CN106198816A - 一种混合氨基酸含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种混合氨基酸含量测定方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理;(2)高效液相色谱检测,条件如下:色谱柱C18高效液相反相色谱柱;流动相A:0.01%~0.1%(v/v)的甲酸水溶液;流动相B:乙腈∶水=70∶30~50∶50;洗脱梯度0~12min采用90%A和10%B;12~20min采用70%A和30%B;20~30min采用52%A和48%B;30min后采用100%B;柱温30~50℃;检测UV 254nm,按照以上条件将混合氨基酸色谱分离后,再将混合样品进行质谱检测确认。该方法,具有分离率高、重现性好、检测灵敏度高、选择性好、定量准确,操作简单,适用范围较广,适用于多种游离态氨基酸的检测等优点。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域,更具体地,涉及一种混合氨基酸含量测定方法。
背景技术
氨基酸分析检测应用十分广泛,主要应用于食品、医药科学、生态环境等领域。具体而言,富含人体必需氨基酸的食物被认为有高营养价值的,病理学上,血浆氨基酸和有机酸含量的变化作为先天性代谢疾病诊断和治疗的主要依据,生态环境领域,定量土壤环境中氨基酸含量的变化及追踪其转变过程作为描述N循环的强有力的证据。
检测确定氨基酸含量的方法很多。高效液相色谱–电喷雾离子化-质谱(HPLC–ESI-MS)方法作为一种新兴的技术以其高选择性和低检出限显示出较强的优越性。该技术在同位素风度的测定方面已经展示了显著的应用潜能。理论上,对目标化合物的进行质谱检测的时候色谱分离不是必须的,以下三种情况除外:(1)旋光化合物如不先进行分离不能进行质谱分析;(2)同位素的出现可能干扰其他分子,尤其捕获离子的质荷比相差1或2时;(3)如果几种分子同时析出或者离子化时,可能会出现“化学抑制”现象。因此,质谱分析的时候良好的色谱分离是必须的,反之,分析确定未被衍生化的氨基酸时,高灵敏性的质谱分析同样必不可少。
高效液相色谱–电喷雾离子化-质谱技术已经成功的应用于分析2,4-二硝基氟苯(DNFB),9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)等衍生化试剂处理的氨基酸。但是,目前未见有关定量确认高效液相色谱–电喷雾离子化-质谱技术在异硫氰酸苯酯(PITC)衍生化处理的氨基酸方面的报道。目前异硫氰酸苯酯衍生化处理的氨基酸的检测技术依然停留在通过和标准品保留时间的比对来确认的技术层面。
另外,氨基酸的分离方面也存在一些问题。例如,CN 1749748A号专利公开了一种氨基酸的分析方法,在C18柱上,以pH2-3或6-7的磷酸三乙胺(TEAP)/乙腈(ACN)为流动相高效液相色谱分离氨基酸(AA)的2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生物,该专利使用磷酸三乙胺(TEAP)/乙腈(ACN)流动相用于氨基酸的分离。但是使用2,4-二硝基氟苯的氨基酸衍生条件复杂,且产物不稳定,分离结果的重现性不理想。
CN 102621250A号专利公开了一种检测常见氨基酸的液相色谱方法以及其在中药板蓝根中的应用。该专利是将待测样品经过样品预处理后,加入反应溶剂及衍生化试剂9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)进行衍生化反应,然后采用高效液相色谱法测定20种常见氨基酸的浓度。该专利的方法采用通用型的液相色谱柱和紫外检测器对氨基酸进行高效液相色谱测定,使用乙腈和乙酸钠缓冲液作为流动相,可以排除其他物质对氨基酸的干扰。但是,该专利中作为流动相的乙酸钠本身具有不挥发性,容易出现盐析现象,析出的固态盐容易造成色谱柱、管路和密封垫圈的阻塞,影响整个HPLC系统的性能。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种混合氨基酸含量测定方法,其目的在于通过本发明报道的新型高效液相色谱–电喷雾离子化-质谱技术解决目前氨基酸检测方面的灵敏度不高、选择性不高、重复性不高、检测种类少等技术难题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种混合氨基酸含量测定方法,包括以下步骤:
(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理;
(2)采用步骤(1)所述的标准品和高效液相色谱,对待测样品进行检测,高效液相色谱条件如下:
色谱柱:C18高效液相反相色谱柱;
流动相:A:0.01%~0.1%(v/v)的甲酸水溶液;B:乙腈∶水=70∶30~50∶50;
洗脱梯度:0~12min采用90%A和10%B;12~20min采用70%A和30%B;20~30min采用52%A和48%B;30min后采用100%B;
柱温:30~50℃
检测波长:UV 254nm。
(3)将经步骤(2)高效液相色谱分离的样品,进行质谱检测。
优选地,所述氨基酸含量测定方法,其步骤(1)采用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化处理。
优选地,所述氨基酸含量测定方法,其步骤(1)所述标准品为氨基酸标准混合溶液,所述氨基酸标准混合溶液中每种氨基酸的浓度为2.5mmol/L。
优选地,所述氨基酸含量测定方法,其所述氨基酸标准混合溶液,包括以下氨基酸种类:组氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸。
优选地,所述氨基酸含量测定方法,其步骤(3)所述质谱检测,条件如下:
干燥温度,300℃;干燥气体N2,10L min-1;进样口压力,1.0kV;进样口电压,50V;去溶剂化温度,120℃;去溶剂化气体N2,2.5L min-1;进样口气体流速N2,1.7L min-1;离子源,ESI;全扫描模式;质量扫描范围50–600kDa。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,由于,能够取得下列有益效果:
(1)本发明提供氨基酸含量测定方法,通过对样品进行前衍生化处理,并摸索了一套包括色谱柱、流动相、洗脱梯度、柱温、检测条件的测定参数,从而取得分离效率高、检测灵敏度高、定量准确的测定效果。
(2)本发明优选方案,采用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化处理,进一步提高分离效率、检测灵敏度和准确性的同时,重现性和选择性号,扩大了适用的氨基酸范围。
(3)进一步地,采用高效液相色谱与质谱检测连用,使得定量准确,操作简单。
附图说明
图1是实施例1标准混合溶液中所含15种氨基酸的液相色谱图;
图2是实施例1中15种PITC-氨基酸的LC-MS总粒子流图;
图3是实施例1二级质谱分析结果图,其中图3(a)为组氨酸分析结果图;图3(b)为精氨酸分析结果图;图3(c)为丝氨酸分析结果图;图3(d)为甘氨酸分析结果图;图3(e)为谷氨酸分析结果图;图3(f)为天冬氨酸分析结果图;图3(g)为苏氨酸分析结果图;图3(h)为脯氨酸分析结果图;图3(i)为丙氨酸分析结果图;图3(j)为酪氨酸分析结果图;图3(k)为赖氨酸分析结果图;图3(l)为甲硫氨酸分析结果图;图3(m)为缬氨酸分析结果图;图3(n)为亮氨酸分析结果图;图3(o)为苯丙氨酸分析结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的氨基酸含量测定方法,包括以下步骤:
(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理。
优选采用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化处理,步骤如下:
S1、取10μl待检测的溶液至1.5ml离心管中,65℃真空干燥2h,得到干燥的样品;
S2、将上述S1干燥的样品溶于20μl的甲醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1的溶剂中,65℃真空干燥30min,得到预处理的样品;
S3、取20μl的甲醇∶水∶三乙胺∶异硫氰酸苯酯=7∶1∶1∶1的衍生试剂,加入到上述S2处理后的样品中,涡旋震荡,密封,在室温下放静置20min,65℃真空干燥30min,得到的样品待高效液相分析,-20℃保存待用。
优选地,为了便于下一步LC-MS分析,将S3低温保存的样品按S4和S5处理:
S4、将S3冷却保存的样品取出,加入12μl的60%乙腈溶液,涡旋振荡,混合均匀;
S5、加入113μl的所述流动相A,涡旋振荡混合均匀,11000×g离心5min,用0.45μm Nylon 66有机膜过滤,取10μL进样,进行高效液相色谱检测。
所述标准品,优选为氨基酸标准混合溶液,所述氨基酸标准混合溶液中每种氨基酸的浓度为2.5mM,包括以下氨基酸种类:组氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸。
(2)采用步骤(1)所述的标准品和高效液相色谱,对待测样品进行检测,高效液相色谱条件如下:
色谱柱 C18高效液相反相色谱柱;
流动相 A:0.01%~0.1%(v/v)的甲酸水溶液;B:乙腈∶水=70∶30~50∶50;
洗脱梯度 0~12min=90%A和10%B;12~20min=70%A和30%B;20~30min=52%A和48%B;30min后=100%B;
柱温 30~50℃;
检测 UV 254nm。
(3)将经步骤(2)高效液相色谱分离的样品,进行质谱检测。
质谱检测,条件如下:
干燥温度,300℃;干燥气体N2,10L min-1;进样口压力,1.0kV;进样口电压,50V;去溶剂化温度,120℃;去溶剂化气体N2,2.5L min-1;进样口气体流速N2,1.7L min-1;离子源,ESI;全扫描模式;质量扫描范围50–600kDa。
以下为实施例:
实施例1
一种混合氨基酸含量测定方法,包括以下步骤:
(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理。
采用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化处理,步骤如下:
S1、取10μl待检测的溶液至1.5ml离心管中,65℃真空干燥2h,得到干燥的样品;
S2、将上述S1干燥的样品溶于20μl的甲醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1的溶剂中,65℃真空干燥30min,得到预处理的样品;
S3、取20μl的甲醇∶水∶三乙胺∶异硫氰酸苯酯=7∶1∶1∶1的衍生试剂,加入到上述S2处理后的样品中,涡旋震荡,密封,在室温下放静置20min,65℃真空干燥30min,得到的样品待高效液相分析,冷却保存待用。
S4、将S3冷却保存的样品取出,加入12μl的60%乙腈溶液,涡旋振荡,混合均匀;
S5、加入113μl的所述流动相A,涡旋振荡混合均匀,11 000×g离心5min,用0.45μm Nylon 66有机膜过滤,取10μL进样,进行高效液相色谱检测。
所述标准品,优选为氨基酸标准混合溶液,所述氨基酸标准混合溶液中每种氨基酸的浓度为2.5mM,包括以下氨基酸种类:组氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸。
(2)采用步骤(1)所述的标准品和高效液相色谱,对待测样品进行检测,高效液相色谱条件如下:
色谱柱 C18高效液相反相色谱柱;
流动相 A:0.01%的甲酸水溶液;B:乙腈∶水=60∶40;
洗脱梯度 0min=90%A和10%B;12min=70%A和30%B;25min=52%A和48%B;30min后=100%B;
柱温 30℃;
检测 UV 254nm。
(3)将经步骤(2)高效液相色谱分离的样品,进行质谱检测。
质谱检测,条件如下:
干燥温度,300℃;干燥气体N2,10L min-1;进样口压力,1.0kV;进样口电压,50V;去溶剂化温度,120℃;去溶剂化气体N2,2.5L min-1;进样口气体流速N2,1.7L min-1;离子源,ESI;全扫描模式;质量扫描范围50–600kDa。
按照以上条件,流动相A为0.01%时,对15种氨基酸混合溶液进行分离,由实验结果可知,丝氨酸和甘氨酸以及甲硫氨酸与缬氨酸不能够完全分离,这是由于甲酸含量相对较低导致的。流动相B中乙腈含量对该方法的灵敏度有一定的影响,乙腈∶水=60∶40的条件下测出的灵敏度低于乙腈∶水=70∶30时,此条件下具体的灵敏度、线性动力学范围、检出限和定量限见表1。标准混合溶液液相色谱图如图1所示,15种PITC-氨基酸的LC-MS总粒子流图如图2所示,二级质谱分析结果图如图2所示,其中图3(a)为组氨酸分析结果图;图3(b)为精氨酸分析结果图;图3(c)为丝氨酸分析结果图;图3(d)为甘氨酸分析结果图;图3(e)为谷氨酸分析结果图;图3(f)为天冬氨酸分析结果图;图3(g)为苏氨酸分析结果图;图3(h)为脯氨酸分析结果图;图3(i)为丙氨酸分析结果图;图3(j)为酪氨酸分析结果图;图3(k)为赖氨酸分析结果图;图3(l)为甲硫氨酸分析结果图;图3(m)为缬氨酸分析结果图;图3(n)为亮氨酸分析结果图;图3(o)为苯丙氨酸分析结果图。
表1.LC-ESI-MS方法的线性动力学范围、检出限和定量限
实施例2
一种混合氨基酸含量测定方法,包括以下步骤:
(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理。
采用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化处理,步骤如下:
S1、取10μl待检测的溶液至1.5ml离心管中,65℃真空干燥2h,得到干燥的样品;
S2、将上述S1干燥的样品溶于20μl的甲醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1的溶剂中,65℃真空干燥30min,得到预处理的样品;
S3、取20μl的甲醇∶水∶三乙胺∶异硫氰酸苯酯=7∶1∶1∶1的衍生试剂,加入到上述S2处理后的样品中,涡旋震荡,密封,在室温下放静置20min,65℃真空干燥30min,得到的样品待高效液相分析,冷却保存待用。
S4、将S3冷却保存的样品取出,加入12μl的60%乙腈溶液,涡旋振荡,混合均匀;
S5、加入113μl的所述流动相A,涡旋振荡混合均匀,11 000×g离心5min,用0.45μm Nylon 66有机膜过滤,取10μL进样,进行高效液相色谱检测。
所述标准品,优选为氨基酸标准混合溶液,所述氨基酸标准混合溶液中每种氨基酸的浓度为2.5mM,包括以下氨基酸种类:组氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸。
(2)采用步骤(1)所述的标准品和高效液相色谱,对待测样品进行检测,高效液相色谱条件如下:
色谱柱 C18高效液相反相色谱柱;
流动相 A:0.05%(v/v)的甲酸水溶液;B:乙腈∶水=70∶30;
洗脱梯度 6min=90%A和10%B;16min=70%A和30%B;20min=52%A和48%B;30min后=100%B;
柱温 40℃;
检测 UV 254nm。
(3)将经步骤(2)高效液相色谱分离的样品,进行质谱检测。
质谱检测,条件如下:
干燥温度,300℃;干燥气体N2,10L min-1;进样口压力,1.0kV;进样口电压,50V;去溶剂化温度,120℃;去溶剂化气体N2,2.5L min-1;进样口气体流速N2,1.7L min-1;离子源,ESI;全扫描模式;质量扫描范围50–600kDa。
在此条件下,不能够将组氨酸、精氨酸和丝氨酸完全分离,甘氨酸、谷氨酸及天冬氨酸三种物质的峰有重合,完全检测不到苏氨酸、脯氨酸的色谱峰,以上结果可能由于流动相的梯度设置不合理导致的,因此不能将15种物质彻底分离。另外,柱温为40℃略显高,较高的柱温会影响色谱柱的性能,缩短柱子的实用寿命。此条件下,该方法的线性动力学范围、检出限及定量限如表2所示。
表2.LC-ESI-MS方法的线性动力学范围、检出限和定量限
实施例3
一种混合氨基酸含量测定方法,包括以下步骤:
(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理。
采用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化处理,步骤如下:
S1、取10μl待检测的溶液至1.5ml离心管中,65℃真空干燥2h,得到干燥的样品;
S2、将上述S1干燥的样品溶于20μl的甲醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1的溶剂中,65℃真空干燥30min,得到预处理的样品;
S3、取20μl的甲醇∶水∶三乙胺∶异硫氰酸苯酯=7∶1∶1∶1的衍生试剂,加入到上述S2处理后的样品中,涡旋震荡,密封,在室温下放静置20min,65℃真空干燥30min,得到的样品待高效液相分析,冷却保存待用。
S4、将S3冷却保存的样品取出,加入12μl的60%乙腈溶液,涡旋振荡,混合均匀;
S5、加入113μl的所述流动相A,涡旋振荡混合均匀,11 000×g离心5min,用0.45μm Nylon 66有机膜过滤,取10μL进样,进行高效液相色谱检测。
所述标准品,优选为氨基酸标准混合溶液,所述氨基酸标准混合溶液中每种氨基酸的浓度为2.5mM,包括以下氨基酸种类:组氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸。
(2)采用步骤(1)所述的标准品和高效液相色谱,对待测样品进行检测,高效液相色谱条件如下:
色谱柱 C18高效液相反相色谱柱;
流动相 A:0.1%(v/v)的甲酸水溶液;B:乙腈∶水=50∶50;
洗脱梯度12min=90%A和10%B;20min=70%A和30%B;30min=52%A和48%B;30min后=100%B;
柱温 50℃;
检测 UV 254nm。
(3)将经步骤(2)高效液相色谱分离的样品,进行质谱检测。
质谱检测,条件如下:
干燥温度,300℃;干燥气体N2,10L min-1;进样口压力,1.0kV;进样口电压,50V;去溶剂化温度,120℃;去溶剂化气体N2,2.5L min-1;进样口气体流速N2,1.7L min-1;离子源,ESI;全扫描模式;质量扫描范围50–600kDa。
在此条件下,能够将所述样品中的15种物质组氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸彻底分离,可以推论出流动相洗脱梯度的设置相对比较合理,流动相A中甲酸含量稍高对分离基本上无影响,流动相B:乙腈∶水=50∶50,乙腈含量相对较低,导致了15种物质的出峰时间相对较晚,出峰最早的物质组氨酸的出峰时间为12.5min,因此延长了整个分离过程的时间,柱温为50℃对色谱柱的性能损害较大,将严重影响柱子的实用寿命。此条件下,该方法的线性动力学范围、检出限及定量限如表6所示。
实施例4流动相A对分离效果的影响
当B流动相为乙腈∶水=80:20,柱温40℃,紫外检测波长为254nm,进样量10μL,将配置好的2.5mM的氨基酸标准混合液在Agilent Eclipseplus C18色谱柱(4.6mm×250mm×5μm)进行色谱分离,按照表3的梯度洗脱程序,A流动相分别为:0.14M NaAc、0.5mM NaAc进行高效液相色谱分离,发现缓冲液中NaAc浓度的高低对氨基酸色谱分离的结果并无影响,另NaAc的不挥发性,流动相中添加乙腈的量不合适时,容易导致盐析现象,析出的固态盐容易造成色谱柱、管路和密封垫圈的阻塞,影响整个HPLC系统的性能。因此,选择缓冲液中不添加NaAc,以0.01%~0.1%(v/v)的甲酸水溶液为分离15种氨基酸的A流动相,结果表明,上述15种氨基酸在该甲酸水溶液的浓度范围内都可以较好的分离,当A流动相为0.01%甲酸水溶液时,色谱峰过宽,部分色谱峰有重叠;0.1%甲酸水溶液为缓冲液,pH值较低呈现强酸性,不利于色谱柱的长期使用;0.05%的甲酸水溶液pH值适中,各个色谱峰的峰形较好,作为最优选的流动相A。
表3.分离15种氨基酸的梯度洗脱程序
实施例5流动相B对分离效果的影响
按照以下条件:A流动相:0.05%甲酸水溶液,柱温为40℃,紫外检测波长254nm,进样量10μL,在Agilent Eclipse plus C18色谱柱(4.6mm×250mm×5μm)进行色谱分离,按照表3程序进行梯度洗脱,乙腈和水的不同比例50:50、60:40、70∶30。结果表明,上述三种比例均可以达到较好的分离效果,在流动相为乙腈∶水=50:50时两种待测物质分离度高,但是色谱峰过宽,分析时间过长(>30min)且柱压较高。流动相为乙腈:水=60:40时分析时间虽然短,但两种待测物质分离度不够,同一标准品的峰面积比其他比例的峰面积值大,影响分析结果的精准。而在流动相为乙腈:水=70∶30时,两种待测物质分离度高,峰形较好,分析时间只需30min左右。综合考虑保留值、灵敏度和分离度,比较合适的B流动相为乙腈:水=70∶30。
实施例6柱温对分离效果的影响
A流动相为0.05%(v/v)甲酸水溶液,B流动相为乙腈∶水=70∶30,在Agilent Eclipse plus C18色谱柱(4.6mm×250mm×5μm)进行分离,检测波长为254nm,进样量10μL,按照表3的梯度洗脱程序,分别考察了不同柱温(50℃、40℃、30℃)对分离效果的影响。根据实验的结果,不同的柱温对氨基酸的分离效果并无太大的影响,相对较低的柱温有利于柱子的性能稳定,延长柱子的使用寿命,因此选择30℃为合适的柱温。
实施例7氨基酸的确认分析
HPLC条件:A流动相为0.05%(v/v)甲酸水溶液;B流动相:乙腈∶水=70∶30;柱温30℃;进样量10μL;Agilent Eclipse plus C18色谱柱(4.6mm×250mm×5μm);波长=254nm,分析时间为30min,按照表3的梯度程序洗脱。
质谱条件:干燥温度,300℃;干燥气体(N2),10L min-1;进样口压力,1.0kV;进样口电压,50V;去溶剂化温度,120℃;去溶剂化气体(N2),2.5L min-1;和进样口气体流速(N2),1.7L min-1;离子源,ESI;全扫描模式;质量扫描范围50–500kDa。质谱确认的结果如表4所示。
表4.LC-MS数据及氨基酸的确认
α失去PITC(135Da).
β从母核分子上相继失去PITC(135Da)和NH3(17Da).
γ减小135和18Da,表示相继失去PITC和H2O.
δ减小135,18和46 Da,表示从母核分子上相继失去PITC,H2O和CO+H2O.
15种PTC-AA产物离子均包含一种特殊的碎片形式[M+H-PITC]+,相应的m/z从母核分子上减少135Da.根据二级质谱的结果,15种PTC-AA均包含有m/z为156,175,106,76,148,134,120,116,90,182,146,150,118,132和166的碎片离子,均由从母核分子上失去PITC(135Da)而得,这些碎片离子的m/z等于相应的氨基酸的分子量。因此,所有的PTC-AA在氨基酸和PITC结合的位点均产生了断裂。
15种PTC-AA的产物碎片离子均有失去17Da(NH3)、18Da(H2O)、46Da(CO+H2O)的特征。例如:[M+H]+=317(Tyr-PITC)、[M+H]+=285(Met-PITC)的离子碎片均包含有失去PITC(135Da)和NH3(17Da)的特征(Figs.4j、4l),并且NH3(17Da)脱落这个特征已经被相关的文献进行报道,是公认的氨基酸碎片的断裂特征;[M+H]+=283(Glu-PITC)含有碎片m/z 130、102,依次失去135,18和46Da,表示依次失去PITC,H2O和CO+H2O,[M+H]+=269(ASP-PITC)的碎片离子也含有同样的特征;[M+H]+=291、285、253、267和301(His-PITC、Met-PITC、Met-PITC、Val-PITC、Leu-PITC、Phe-PITC)分别包含碎片m/z 110、104、72、86、120,表示相继失去135Da(PITC)和46Da(CO+H2O),而失去46Da(CO+H2O)是氨基酸断裂碎片的明显特征。
由于上述15种PTC-AA的碎片离子断裂的特征,基于推导的分子式:C6H9N3O2、C6H14N4O2、C3H7NO3、C2H5NO2、C5H9NO4、C4H7NO4、C4H9NO3、C5H9NO2、C3H7NO2、C9H11NO3、C6H14N2O2、C5H11NO2S、C5H11NO2、C6H13NO2和C9H11NO2,确认15种物质[M+H]+=156、175、106、76、148、134、120、116、90、182、146、150、118、132、166依次是His、Arg、Ser、Gly、Glu、Asp、Thr、Pro、Ala、Tyr、Lys、Met,Val、Leu和Phe。
实施例8方法验证
配制15种单个氨基酸的标准溶液,浓度范围为0.02~20mmol L-1,依次稀释5~7个不同的梯度,得梯度浓度的单个氨基酸标准溶液,衍生化处理进行分析。根据峰面积(Y)和浓度(X)关系绘图,得15种单个氨基酸的线性范围、回归方程以及相关系数。
精密度指用方法重复测定同一均质样品所得的测定值彼此接近程度,表示分析结果的重复性,常用相对标准偏差(RSD)表示(式1)。
将2.5mM的氨基酸标准混合溶液衍生化处理之后进行色谱分析,在同一天内连续6次测定混合标准溶液,以各组分的峰面积,计算相对标准偏差。
表5.LC-MS方法的线性、精密度
该方法显现出良好的线性,R2=0.991~0.999,根据计算出的日内相对标准偏差为0.839%~6.320%(1天6次),日间相对标准偏差为3.327%~8.962%(3天6次),相对标准偏差均小于10%,因此该方法重现性良好。
检测限(LOD,limit of detection)又称为检出限,指由基质空白所产生的仪器背景信号的3倍值的相应量,或者以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差。常用信噪比法确定定量限,以信噪比为10∶1时相应的浓度或注入仪器的量确定定量限。
表6.LC-ESI-MS方法的线性动力学范围、检出限和定量限
由结果可知,His、Arg、Gly和Pro线性动力学范围完全一致(630–2520μmol L-1),Ser和Asp(645–2578μmol L-1)线性范围也相同,PITC-AA对应的线性范围相对较宽,因此该方法较易应用在更多氨基酸定量方面。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种混合氨基酸含量测定方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理;
(2)采用步骤(1)所述的标准品和高效液相色谱,对待测样品进行检测,高效液相色谱条件如下:
色谱柱:C18高效液相反相色谱柱
流动相:A:0.01%~0.1%(v/v)的甲酸水溶液;B:乙腈∶水=70∶30~50∶50
洗脱梯度:0~12min采用90%A和10%B;
12~20min采用70%A和30%B;
20~30min采用52%A和48%B;
30min后采用100%B;
柱温:30~50℃;
检测波长:UV 254nm;
(3)将经步骤(2)高效液相色谱分离的样品,进行质谱检测。
2.如权利要求1所述的混合氨基酸含量测定方法,其特征在于,所述步骤(1)采用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化处理。
3.如权利要求1所述的混合氨基酸含量测定方法,其特征在于,步骤(1)所述标准品为氨基酸标准混合溶液,所述氨基酸标准混合溶液中每种氨基酸的浓度为2.5mmol/L。
4.如权利要求3所述的混合氨基酸含量测定方法,其特征在于,所述氨基酸标准混合溶液,包括以下氨基酸种类:组氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸。
5.如权利要求1所述的混合氨基酸含量测定方法,其特征在于,步骤(3)所述质谱检测,条件如下:
干燥温度,300℃;干燥气体N2,10L min-1;进样口压力,1.0kV;进样口电压,50V;去溶剂化温度,120℃;去溶剂化气体N2,2.5L min-1;进样口气体流速N2,1.7L min-1;离子源,ESI;全扫描模式;质量扫描范围50–600kDa。
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