CN110196300A - 一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法 - Google Patents

一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，包括：将烟草样品进行萃取后获得的样品溶液，采用LC‑MS/MS进行检测，通过HILIC色谱柱分离氨基酸及Amadori化合物，根据各种氨基酸及Amadori化合物的保留时间、母离子及子离子的质荷比定性，标准曲线法定量，确定样品溶液中氨基酸及Amadori化合物的含量。本发明提供的一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，能够同时对烟草中16种氨基酸及5种Amadori化合物进行定性定量分析，具有前处理过程简便、检测快速、分离度高、灵敏度高的优点。

Description

一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析 方法
技术领域
本发明属于烟草中化学成分分析的技术领域，涉及一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，具体涉及烟草中16种氨基酸及5种Amadori化合物的HILIC色谱分析方法。
背景技术
氨基酸是烟叶中的重要化学成分，同时也是烟草中的一类重要致香物质。适量的氨基酸有助于提高烟气劲头和丰满度，但含量过高则会导致烟气辛辣、刺激性强。
在烟草调制、烘烤等过程中，氨基酸与还原糖之间可能发生一系列非酶促棕色化反应(美拉德反应)，对烟叶的品质及颜色都能够产生显著影响。Amadori化合物(Amadoriproducts:1-氨基-1-脱氧-2-酮糖类化合物)是美拉德反应的初级产物，也是重要的香味前体物质。对于烟草中氨基酸及Amadori化合物含量的分析，能够为卷烟配方、烟叶加料、醇化以及卷烟贮存等过程提供理论指导，并在评价烟草品质及卷烟质量方法提出监控方法。
目前，常见的检测方法大多是将氨基酸与Amadori化合物进行分别测定，主要采用液相色谱、离子色谱分离，以衍生后的紫外检测器、蒸发光散射检测器进行检测，或是经过衍生以气相色谱-质谱联用仪进行分析。以上这些方法存在前处理复杂、分辨率低、衍生化试剂不稳定等缺点。
因此，建立一种能够同时测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的分析检测技术显得十分重要。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，用于解决现有技术中缺乏能够同时测定16种氨基酸及5种Amadori化合物的基于HILIC色谱的液相色谱-串联质谱联用方法的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，包括：将烟草样品进行萃取后获得的样品溶液，采用LC-MS/MS进行检测，通过HILIC色谱柱分离氨基酸及Amadori化合物，根据各种氨基酸及Amadori化合物的保留时间、母离子及子离子的质荷比定性，标准曲线法定量，确定样品溶液中氨基酸及Amadori化合物的含量。
优选地，所述氨基酸选自天冬氨酸(CAS号为56-84-8)、丙氨酸(CAS号为56-41-7)、缬氨酸(CAS号为72-18-4)、亮氨酸(CAS号为61-90-5)、异亮氨酸(CAS号为73-32-5)、丝氨酸(CAS号为56-45-1)、苏氨酸(CAS号为72-19-5)、酪氨酸(CAS号为60-18-4)、脯氨酸(CAS号为147-85-3)、精氨酸(CAS号为74-79-3)、组氨酸(CAS号为71-00-1)、谷氨酸(CAS号为56-86-0)、苯丙氨酸(CAS号为63-91-2)、赖氨酸(CAS号为56-87-1)、天门冬酰胺(CAS号为70-47-3)、谷氨酰胺(CAS号为56-85-9)中的一种或多种组合。
更优选地，所述氨基酸为16种，包括有天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺。
优选地，所述Amadori化合物选自Fru-Ala(CAS号为16124-24-6)、Fru-Pro(CAS号为29118-61-4)、Fru-Phe(CAS号为31105-03-3)、Fru-Asn(CAS号为34393-27-6)、Fru-Asp(CAS号为31105-02-9)中的一种或多种组合。
更优选地，所述Amadori化合物为5种，包括有Fru-Ala、Fru-Pro、Fru-Phe、Fru-Asn、Fru-Asp。
优选地，所述烟草样品要烘干后粉碎、过筛，获得粉末样品。
更优选地，所述过筛的筛网网孔为60-80目。
优选地，所述萃取是将烟草样品加入盐酸水溶液和内标溶液，超声后离心，取上清液过滤后获得的样品溶液。
更优选地，所述烟草样品加入的质量g与盐酸水溶液加入的体积mL之比为2:180-220。进一步优选地，所述烟草样品加入的质量g与盐酸水溶液加入的体积mL之比为2:200。
更优选地，所述盐酸水溶液为浓度为0.05-0.15mol/mL的盐酸水溶液。进一步优选地，所述盐酸水溶液为浓度为0.1mol/mL的盐酸水溶液。
更优选地，所述内标溶液为含正缬氨酸的盐酸水溶液。
进一步优选地，所述内标溶液中正缬氨酸的浓度为2-4mg/mL。最优选地，所述内标溶液中正缬氨酸的浓度为3mg/mL。
进一步优选地，所述内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.05-0.15mol/mL。最优选地，所述内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.1mol/mL。
更优选地，所述烟草样品加入的质量g与内标溶液加入的体积μL之比为2:180-220。进一步优选地，所述烟草样品加入的质量g与内标溶液加入的体积μL之比为2:200。
更优选地，所述超声时间为25-35min。进一步优选地，所述超声时间为30min。
更优选地，所述离心的转速为3500-4500r/min。进一步优选地，所述离心的转速为4000r/min。
更优选地，所述离心的时间为4-6min。进一步优选地，所述离心的时间为5min。
更优选地，所述过滤为滤膜过滤。所述滤膜为0.22μm PTFE滤膜。
优选地，所述液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)中，所述液相色谱的测定条件为：
色谱柱：HILIC色谱柱；柱温：20-40℃；进样量：0.1-0.5μL；流速：0.6-1.0mL/min；流动相A相：100-300mmol/L甲酸铵水溶液(以甲酸调节至pH＝2-4)；流动相B相：乙腈；流动相C相：水；梯度洗脱。
更优选地，所述液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)中，所述液相色谱的测定条件为：
色谱柱：HILIC-Z色谱柱(柱长100mm×内径2.1mm，粒径2.7μm)；柱温：30℃；进样量：0.2μL；流速：0.8mL/min；流动相A相：200mmol/L甲酸铵水溶液(以甲酸调节至pH＝3)；流动相B相：乙腈；流动相C相：水；梯度洗脱。
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-10min，A相：B相：C相体积比为10：90：0-10：63：27；
10-15min，A相：B相：C相体积比为10：63：27-10：63：27；
15-16min，A相：B相：C相体积比为10：63：27-10：90：0。
优选地，所述液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)中，所述质谱的测定条件为：
电离方式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；雾化气(Gas1)压力：50-70psi；干燥器流速：10-16L/min；干燥器气温度：300-400℃；毛细管电压：4000-6000V；质谱检测方式：Dynamic MRM模式。
更优选地，所述液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)中，所述质谱的测定条件为：
电离方式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；雾化气(Gas1)压力：60psi；干燥器流速：13L/min；干燥器气温度：350℃；毛细管电压：5000V；质谱检测方式：Dynamic MRM模式。
优选地，所述各种氨基酸及Amadori化合物的保留时间、母离子及子离子质荷比见下表1。所述各种氨基酸及Amadori化合物的保留时间、母离子及子离子质荷比通过LC-MS/MS对各种氨基酸及Amadori化合物的单一标准溶液检测而获得。从而建立氨基酸及Amadori化合物的保留时间、母离子及子离子质荷比的数据库。其中，所述单一标准溶液是将氨基酸及Amadori化合物中的一种，加入盐酸水溶液，再加入内标溶液，配成。子离子包括定量离子和定性离子。
表1
优选地，所述标准曲线法，包括以下步骤：
1)将氨基酸及Amadori化合物的标准品，加入盐酸水溶液，再加入内标溶液，配成一系列不同浓度的混合标准工作溶液；
2)将步骤1)中的一系列不同浓度的混合标准工作溶液，分别进行LC-MS/MS分析，获得各种氨基酸及Amadori化合物/内标的色谱峰面积比与相应氨基酸及Amadori化合物/内标的浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各种氨基酸及Amadori化合物的标准工作曲线的回归方程；
3)将样品溶液进行LC-MS/MS分析，将获得的各种氨基酸及Amadori化合物与内标的色谱峰面积比，代入步骤2)中相应氨基酸及Amadori化合物的标准工作曲线的回归方程，并根据内标物的已知浓度，计算得到样品溶液中相应氨基酸及Amadori化合物的含量。
更优选地，步骤1)中，所述标准工作溶液是将氨基酸及Amadori化合物的标准品，加入盐酸水溶液，逐级稀释后获得的混合储备溶液，加入内标溶液，再加入盐酸水溶液溶解定容后获得。
进一步优选地，所述混合储备溶液包括有单一标准储备液、一级混合储备溶液和二级混合储备溶液，所述单一标准储备液中每种氨基酸及Amadori化合物的浓度均为25mmol/L，所述一级混合储备溶液中每种氨基酸及Amadori化合物的浓度均为2500pmol/μL，所述二级混合储备溶液中每种氨基酸及Amadori化合物的浓度均为250pmol/μL。
更优选地，步骤1)中，所述标准工作溶液中各种氨基酸及Amadori化合物的浓度均为0.5-500pmol/μL。
更优选地，步骤1)中，所述盐酸水溶液为浓度为0.05-0.15mol/mL的盐酸水溶液。进一步优选地，所述盐酸水溶液为浓度为0.1mol/mL的盐酸水溶液。
更优选地，步骤1)中，所述内标溶液为含正缬氨酸的盐酸水溶液。
进一步优选地，所述内标溶液中正缬氨酸的浓度为2-4mg/mL。最优选地，所述内标溶液中正缬氨酸的浓度为3mg/mL。
进一步优选地，所述内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.05-0.15mol/mL。最优选地，所述内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.1mol/mL。
更优选地，步骤2)或3)中，所述标准工作曲线中，以各种氨基酸及Amadori化合物与内标的色谱峰面积比为纵坐标(Y轴)，其相应氨基酸及Amadori化合物与内标的浓度比为横坐标(X轴)。
如上所述，本发明提供的一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，能够同时对烟草中16种氨基酸及5种Amadori化合物进行定性定量分析，具有前处理过程简便、检测快速、分离度高、灵敏度高的优点，可以实现多种目标化合物的高通量分析检测，适用于烟草等复杂样品中氨基酸及Amadori化合物的分析检测需求。本发明中方法基于HILIC色谱的液相色谱串联质谱法具有分离效率高、适用范围广、灵敏度高、检测高通量等优点，简化了样品前处理过程，有效缩短样品分析时间。本方法通过全扫描的质谱数据采集模式，获得全部离子及其碎片离子信息，以母离子及子离子的质荷比及色谱保留时间对氨基酸及Amadori化合物进行定性，以碎片离子信息为目标化合物鉴定进行确证，定性能力更强，检测灵敏度更高，避免假阳性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂及仪器如下：
1、试剂
16种氨基酸、5种Amadori化合物(Sigma-Aldrich Chemicals公司)；正缬氨酸(梯希爱上海化成工业发展有限公司)；乙腈(色谱纯，百灵威科技有限公司)；盐酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲酸铵(分析纯，百灵威科技有限公司)；甲酸(分析纯，百灵威科技有限公司)。
2、仪器
1260Infinity型液相色谱仪(美国Agilent公司)；HILIC-Z色谱柱(柱长100mm×内径2.1mm、粒径2.7μm，美国Agilent公司)；6410型质谱仪(美国Agilent公司)；电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；超声波仪(瑞士SONO公司)；离心机(Eppfendof公司)。
在一个具体实施例中，对于测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，包括以下的检测过程。
1、样品前处理
将烟草样品烘干后粉碎，过网孔为60-80目的筛，获得粉末样品。将烟草粉末样品加入盐酸水溶液和内标溶液，超声25-35min后以3500-4500r/min的转速离心4-6min，取上清液过0.22μm PTFE滤膜后，获得的样品溶液。其中，盐酸水溶液为浓度为0.05-0.15mol/mL的盐酸水溶液，烟草样品加入的质量g与盐酸水溶液加入的体积mL之比为2:180-220。内标溶液为含正缬氨酸的盐酸水溶液，内标溶液中正缬氨酸的浓度为2-4mg/mL，内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.05-0.15mol/mL，烟草样品加入的质量g与内标溶液加入的体积μL之比为2:180-220。
2、测定
取16种氨基酸、5种Amadori化合物的标准品，分别加入盐酸水溶液，再加入内标溶液，配成含单个氨基酸或Amadori化合物的单一标准溶液，分别进行LC-MS/MS分析，从而获得各种氨基酸及Amadori化合物的保留时间、母离子及子离子质荷比，具体数据见表1。从而对16种氨基酸、5种Amadori化合物进行定性。
将16种氨基酸、5种Amadori化合物的标准品，加入盐酸水溶液，再加入内标溶液，配成一系列不同浓度的混合标准工作溶液。其中，盐酸水溶液为浓度为0.05-0.15mol/mL的盐酸水溶液。内标溶液为含正缬氨酸的盐酸水溶液，内标溶液中正缬氨酸的浓度为2-4mg/mL，内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.05-0.15mol/mL。标准工作溶液是将氨基酸及Amadori化合物的标准品，加入盐酸水溶液，逐级稀释后获得的混合储备溶液，加入内标溶液，再加入盐酸水溶液溶解定容后获得。混合储备溶液包括有单一标准储备液、一级混合储备溶液和二级混合储备溶液，单一标准储备液中每种氨基酸及Amadori化合物的浓度均为25mmol/L，一级混合储备溶液中每种氨基酸及Amadori化合物的浓度均为2500pmol/μL，二级混合储备溶液中每种氨基酸及Amadori化合物的浓度均为250pmol/μL。标准工作溶液中各种氨基酸及Amadori化合物的浓度均为0.5-500pmol/μL。
将一系列不同浓度的混合标准工作溶液，分别进行LC-MS/MS分析，获得各种氨基酸及Amadori化合物/内标的色谱峰面积比与相应氨基酸及Amadori化合物/内标的浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各种氨基酸及Amadori化合物的标准工作曲线的回归方程。
将步骤1获得的样品溶液进行LC-MS/MS分析，将获得的各种氨基酸及Amadori化合物与内标的色谱峰面积比，代入相应氨基酸及Amadori化合物的标准工作曲线的回归方程，并根据内标物的已知浓度，计算得到样品溶液中相应氨基酸及Amadori化合物的含量。标准工作曲线中，以各种氨基酸及Amadori化合物与内标的色谱峰面积比为纵坐标(Y轴)，其相应氨基酸及Amadori化合物与内标的浓度比为横坐标(X轴)。
所述液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)中，所述液相色谱的测定条件为：
色谱柱：HILIC色谱柱；柱温：20-40℃；进样量：0.1-0.5μL；流速：0.6-1.0mL/min；流动相A相：100-300mmol/L甲酸铵水溶液(以甲酸调节至pH＝2-4)；流动相B相：乙腈；流动相C相：水；梯度洗脱。
所述梯度洗脱的具体程序为：
0-10min，A相：B相：C相体积比为10：90：0-10：63：27；
10-15min，A相：B相：C相体积比为10：63：27-10：63：27；
15-16min，A相：B相：C相体积比为10：63：27-10：90：0。
所述液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)中，所述质谱的测定条件为：
电离方式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；雾化气(Gas1)压力：50-70psi；干燥器流速：10-16L/min；干燥器气温度：300-400℃；毛细管电压：4000-6000V；质谱检测方式：Dynamic MRM模式。
实施例1
1、样品前处理
将烟草样品烘干后粉碎，过网孔为70目的筛，获得粉末样品。称取0.2g烟草粉末样品，精确至0.1mg，于50mL具盖离心管中，加入20mL 0.1mol/mL盐酸水溶液以及20μL内标溶液，超声30min后以4000r/min的转速离心5min，取上清液过0.22μm PTFE滤膜后，获得的样品溶液1#。其中，烟草样品加入的质量g与盐酸水溶液加入的体积mL之比为2:200。内标溶液为含正缬氨酸的盐酸水溶液，是称取30mg正缬氨酸，精确至0.1mg，于10mL容量瓶中，用0.1mol/mL盐酸水溶液稀释定容至刻度。即内标溶液中正缬氨酸的浓度为3mg/mL，内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.1mol/mL，烟草样品加入的质量g与内标溶液加入的体积μL之比为2:200。
2、测定
取16种氨基酸、5种Amadori化合物的标准品，分别加入盐酸水溶液，再加入内标溶液，配成含单个氨基酸或Amadori化合物的单一标准溶液，分别进行LC-MS/MS分析，从而获得各种氨基酸及Amadori化合物的保留时间、母离子及子离子质荷比，具体数据见表1。从而对16种氨基酸、5种Amadori化合物进行定性，单一标准溶液中氨基酸或Amadori化合物的浓度为250pmol/μL。
将16种氨基酸、5种Amadori化合物的标准品，加入盐酸水溶液，再加入内标溶液，配成一系列不同浓度的混合标准工作溶液。其中，盐酸水溶液为浓度为0.1mol/mL的盐酸水溶液。内标溶液为含正缬氨酸的盐酸水溶液，内标溶液中正缬氨酸的浓度为3mg/mL，内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.1mol/mL。标准工作溶液是将氨基酸及Amadori化合物的标准品，加入盐酸水溶液，逐级稀释后获得的混合储备溶液，加入内标溶液，再加入盐酸水溶液溶解定容后获得。
混合储备溶液包括有单一标准储备液、一级混合储备溶液和二级混合储备溶液，其配制方法如下：
单一标准储备液是分别称取0.25mmol每种氨基酸及Amadori标准物质，精确至0.1mg，至不同的10mL容量瓶中，用0.1mol/mL盐酸水溶液稀释定容。
一级混合储备溶液是移取各氨基酸及Amadori化合物单一标准储备液各1mL于10mL容量瓶中，用0.1mol/mL盐酸水溶液稀释定容至刻度。
二级混合储备溶液是移取一级混合标准储备液1mL于10mL容量瓶中，用0.1mol/mL盐酸水溶液稀释定容至刻度。
从而获得的单一标准储备液中每种氨基酸及Amadori化合物的浓度均为25mmol/L，一级混合储备溶液中每种氨基酸及Amadori化合物的浓度均为2500pmol/μL，二级混合储备溶液中每种氨基酸及Amadori化合物的浓度均为250pmol/μL。
混合标准工作溶液是分别移取一级混合标准储备液10μL、20μL、50μL、200μL、500μL、1mL、2mL到不同10mL容量瓶中，每个容量瓶移入10μL内标溶液，用0.1mol/mL盐酸水溶液定容，对应浓度分别为2.5pmol/μL、5pmol/μL、12.5pmol/μL、50pmol/μL、125pmol/μL、250pmol/μL、500pmol/μL。分别移取二级混合标准储备液20μL、40μL到不同的10mL容量瓶中，每个容量瓶移入10μL内标溶液，用0.1mol/mL盐酸水溶液定容，对应浓度分别为0.5pmol/μL、1pmol/μL。
将上述一系列不同浓度的混合标准工作溶液，分别进行LC-MS/MS分析，获得各种氨基酸及Amadori化合物/内标的色谱峰面积比与相应氨基酸及Amadori化合物/内标的浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各种氨基酸及Amadori化合物的标准工作曲线的回归方程。
将步骤1获得的样品溶液进行LC-MS/MS分析，将获得的各种氨基酸及Amadori化合物与内标的色谱峰面积比，代入相应氨基酸及Amadori化合物的标准工作曲线的回归方程，并根据内标物的已知浓度，计算得到样品溶液中相应氨基酸及Amadori化合物的含量。标准工作曲线中，以各种氨基酸及Amadori化合物与内标的色谱峰面积比为纵坐标(Y轴)，其相应氨基酸及Amadori化合物与内标的浓度比为横坐标(X轴)。
所述液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)中，所述液相色谱的测定条件为：
色谱柱：HILIC-Z色谱柱(柱长100mm×内径2.1mm，粒径2.7μm)；柱温：30℃；进样量：0.2μL；流速：0.8mL/min；流动相A相：200mmol/L甲酸铵水溶液(以甲酸调节至pH＝3)；流动相B相：乙腈；流动相C相：水；梯度洗脱。
所述梯度洗脱的具体程序为：
0-10min，A相：B相：C相体积比为10：90：0-10：63：27；
10-15min，A相：B相：C相体积比为10：63：27-10：63：27；
15-16min，A相：B相：C相体积比为10：63：27-10：90：0。
所述液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)中，所述质谱的测定条件为：
电离方式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；雾化气(Gas1)压力：60psi；干燥器流速：13L/min；干燥器气温度：350℃；毛细管电压：5000V；质谱检测方式：Dynamic MRM模式。
实施例2
按实施例1中混合标准工作溶液的配制步骤，对16种氨基酸及5种Amadori化合物建立混合标准工作溶液，混合标准工作溶液中对应浓度分别为1pmol/μL、2.5pmol/μL、5pmol/μL、12.5pmol/μL、50pmol/μL、125pmol/μL、250pmol/μL。将上述一系列不同浓度的混合标准工作溶液，分别进行LC-MS/MS分析，获得各种氨基酸及Amadori化合物/内标的色谱峰面积比与相应氨基酸及Amadori化合物/内标的浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各种氨基酸及Amadori化合物的标准工作曲线的回归方程，结果如表2所示。由表2可知，16种氨基酸及5种Amadori化合物在浓度1-250pmol/μL范围内测得的峰面积呈良好的线性关系，相关系数(R2)均在0.99以上。
表2 16种氨基酸及5种Amadori化合物的线性范围及线性相关系数(pmol/μL)
实施例3
按实施例1中前处理及测定步骤，选取烟草样品1天内进行5次平行测定，考察方法的日内重复性。同样选取烟草样品，进行连续三天测定，每天进行5次平行测定，考察方法的日间重复性。具体结果见表3。由表3可知，16种氨基酸及5种Amadori化合物的相对标准偏差(RSD)都在10％以下，说明该方法的重复性良好。
表3烟草样品的日内及日间重复性
实施例4
按实施例1中前处理及测定步骤，选取烟草样品的高、中、低三个加标水平，进行样品加标回收率的测定，加标量分别为2.5，25，125pmol/μL，相应的回收率见表4。由表4可知，在高、中、低三个加标量的添加水平下，各待测化合物的回收率较好。
表4样品的加标回收率
实施例5
选择3个烟草样品S01、S02、S03，按实施例1中前处理及测定步骤，进行分析，测定结果见表5。由表5可知，本发明中的分析方法能够同时有效测定烟草中各种氨基酸及Amadori化合物的含量。
表5基于LC-MS/MS方法的定量检测结果(mg/g)
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，包括：将烟草样品进行萃取后获得的样品溶液，采用LC-MS/MS进行检测，通过HILIC色谱柱分离氨基酸及Amadori化合物，根据各种氨基酸及Amadori化合物的保留时间、母离子及子离子的质荷比定性，标准曲线法定量，确定样品溶液中氨基酸及Amadori化合物的含量。
2.根据权利要求1所述的一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，其特征在于，所述氨基酸选自天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺中的一种或多种组合；所述Amadori化合物选自Fru-Ala、Fru-Pro、Fru-Phe、Fru-Asn、Fru-Asp中的一种或多种组合。
3.根据权利要求1所述的一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，其特征在于，所述烟草样品要烘干后粉碎、过筛，获得粉末样品。
4.根据权利要求3所述的一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，其特征在于，所述过筛的筛网网孔为60-80目。
5.根据权利要求1所述的一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，其特征在于，所述萃取是将烟草样品加入盐酸水溶液和内标溶液，超声后离心，取上清液过滤后获得的样品溶液。
6.根据权利要求5所述的一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，其特征在于，所述萃取包括以下条件中任一项或多项：
1)所述烟草样品加入的质量g与盐酸水溶液加入的体积mL之比为2:180-220；
2)所述盐酸水溶液为浓度为0.05-0.15mol/mL的盐酸水溶液；
3)所述内标溶液为含正缬氨酸的盐酸水溶液；
4)所述烟草样品加入的质量g与内标溶液加入的体积μL之比为2:180-220；
5)所述超声时间为25-35min；
6)所述离心的转速为3500-4500r/min，所述离心的时间为4-6min；
7)所述过滤为滤膜过滤。
7.根据权利要求6所述的一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，其特征在于，条件3)中，所述内标溶液中正缬氨酸的浓度为2-4mg/mL；所述内标溶液中盐酸水溶液的浓度为0.05-0.15mol/mL。
8.根据权利要求1所述的一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱法中，所述液相色谱的测定条件为：
色谱柱：HILIC色谱柱；柱温：20-40℃；进样量：0.1-0.5μL；流速：0.6-1.0mL/min；流动相A相：100-300mmol/L甲酸铵水溶液，以甲酸调节至pH＝2-4；流动相B相：乙腈；流动相C相：水；梯度洗脱。
9.根据权利要求8所述的一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-10min，A相：B相：C相体积比为10：90：0-10：63：27；
10-15min，A相：B相：C相体积比为10：63：27-10：63：27；
15-16min，A相：B相：C相体积比为10：63：27-10：90：0。
10.根据权利要求1所述的一种测定烟草中氨基酸及Amadori化合物的HILIC色谱分析方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱法中，所述质谱的测定条件为：
电离方式：电喷雾离子源ESI，正离子模式；雾化气Gas1压力：50-70psi；干燥器流速：10-16L/min；干燥器气温度：300-400℃；毛细管电压：4000-6000V；质谱检测方式：DynamicMRM模式。
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