CN115047120B - 分析检测白酒大曲中二肽类物质的丹磺酰氯衍生化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了分析检测白酒大曲中二肽类物质的丹磺酰氯衍生化方法，属于分析化学和食品检验应用领域。本发明通过蛋白去除、衍生化反应等步骤对大曲样本进行预处理，对丹磺酰氯衍生化反应pH、衍生化试剂用量、时间、温度等条件进行优化考察，建立起针对白酒大曲中二肽类化合物高灵敏分析检测的衍生化方法。该方法具有简单、灵敏、可靠的优点。

Description

分析检测白酒大曲中二肽类物质的丹磺酰氯衍生化方法

技术领域

本发明属于分析化学和食品检验应用领域，涉及分析检测白酒大曲中二肽类物质的丹磺酰氯衍生化方法，尤其是一种用于白酒大曲中二肽类化合物的高灵敏分析检测的柱前衍生化方法。

背景技术

大曲是白酒酿造过程中所需的发酵剂、糖化剂和生香剂，对白酒的品质和风味形成具有重要的影响，包括黄曲、白曲、黑曲三种类型。已有研究报道表明，大曲中二肽类物质的组成对大曲的质量和类型区分具有重要的贡献，进而影响到最终白酒产品的风味和品质。因此，对白酒大曲中二肽类物质进行全面、整体的表征，可以为大曲质量的评估及白酒的质量控制提供参考。但白酒大曲中二肽类物质具有含量较低的特点，这为高覆盖筛选二肽类物质带来了巨大的困难。

液相色谱-质谱联用技术具有高灵敏、高通量、高特异性的特点，在痕量物质的分析检测方面具有显著的优势。化学衍生化反应是通过在目标物特定官能团上引入易离子化的基团，提高目标待测物的检测灵敏度，是液相色谱-质谱联用技术中一种常用的提高检测灵敏度的方法。由于二肽存在氨基位点，可通过丹磺酰氯衍生化引入季氮基团来增强其色谱保留，并可以显著地提高其质谱分析的离子化效率，进而提高检测灵敏度。同时，特征基团的引入，有利于质谱对氨基化合物的高通量筛选。

然而，大曲中大量存在的羧基化合物易与二肽争夺衍生化试剂导致二肽衍生化反应不完全，且有研究报道表明，部分二肽在高温下容易发生降解。因此，用于传统食品的丹磺酰氯衍生化方法的反应体系并不完全适用于大曲中的二肽类物质。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是大曲中大量存在的羧基化合物易与二肽争夺衍生化试剂导致二肽衍生化反应不完全，且二肽在高温提取过程中易降解，最终导致检测结果不准确。

[技术方案]

本发明针对白酒大曲中二肽的特性，特别采用了低温的提取及衍生化条件，并对丹磺酰氯衍生化的反应时间、pH、试剂用量等条件进行了系统优化，从而建立了一种适用于白酒大曲中二肽类物质高灵敏分析的丹磺酰氯衍生化方法。

本发明提供了用于分析检测白酒大曲中二肽类物质的丹磺酰氯衍生化方法，所述白酒大曲包括黄曲、白曲、黑曲三种类型的拆仓大曲，所述二肽为除了半胱氨酸之外的十九种组成生命体蛋白质的氨基酸所组成的361种直链二肽中的一种或二种以上，十九种氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸；

所述方法包括以下步骤：

(1)白酒大曲的预处理

将白酒大曲经珠打研磨成细曲样本，经过浸泡、液液萃取、离心得到大曲提取物；向大曲提取物中加入内标化合物并冻干备用，所述内标化合物包括甲硫氨酸-d3、缬氨酸-d8、丙氨酸-d4、甘氨酸-d5、苯丙氨酸-d5、谷氨酰胺-d5、丝氨酸-¹³C；

(2)丹磺酰氯衍生化

利用丹磺酰氯-碳酸钠/碳酸氢钠体系在pH8.0对大曲提取物进行低温衍生化，得到用于液相色谱-质谱联用技术分析的溶液。

优选地，所述步骤(1)：将白酒大曲样本经25～30Hz珠打研磨5～8分钟成粉末状细曲样本；向3～6mg珠打研磨后的大曲样本中加入400～600μL甲醇，于3～5℃浸泡过夜后加入400～600μL氯仿，涡旋1～2分钟后加入100～300μL超纯水，涡旋20～40分钟后离心取200～400μL上层水相，加入50～100μL二肽标样溶液，真空冷冻干燥。

优选地，所述二肽标样，包括His-Asp、Thr-Val、Leu-His、His-Val、Asp-Val、Val-His、His-His、His-Thr、Val-Val、Thr-Thr、His-Leu、Asp-Leu、Asp-His、Leu-Val、Leu-Asp、Thr-Leu、Val-Leu、Asp-Asp、Thr-Asp、Asp-Thr、Pro-Gly、Glu-Cys、Asp-Ala、Glu-Glu、Gln-Leu、Ile-Arg、His-Asn、Ala-Asp、Asp-Phe、Asp-Ala、Arg-Phe、Gly-Asn、Arg-Arg、Ile-Pro、Met-Pro、Tyr-Glu、HPM、HPQ。

优选地，所述步骤(2)：向真空冷冻干燥后的样本提取物中加入40～60μL的40～50mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液，涡旋1～2分钟后，加入等体积0.4～0.6M、pH＝9.0～9.2的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液，涡旋1～2分钟后，加入1～3μL、1～3M的氢氧化钠溶液，涡旋1～2分钟后，于4℃～10℃反应60～80分钟，于12000～15000g离心5～10分钟后，取上清液用于液质联用分析。

本发明提供了利用液相色谱-质谱联用技术对白酒大曲中的二肽进行分析检测的方法，是在前述丹磺酰氯衍生化方法的基础上，利用液相色谱-质谱联用技术对样本进行分析，通过对数据中的衍生化二肽色谱峰进行提取，得到可用于表征二肽相对含量的数据。

[有益效果]

本发明通过丹磺酰化使二肽类物质能够获得更好的质谱离子化效率。

本发明采用的衍生化反应条件可以提高对二肽的丹磺酰化的效率。

本发明采用的低温提取及衍生化条件能够避免部分二肽在常温或高温下的降解。

本发明通过研磨、浸泡、液液萃取等步骤对大曲进行预处理，并针对大曲中二肽类物质的丹磺酰氯衍生化反应条件进行优化，能够高灵敏地对大曲中的痕量二肽化合物进行分析检测，具有灵敏、准确、稳定、可靠等优点，可为大曲的品质评估及二肽组成特征分析提供方法参考。

附图说明

图1.低温(4～10℃)及常规温度(40～60℃)衍生化效果对比。

图2.衍生化试剂用量优化结果。

图3.衍生化pH优化结果。

图4.衍生化时间优化结果。

图5.部分二肽4℃与60℃衍生化效果对比。

具体实施方式

标准品：二肽标准品，所述标准品用于丹磺酰氯衍生化条件的优化，包括His-Asp、Thr-Val、Leu-His、His-Val、Asp-Val、Val-His、His-His、His-Thr、Val-Val、Thr-Thr、His-Leu、Asp-Leu、Asp-His、Leu-Val、Leu-Asp、Thr-Leu、Val-Leu、Asp-Asp、Thr-Asp、Asp-Thr、Pro-Gly、Glu-Cys、Asp-Ala、Glu-Glu、Gln-Leu、Ile-Arg、His-Asn、Ala-Asp、Asp-Phe、Asp-Ala、Arg-Phe、Gly-Asn、Arg-Arg、Ile-Pro、Met-Pro、Tyr-Glu、HPM、HPQ。

用于预处理大曲样本的相关试剂，包括甲醇、氯仿、内标物甲硫氨酸-d3(10ng/mL)、缬氨酸-d8(10ng/mL)、丙氨酸-d4(10ng/mL)、甘氨酸-d5(10ng/mL)、苯丙氨酸-d5(10ng/mL)、谷氨酰胺-d5(10ng/mL)、丝氨酸-13C(10ng/mL)；用于丹磺酰氯衍生化的相关试剂，包括丹磺酰氯乙腈溶液(50mg/mL)、碳酸钠/碳酸氢钠(0.5M,pH＝9.0)缓冲溶液。

所使用仪器为液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱联用仪，型号为Agilent 1290系列超高效液相色谱仪(Agilent，USA)及Agilent 6546四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱分析系统(Agilent，USA)。

实施例1

(1)大曲样本的制备

将某品牌黄、白、黑拆仓大曲混合得到混合样本，将混合样本经25Hz珠打研磨5分钟制成细曲样本，于-80℃保存。采用混合样本有助于综合地确认大曲中二肽的分布情况，并确定一个普适于不同颜色大曲的预处理及衍生化方法。

(2)大曲样本预处理

取5mg步骤1得到的磨细的大曲样本加入500μL甲醇于4℃浸泡过夜。过夜后加入500μL氯仿，涡旋1分钟后加入200μL超纯水，震荡涡旋30分钟。冰水浴超声10分钟后，于14000g、4℃离心20分钟。取上层水相300μL，向上层水相中加入100μL内标溶液后，于-20℃真空冷冻离心干燥4h，用于进行丹磺酰氯衍生化。内标溶液中内标化合物的种类及浓度为甲硫氨酸-d3(10ng/mL)、缬氨酸-d8(10ng/mL)、丙氨酸-d4(10ng/mL)、甘氨酸-d5(10ng/mL)、苯丙氨酸-d5(10ng/mL)、谷氨酰胺-d5(10ng/mL)、丝氨酸-¹³C(10ng/mL)。

(3)丹磺酰氯衍生化

向每份冷冻干燥后的样本(即，步骤2中取5mg步骤1得到的磨细的大曲样本经预处理后得到的冻干样本)中加入50μL丹磺酰氯乙腈溶液(50mg/mL)，涡旋1分钟后，加入50μL碳酸钠/碳酸氢钠(0.5M，pH＝9.0)缓冲溶液，涡旋1分钟后，加入2μL 2M氢氧化钠溶液，测得pH＝8.0。涡旋1分钟后，于4℃反应75分钟。反应后于14000g离心5分钟，取上清液，使用液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱联用仪对二肽进行检测分析。

实施例2

(1)大曲样本的制备

同实施例1。

(2)大曲样本预处理

同实施例1。

(3)采用不同的丹磺酰氯衍生化条件

①pH

通过向反应体系中加入不同浓度的氢氧化钠溶液来改变丹磺酰氯衍生化的反应体系的pH，所述不同浓度的氢氧化钠溶液包括2M、0.2M、0.02M、2mM、0.2mM、0.02mM六个浓度，可使pH范围为7～10。

具体地，向每份干燥后的样本中加入50μL丹磺酰氯乙腈溶液(50mg/mL)，涡旋1分钟后，加入50μL碳酸钠/碳酸氢钠(0.5M，pH＝9.0)缓冲溶液，涡旋1分钟后，分别加入2μL浓度为2M、0.2M、0.02M、2mM、0.2mM或0.02mM的氢氧化钠溶液，测得pH＝8.0。涡旋1分钟后，于4℃反应75分钟。反应后于14000g离心5分钟，取上清液，使用液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱联用仪对二肽进行检测分析。

②试剂用量

通过加入不同体积及浓度的丹磺酰氯乙腈溶液来改变丹磺酰氯衍生化的反应体系中的衍生化试剂用量，所述衍生化试剂用量包括丹磺酰氯0.09735、0.125、0.1875、0.25、0.375、0.5、0.625、1.25、1.875、2.5mg十个用量。

具体地，向前6份平行处理干燥后的样本中分别加入18.75、25、37.5、50、75、100μL丹磺酰氯乙腈溶液(5mg/mL)，向后4份平行处理干燥后的样本中分别加入12.5、25、37.5、50μL丹磺酰氯乙腈溶液(50mg/mL)，涡旋1分钟后，加入与丹磺酰氯乙腈溶液等体积的碳酸钠/碳酸氢钠(0.5M，pH＝9.0)缓冲溶液，涡旋1分钟后，加入2μL浓度为2M的氢氧化钠溶液，测得pH＝8.0。涡旋1分钟后，于4℃反应75分钟。反应后于14000g离心5分钟，取上清液，使用液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱联用仪对二肽进行检测分析。

③时间

具体地，向每份干燥后的样本中加入50μL丹磺酰氯乙腈溶液(50mg/mL)，涡旋1分钟后，加入50μL碳酸钠/碳酸氢钠(0.5M，pH＝9.0)缓冲溶液，涡旋1分钟后，加入2μL浓度为2M的氢氧化钠溶液，测得pH＝8.0。涡旋1分钟后，于4℃分别反应10、30、60、75、90分钟。反应后于14000g离心5分钟，取上清液，使用液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱联用仪对二肽进行检测分析。

④温度

具体地，向每份干燥后的样本中加入50μL丹磺酰氯乙腈溶液(50mg/mL)，涡旋1分钟后，加入50μL碳酸钠/碳酸氢钠(0.5M，pH＝9.0)缓冲溶液，涡旋1分钟后，加入2μL浓度为2M的氢氧化钠溶液，测得pH＝8.0。涡旋1分钟后，分别于4℃、10℃、25℃、40℃、60℃、80℃反应75分钟。反应后于14000g离心5分钟，取上清液，使用液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱联用仪对二肽进行检测分析。

(4)液相色谱-质谱联用分析

①液相色谱分析条件：采用Agilent 1290系列超高效液相色谱仪(Agilent，USA)，色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C8(2.1mm×100mm，1.7μm)，柱温：50℃，流速0.35mL/min，水相(A相)为含有体积浓度0.1％甲酸的水溶液，有机相(B相)为含有体积浓度0.1％甲酸的乙腈溶液，色谱梯度为：初始梯度为5％有机相(体积比)，维持1分钟5％有机相，有机相从第1分钟到第24分钟线性升到100％，从第24分钟到第28分钟维持100％有机相，从第28分钟到第28.1分钟将有机相降至5％，平衡该梯度至30分钟。

②质谱条件：采用Agilent 6546四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱分析系统(Agilent，USA)，喷雾电压为4.0kV；脱溶剂气流量为8L/min，温度为320℃；鞘气流量为11L/min，温度350℃。扫描模式为正离子全扫描模式，扫描质荷比范围为100-1300。

③结果及判断分析

利用安捷伦MassHunter Qualitative Analysis软件对二肽衍生化产物色谱峰进行提取，并与二肽标准品衍生化产物色谱保留时间进行比对，对大曲中二肽进行分析鉴定。

衍生化条件优化结果如图1-4所示。

如图1所示，低温(4℃、10℃)条件下的二肽衍生化产物峰响应明显高于常规温度(40℃、60℃)条件。

如图2所示，随着反应体系中丹磺酰氯的量的增多，二肽衍生化产物峰响应逐渐升高，衍生化试剂用量为2.5mg时最高。

如图3所示，向体系中加入2μL 2M NaOH溶液时，二肽衍生化产物的峰响应最强，测得pH＝8.0。

如图4所示，随着反应时间延长，二肽衍生化产物响应略有上升，其中75min时所有二肽均能获得较高的衍生化效率。

综上所述，确定最佳丹磺酰氯衍生化条件为5mg的大曲样本加入2.5mg丹磺酰氯后调节pH为8.0，并于4℃下反应75min。

实施例3

为进一步对比低温及常规温度下的丹磺酰氯衍生化效果，平行制备两份大曲样本，分别于4℃和60℃进行衍生化。每个样本平行进样3次，对比考察衍生化效果。

(1)大曲样本的制备

同实施例1。

(2)大曲样本预处理

同实施例2。

(3)丹磺酰氯衍生化

具体地，向每份干燥后的样本中加入50μL丹磺酰氯乙腈溶液(50mg/mL)，涡旋1分钟后，加入50μL碳酸钠/碳酸氢钠(0.5M，pH＝9.0)缓冲溶液，涡旋1分钟后，加入2μL浓度为2M的氢氧化钠溶液，测得pH＝8.0。涡旋1分钟后，分别于4℃、60℃反应75分钟。反应后于14000g离心5分钟，取上清液，使用液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱联用仪对二肽进行检测分析。

如图5所示，经对比发现，包括Tyr-Leu、Gln-Glu、Asp-Phe、His-His、Pro-Gln、Pro-Thr、Tyr-Pro在内的部分二肽，只有在4℃条件下可以检出，而在60℃条件下未检出。且相比于60℃，4℃下的二肽衍生化产物总体峰响应明显提高，其中，45种二肽的衍生化产物峰响应能提高至1.5倍以上。Ile-Tyr、Ile-Pro、Met-Ile、Pro-Ile、Gly-Phe、Glu-Thr、Met-Leu、Leu-Pro、Leu-Phe、Glu-Phe、Pro-Arg、Leu-Tyr共12种二肽的衍生化产物峰响应能提高至2倍以上。上述结果证实了部分二肽在高温下会发生降解，进而影响分析结果。低温的衍生化条件可以有效避免二肽的降解问题。

采用4℃衍生化条件，从大曲混合样本中检测出132种二肽物质。表1为大曲混合样本中检测出的132种二肽物质信息，包括化合物名称、CAS号以及色谱保留时间。

表1大曲中检测到的132种二肽物质

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.用于分析检测白酒大曲中二肽类物质的丹磺酰氯衍生化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)白酒大曲的预处理

将白酒大曲样本经25～30Hz珠打研磨5～8分钟成粉末状细曲样本；向3～6mg珠打研磨后的大曲样本中加入400～600μL甲醇，于3～5℃浸泡过夜后加入400～600μL氯仿，涡旋1～2分钟后加入100～300μL超纯水，涡旋20～40分钟后离心取200～400μL上层水相，加入50～100μL二肽标样溶液，真空冷冻干燥；(2)丹磺酰氯衍生化

向真空冷冻干燥后的样本提取物中加入40～60μL的40～50mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液，涡旋1～2分钟后，加入等体积0.4～0.6M、pH＝9.0～9.2的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液，涡旋1～2分钟后，加入1～3μL、1～3M的氢氧化钠溶液，涡旋1～2分钟后，于4℃～10℃反应60～80分钟，于12000～15000g离心5～10分钟后，取上清液用于液质联用分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白酒大曲包括黄曲、白曲、黑曲三种类型的拆仓大曲。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二肽为除了半胱氨酸之外的十九种组成生命体蛋白质的氨基酸所组成的361种直链二肽中的一种或二种以上，十九种氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二肽标样，包括His-Asp、Thr-Val、Leu-His、His-Val、Asp-Val、Val-His、His-His、His-Thr、Val-Val、Thr-Thr、His-Leu、Asp-Leu、Asp-His、Leu-Val、Leu-Asp、Thr-Leu、Val-Leu、Asp-Asp、Thr-Asp、Asp-Thr、Pro-Gly、Glu-Cys、Asp-Ala、Glu-Glu、Gln-Leu、Ile-Arg、His-Asn、Ala-Asp、Asp-Phe、Asp-Ala、Arg-Phe、Gly-Asn、Arg-Arg、Ile-Pro、Met-Pro、Tyr-Glu、HPM、HPQ。

5.利用液相色谱-质谱联用技术对白酒大曲中的二肽进行分析检测的方法，其特征在于，利用权利要求1～4任一所述方法对白酒大曲中二肽类物质进行丹磺酰氯衍生化，然后利用液相色谱-质谱联用技术对样本进行分析，通过对数据中的衍生化二肽色谱峰进行提取，得到可用于表征二肽相对含量的数据。