGA)为还原剂，在酸水解过程中可以作为保护剂，有效降低含硫氨基酸的损失率。在酸水解体系中加入一定量的巯基乙酸，胱氨酸转化为半胱氨酸，通过测定半胱氨酸的含量间接实现胱氨酸的测定，蛋氨酸保持不变。实验以某早产/低出生体重婴儿配方特殊医学用途婴儿配方食品为代表，考察了巯基乙酸浓度为0%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%时，对牛磺酸和不同氨基酸提取量和回收率的影响。图3为不同浓度的巯基乙酸对胱氨酸和蛋氨酸提取的影响。

实验表明，在酸水解体系中加入巯基乙酸后，除胱氨酸和蛋氨酸外，对其他氨基酸和牛磺酸几乎无影响。由图3可知，随着巯基乙酸浓度的增加，(Cys)₂和Met的提取量和回收率有明显的增加；而当巯基乙酸浓度超过0.2%时，Met的提取量和回收率变化不明显，(Cys)₂在巯基乙酸浓度超过0.5%时提取量和回收率几乎无变化。所以，实验综合考虑选取巯基乙酸的浓度为0.5%。

2.1.3 酶水解条件的优化

酶种类的选择，实验以某早产/低出生体重婴儿配方特殊医学用途婴儿配方食品为代表，考察了灰色链霉菌蛋白酶、胰酶、脂肪酶及淀粉酶对实验结果的影响。实验发现，胰酶、脂肪酶、淀粉酶均不能是蛋白质水解出游离的天冬氨酸、谷氨酸及色氨酸。原因可能是链霉蛋白酶是一种非特异蛋白水解酶混合物，能够裂开蛋白质的肽键，有极强的蛋白水解作用，能够将蛋白质消化成单个氨基酸，因此实验采用采用链霉蛋白酶进行酶解。

酶解条件是蛋白质水解的关键因素。实验以某早产/低出生体重婴儿配方特殊医学用途婴儿配方食品为代表，分别考察了酶浓度、酶解温度、酶解时间对天冬氨酸、谷氨酸及色氨酸提取效果的影响（图4）。

实验考察了酶浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/mL时，对样品中目标物提取效果的影响（图4，a）。结果表明，随着酶浓度的增加，目标物含量逐渐增加，当浓度超过5.0mg/mL 后Trp趋于平稳、浓度超过10.0 mg/mL时Asn与Gln不再增加。所以实验选择酶的浓度为10.0 mg/mL。

实验比较了不同温度（40、45、50、55、60℃）对Asn、Gln及Trp提取效果的影响（图4，b）。实验表明，目标物的提取效果随着温度的增加逐渐增加，超过50℃后呈明显的下降趋势。本实验酶解温度确定为50℃。

实验考察了样品酶解时间分别为14、16、18、20、22 h时，对三种氨基酸提取效果的影响（图4，c）。研究发现，随着酶解时间的增加，酶解效率增加，提取效率提高，18 h后趋于平稳，超过20 h后Asn、Gln和Trp均有不同程度的下降趋势。所以实验选择酶解时间为18 ~20 h。

2.1.4 酶灭活方法的选择

为保证分析方法的稳定性和准确性，实验以某早产/低出生体重婴儿配方特殊医学用途婴儿配方食品为代表，分别考察了酶解后加入甲醇与90℃加热15-20分钟两种不同灭活方法对目标物提取和回收率的影响（图5）。

研究表明，采用甲醇灭活的方法会导致目标含量和回收率偏低。原因可能是，一方面甲醇的加入在使酶失去活性的同时也沉淀了部分干扰物质，此过程可能也吸附或包裹了部分目标物；另一方面可能是目标物在甲醇和水中溶解度的差异造成的。因此实验选择酶解后将样品置于90℃加热15-20分钟使酶灭活。

2.1.5 衍生试剂体积的优化

由于氨基酸存在种类繁多、结构和性质差异大等特点，且衍生试剂必须过量才能得到稳定的氨基酸衍生物，所以衍生试剂的用量直接影响分析结果的准确性。实验比较了不同体积的衍生试剂（5 μL、10 μL、20 μL、30 μL），对实验结果的影响。

结果表明，生试剂不足时，部分氨基酸分析结果重复性差、响应值及灵敏度较低，超过20 μL后衍生物的峰面积响应趋于稳定。原因可能是，氨基酸存在单氨基氨基酸、多氨基氨基酸（如Cys、Lys），衍生试剂不足时，多氨基氨基酸可能会生成单衍生化的同分异构体，单衍生物响应值较低；不同氨基酸衍生反应速度不同，导致衍生速度相对较慢的氨基酸衍生不完全，灵敏度降低。所以，实验选取衍生试剂的体积为20 μL。

2.2 分析条件的优化

2.2.1 色谱条件的选择

2.2.1.1 色谱柱的选择

实验选取Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.7 μm）、Waters AcquityBEH Shield RP18（2.1×100 mm，1.7 μm）和AccQ-Tag Ultra C18（2.1 mm×100 mm，1.7 µm）三种色谱柱对分离效果和峰形的影响。实验以某早产/低出生体重婴儿配方特殊医学用途婴儿配方食品为代表，以酸水解为例考察了三种色谱柱对基质效应（图6）的影响。

结果表明，目标物在三种色谱柱上的分离效果Ultra C18最好、HSS T3次之、Shield RP18最差，Ultra C18与HSS T3目标物峰形良好，但在Shield RP18上Asp与Glu拖尾。由图5可知，氨基酸与牛磺酸在Ultra C18色谱柱上的基质效应明显低于HSS T3和Shield RP18。本实验选择Ultra C18色谱柱。

2.2.1.2 流动相的选择

实验比较了乙腈与甲醇为有机相对分离效果的影响。实验发现，甲醇作为流动相时对目标物的分离效果很差，因此实验选用乙腈为有机相。

实验以乙腈为流动相，采用氨基酸和牛磺酸的混合标准溶液（10 μmol/L），比较了10 mmol/L甲酸铵、10 mmol/L甲酸铵（含0.1%甲酸）、10 mmol/L醋酸铵三种不同流动相对目标物的分离效果、灵敏度及峰形的影响（图7）。

由图7可知，目标物在三种流动相中峰形无明显差异；但大部分化合物在乙腈-10mmol/L甲酸铵体系中峰面积响应值最高、灵敏度最高，分离效果最好且基质效应最小，而加入酸会降低目标化合物的响应。因此，实验选取乙腈-10 mmol/L甲酸铵为流动相。

实验考察了不同盐浓度（5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L甲酸铵溶液），对氨基酸和牛磺酸分离效果的影响。结果表明，盐浓度对目标化合物的分离效果和灵敏度无明显差异，但浓度为5 mmol/L时，Asp与Glu峰形不好。考虑到盐浓度对仪器和色谱柱的影响，所以实验选取甲酸铵溶液浓度为10 mmol/L。

2.2.2 质谱条件的优化

氨基酸衍生物在ESI源下易电离形成正离子。在电喷雾正离子模式下，将500 μmol/L的各个目标化合物的标准溶液衍生后通过一级质谱扫描获得相应的母离子及优化的离子源参数，再优化Fragmentor电压，随后通过子离子扫描选择信号强且稳定的特征碎片离子，确定定性离子及定量离子，并进一步优化碰撞能量等参数，具体见表2。

AQC与伯胺或仲胺反应均生成的衍生物具有良好的反相色谱和质谱特性。单氨基氨基酸衍生物形成[M+Acq+H]⁺分子离子峰，如谷氨酸m/z 318.1；多胺基氨基酸衍生物形成[M+xAcq+H]⁺分子离子峰，如赖氨酸m/z 487。图8为谷氨酸（A）和赖氨酸（B）的二级全扫描质谱图及碎片离子。氨基酸与AQC试剂进行衍生化之后，产生了一种共有碎片离子 171，该碎片离子大部分是目标分析物丢失氨基喹啉(AMQ)基团生成的。

2.3 基质效应的考察

氨基酸和牛磺酸是特殊医学用途配方食品中一类重要的营养物质，难以获得空白基质，不能采用常规的提取后添加法和柱后注射法来评价基质效应，也无法使用基质校正曲线定量。由于同位素内标与目标物具有相同的化学性质，所以实验采用引入同位素内标代替目标物进行基质效应评价，有效消除了基质效应的影响，提高分析方法的准确性及稳定性，并可实现对每个样本进行基质效应评估。实验表明，本方法基质应均在-15.0%~15.0%之间，基质效应影响较小。

2.4 方法学评价

2.4.1 线性范围、检出限和定量限

将1.3.1节步骤配制的标准系列工作液按1.3.3.1节衍生后，按质量浓度由低到高的顺序依次测定，以各目标化合物的摩尔浓度（X，μmol/L）为横坐标，各目标化合物的峰面积与其内标面积之比（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。以RSN≥3得到目标化合物的检出限，以RSN≥10得到目标化合物的定量限（表3）。结果表明，各目标化合物在各自线性范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.9956。

表3 氨基酸和Tau的线性回归方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

Table 3 Linear equation, linear range, correlation coefficient,limits of detection and quantitation of amino acids and taurine

2.4.2 回收率、精密度

选取某全营养特殊医学用途配方食品为代表进行回收率试验。样品中未检出的目标化合物按其定量限、5倍定量限、10倍定量限，已知含量的目标化合物按其含量的50%、100%、150%，分别添加低、中、高3个不同水平浓度的标准溶液进行回收率实验，各个水平平行测定6次(表4)。由表4可知，加标回收率在90.1%～104.7%之间，相对标准偏差在1.19%～4.34%之间。

表4 方法的回收率和精密度

Table 4 Recovery and RSD for the method (n=6)

注：ND表示未检出

2.5 实际样品的测定

应用本方法对固体或液体特殊医学用途配方食品：无乳糖配方（品牌A1、A2、A3）、乳蛋白部分水解配方（B）、早产/低出生体质量婴儿配方（C）、母乳营养补充剂（D）、全营养配方（固态E1、液态E2）中的22种氨基酸和Tau进行分析（图9）。

结果表明，特殊医学用途配方食品中均未检出Cit和Orn，而Tau含量均符合国家标准要求。由图9可知不同配方氨基酸含量差异较大。样品A1、A2、A3为不同企业生产的无乳糖配方，不同氨基酸含量差异不同，原因可能是生产企业用料的差异造成的含量差异。样品E1和E2均为全营养配方，但E1为固体样品、E2为液体样品，液体样品中的氨基酸含量明显低于固体样品。

为验证方法的准确性，采用本方法对婴儿/成人营养配方NIST标准品SRM 1869进行测定，测定结果见表5。

表 5 SMR 1869中氨基酸与牛磺酸的测定结果与参考值的比较

Table 5 Comparison between determination results and reference valuesfor amino acids and taurine in SMR 1869

注：ND表示未检出，/表示未标注参考值

由表5可知，Asp、Glu两种氨基酸的测定结果与参考值不一致，其他氨基酸均与参考值相吻合。原因可能是SMR 1869中Asp与Glu的定值方法AOAC 994.12、GB/T 5009.124-2003、ISO 13903:2005均为酸水解的方法，Asp与Glu的测定值包含酸水解时由Asn与Gln转化而来的部分，而本方法酸水解时测定的Asp与Glu的值分别为1.3042 g/100g、2.9544 g/100g，与参考值相吻合。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）其他氨基酸和牛磺酸提取：样品中加入含巯基乙酸的盐酸水解提取后，通过AQC衍生；

（3）标准溶液的配制：

2.根据权利要求1所述的一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法，其特征在于，液相色谱的条件为：色谱柱：AccQ-Tag Ultra C18，2.1 mm×100 mm，1.7 µm；流动相：A. 10 mmol/L甲酸铵缓冲溶液、B.乙腈；进样体积1 µL；柱温40℃；检测波长260nm，梯度洗脱程序见表：

。

3.根据权利要求1所述的一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法，其特征在于，质谱条件为：离子源：喷射流电喷雾离子源；离子化模式：正离子模式ESI+；干燥气温度250℃；干燥气流量7 L/min；雾化气压力45 psi；鞘气温度350℃；鞘气流量， 12L/min；毛细管电压4000 V；喷嘴电压0 V；采集模式：多反应监测。

4.根据权利要求1所述的一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法，其特征在于，步骤（1）中谷氨酰胺、天冬酰胺和色氨酸的测定：

提取：样品混匀后称取0.1g于50 mL螺纹带盖的离心管中，加入0.5 mL10 mg/mL灰色链霉菌蛋白酶溶液、0.1mol/L，pH 8.5的3.0 mL Tris缓冲液、200 μL甲醇，涡旋混匀，超声20min后，于50℃恒温水浴振荡器中振荡18 h ~ 20 h，然后将样品置于90℃加热15-20分钟；取出样品，冷却至室温，将试样溶液转移至25 mL容量瓶中，用水定容至刻度；充分摇匀后，精确量取100 μL至5 mL容量瓶中，加入50 μL 12种氨基酸混合标准溶液内标，然后用超纯水定容至5 mL，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用；

衍生：移取10 μL标准工作溶液或上述样品提取液于6 mm×50 mm试管的底部，加入70μL AccQ-Fluor硼酸盐缓冲液涡旋混合后，加入20 μL AccQ-Fluor衍生剂6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯，立即涡旋混合，室温下放置1 min，将样品溶液转移至微量自动进样样品瓶中，加盖密封，置于55℃加热装置上加热10 min，冷却至室温后上机测定。

5.根据权利要求1所述的一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法，其特征在于，步骤（2）中除谷氨酰胺、天冬酰胺、色氨酸、天冬氨酸及谷氨酸外，其他氨基酸和牛磺酸的提取：样品混匀后称取0.1g于水解管中，加入10 mL 6mol/L含0.05%巯基乙酸的盐酸，充入高纯氮气后封口，将已封口的水解管放入110℃的电热鼓风恒温箱内，水解22h后，取出，冷却至室温；将水解管内试样溶液全部液体转移到25 mL容量瓶内，用水定容至刻度；充分摇匀后，精确量取100 μL至5 mL容量瓶中，加入50 μL 12种氨基酸混合标准溶液内标，然后用超纯水定容至5 mL，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用；