CN112955239B - 用于极性分子分析的液相色谱/质谱方法 - Google Patents

用于极性分子分析的液相色谱/质谱方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于测定样品中的磷酸化糖的混合模式色谱方法。该混合模式色谱方法包括获得包含至少一种磷酸化糖的样品。将样品引入色谱系统中。该色谱系统包括柱，该柱具有包含在柱内部的固定相材料。该固定相材料具有包含疏水表面基团和至少一种可电离改性剂的表面。使样品与流动相洗脱液一起流过柱，其中至少一种磷酸化糖在七分钟内基本上被被溶解并保留。流动相洗脱液包括含有添加剂的水和含有添加剂的乙腈。流动相洗脱液具有小于6的pH。使用检测器来检测至少一种磷酸化糖。

Description

用于极性分子分析的液相色谱/质谱方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2018年7月27日提交的名称为“Liquid Chromatography/MassSpectrometry Methods for the Analysis of Polar Molecules”的美国临时专利申请号62/711,093的优先权和权益，该专利申请的全部内容据此以引用方式并入。
技术领域
本公开涉及用于极性分子分析的液相色谱(LC)/质谱(MS)方法。更具体地讲，本公开涉及用于磷酸化糖、氨基酸、有机酸和/或核苷酸分析的LC/MS方法。
背景技术
用目前的色谱技术很难获得酸性高极性分子诸如有机酸、氨基酸、磷酸化糖和核苷酸的色谱保留。目前的方法通常结合使用离子对试剂(Luo等人，Journal ofChromatography B，第1147卷，2007年，第153-164页和Lu等人，Analytical Chemistry，2010年，第82卷，第3212-3221页)、离子色谱(IC)(例如Thermo
Figure GDA0003052120120000011
离子色谱系统(可从Thermo Fisher Scientific Inc.Waltham,MA,USA商购获得))或亲水作用色谱(HILIC)(Bajad等人，Journal of Chromatography A，第1125卷，2006年，第76-88页)。此外，衍生化的使用可作为降低分子极性的手段来进行(Tan等人，AnalyticalBiochemistry，第465卷，2014年，第134-147页)，从而使得为了定量或定性分析的目的保留、分离和随后检测这些分析物成为可能。然而，这些当前的方法可能由于样品或稀释剂的限制、需要专用设备或者与质谱(MS)检测不兼容而遭受负面结果。此外，制备用于这些方法中的专用流动相的过程是费力而耗时。
发明内容
需要的是一种使用常见LC/MS技术与标准流动相来分离酸性极性分子的方法。本技术通过使用带电表面杂化(CSH)反相/混合模式色谱材料以及用于保留和分离磷酸化糖、氨基酸、有机酸和/或核苷酸的标准反相LC和MS相容条件(例如流动相)，解决了现有技术的问题。由于这些分子直接参与了多种疾病状态诸如癌症和糖尿病，因此对这些化合物的分析方法的改进对研究人员、医学界和制药公司都很重要。此外，对这些分子的分析对于从生物反应器制造各种产品是感兴趣的。(Hinder等人，Journal of Endrocrinology，第213卷，2013年，第1-11页和Rustin等人，Biochimica et Biophysica Acta，第1361卷，1997年，第185-197页)。
适用于这些分离的带电表面杂化反相/混合模式吸附剂已在名称为“High PurityChromatography Materials Comprising an Ionable Modifier”的美国专利公布号20130319086A1中进行了定义，该专利公布的内容以引用方式并入本文。简言之，带电表面反相材料是具有由疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂构成的色谱表面的高纯度色谱材料(HPCM)。这些带电表面反相/混合模式材料在HPCM中可具有约2.5:1至约350:1的疏水表面基团：可电离改性剂的比率。在一些实施方案中，疏水表面基团:可电离改性剂的比率介于约4:1至约350:1或约4:1至约22:1或约5:1至约22:1之间。带电表面反相材料在HPCM中的可电离改性剂的浓度可小于约0.5μmol/m2。在一些实施方案中，可电离改性剂的浓度介于约0.03μmol/m2和0.5μmol/m2之间。
CSH吸附剂与反相液相色谱柱一起使用导致混合模式色谱，其中分析物与固定相之间的多于一种形式的相互作用被用于分离样品。CSH吸附剂的使用导致分析物与吸附剂(例如，来自疏水表面基团的吸附剂)之间的疏水相互作用以及分析物与吸附剂(例如，来自可电离改性剂的吸附剂)之间的阴离子交换相互作用两种情况。在本申请中，技术涉及一种混合模式色谱方法，其中疏水相互作用是用于分离的相互作用的形式中的一种形式。因此，该技术可被称为混合模式/反相色谱系统和方法。
在一个方面，该技术涉及用于测定样品中的磷酸化糖的混合模式色谱方法。该混合模式色谱方法包括获得包含至少一种磷酸化糖的样品。将样品引入色谱系统中，该色谱系统包括柱，该柱具有包含在柱内部的固定相材料。该固定相材料具有包含疏水表面基团和至少一种可电离改性剂的表面。样品与流动相洗脱液一起流过柱。至少一种磷酸化糖在七分钟内基本上被溶解并保留。流动相洗脱液包括含有添加剂的水和含有添加剂的乙腈。流动相洗脱液具有小于6的pH。使用检测器来检测至少一种磷酸化糖。该方法可包括以下实施方案中的一个或多个实施方案。
在一些实施方案中，流动相洗脱液的pH小于5。流动相洗脱液的pH可小于3。在一些实施方案中，流动相洗脱液的pH介于约2.5和3之间。流动相洗脱液的pH可为约2.7。
在一些实施方案中，添加剂为0.1％甲酸。添加剂可为质谱相容的缓冲液。质谱相容的缓冲液可为例如甲酸铵、乙酸铵或碳酸氢铵。
在一个实施方案中，流动相洗脱液包含基本上由0.1％甲酸的水溶液组成的流动相A和基本上由0.1％甲酸的乙腈溶液组成的流动相B。流动相洗脱液可具有线性或阶梯梯度洗脱，该线性或阶梯梯度洗脱包括：a.)在初始时间时的100％流动相A、0％流动相B；b.)在3分钟时的70％流动相A、30％流动相B；c.)在3.5分钟时的5％流动相A、95％流动相B；d.)在6.5分钟时的5％流动相A、95％流动相B；以及e.)在7分钟时的100％流动相A、0％流动相B。
样品与流动相洗脱液一起可以0.2mL/min至1.0mL/min的速率流过柱。在一些实施方案中，样品与流动相洗脱液一起以约0.4mL/min的速率流过柱。
疏水表面基团可为氟苯基官能团。疏水表面基团可为苯基己基官能团。在一些实施方案中，疏水表面基团为C18官能团。
一般来讲，检测器可为质谱仪。
在另一方面，该技术涉及用于测定样品中的氨基酸的混合模式色谱方法。该混合模式色谱方法包括获得包含至少一种氨基酸的样品。将样品引入色谱系统中，该色谱系统包括柱，该柱具有包含在柱内部的固定相材料。该固定相材料具有包含疏水表面基团和至少一种可电离改性剂的表面。样品与流动相洗脱液一起流过柱。至少一种氨基酸在七分钟内基本上被溶解并保留。流动相洗脱液包括含有添加剂(例如，0.1％甲酸)的水和含有添加剂(例如，0.1％甲酸)的乙腈。流动相洗脱液具有小于6的pH。使用检测器来检测至少一种氨基酸。该方法可包括以下实施方案中的一个或多个实施方案。
在一些实施方案中，流动相洗脱液的pH小于5。流动相洗脱液的pH可小于3。在一些实施方案中，流动相洗脱液的pH介于约2.5和3之间。流动相洗脱液的pH可为约2.7。
在一些实施方案中，添加剂为0.1％甲酸。添加剂可为质谱相容的缓冲液。
在一个实施方案中，流动相洗脱液包含基本上由0.1％甲酸的水溶液组成的流动相A和基本上由0.1％甲酸的乙腈溶液组成的流动相B。流动相洗脱液可具有线性或阶梯梯度洗脱，该线性或阶梯梯度洗脱包括：a.)在初始时间时的100％流动相A、0％流动相B；b.)在3分钟时的70％流动相A、30％流动相B；c.)在3.5分钟时的5％流动相A、95％流动相B；d.)在6.5分钟时的5％流动相A、95％流动相B；以及e.)在7分钟时的100％流动相A、0％流动相B。
样品与流动相洗脱液一起可以0.2mL/min至1.0mL/min的速率流过柱。在一些实施方案中，样品与流动相洗脱液一起以约0.4mL/min的速率流过柱。
疏水表面基团可为氟苯基官能团。疏水表面基团可为苯基己基官能团。在一些实施方案中，疏水表面基团为C18官能团。
一般来讲，检测器可为质谱仪。
在一些实施方案中，至少一种氨基酸为谷氨酸盐、谷氨酰胺、异亮氨酸或亮氨酸中的一种或多种。
在另一方面，该技术涉及用于测定样品中的有机酸的混合模式色谱方法。该混合模式色谱方法包括获得包含至少一种有机酸的样品。将样品引入色谱系统中，该色谱系统包括柱，该柱具有包含在柱内部的固定相材料。该固定相材料具有包含氟苯基疏水表面基团和可电离改性剂的表面。样品与流动相洗脱液一起流过柱。至少一种有机酸在七分钟内基本上被溶解并保留。流动相洗脱液包含基本上由0.1％甲酸的水溶液组成的流动相A和基本上由0.1％甲酸的乙腈溶液组成的流动相B。流动相洗脱液具有小于6的pH。使用检测器来检测至少一种有机酸。该方法可包括本文所述的实施方案中的任一个实施方案。
至少一种有机酸可为异柠檬酸、乌头酸、α-酮戊二酸、乳酸或丙酮酸中的一种或多种。
该技术提供多个优点。例如，该技术允许以快速方式例如在七分钟内分离磷酸化糖、有机酸、氨基酸和/或核苷酸。此外，该技术允许使用常见LC/MS技术与标准流动相(例如，具有0.1％甲酸的水和具有0.1％甲酸的乙腈)来分离这些分析物，标准流动相在分析实验室中是常见的。
附图说明
通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
图1是根据本技术的例示性实施方案的用于测定样品中的磷酸化糖、氨基酸和/或有机酸的混合模式色谱方法的流程图。
图2是根据本技术的例示性实施方案的混合模式色谱系统的示意图。
图3A是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH C18 100μM STD上分离异柠檬酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图3B是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH C18 100μM STD上分离柠檬酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图3C是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH C18 100μM STD上分离乌头酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图3D是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH C18 100μM STD上分离α酮戊二酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图3E是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH C18 100μM STD上分离琥珀酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图3F是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH C18 100μM STD上分离苹果酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图3G是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH C18 100μM STD上分离富马酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图3H是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH C18 100μM STD上分离乳酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图3I是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH C18 100μM STD上分离丙酮酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图4A是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH苯基己基100μMSTD上分离异柠檬酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图4B是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH苯基己基100μMSTD上分离柠檬酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图4C是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH苯基己基100μMSTD上分离乌头酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图4D是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH苯基己基100μMSTD上分离α-酮戊二酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图4E是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH苯基己基100μMSTD上分离琥珀酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图4F是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH苯基己基100μMSTD上分离苹果酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图4G是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH苯基己基100μMSTD上分离富马酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图4H是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH苯基己基100μMSTD上分离乳酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图4I是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH苯基己基100μMSTD上分离丙酮酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图5A是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH苯基己基100μMSTD上分离异柠檬酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图5B是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH氟苯基100μM STD上分离柠檬酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图5C是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH氟苯基100μM STD上分离异柠檬酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图5D是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH氟苯基100μM STD上分离α-酮戊二酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图5E是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH氟苯基100μM STD上分离琥珀酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图5F是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH氟苯基100μM STD上分离苹果酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图5G是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH氟苯基100μM STD上分离富马酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图5H是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH氟苯基100μM STD上分离乳酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图5I是根据本技术的例示性实施方案的用于在CSH氟苯基100μM STD上分离丙酮酸(TCA循环分析物)的MRM色谱图。
图6A是根据本技术的例示性实施方案的使用BEH C18柱来分离TCA循环代谢物的色谱图。
图6B是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH C18柱来分离TCA循环代谢物的色谱图。
图6C是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH苯基己基柱来分离TCA循环代谢物的色谱图。
图7A是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH C18 STD柱来分离谷氨酸的色谱图。
图7B是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH C18 STD柱来分离谷氨酰胺的色谱图。
图7C是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH C18 STD柱来分离异亮氨酸的色谱图。
图7D是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH C18 STD柱来分离亮氨酸的色谱图。
图8A是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH苯基己基STD柱来分离谷氨酸的色谱图。
图8B是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH苯基己基STD柱来分离谷氨酰胺的色谱图。
图8C是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH苯基己基STD柱来分离异亮氨酸的色谱图。
图8D是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH苯基己基STD柱来分离亮氨酸的色谱图。
图9A是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH氟苯基STD柱来分离谷氨酸的色谱图。
图9B是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH氟苯基STD柱来分离谷氨酰胺的色谱图。
图9C是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH氟苯基STD柱来分离异亮氨酸的色谱图。
图9D是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH氟苯基STD柱来分离亮氨酸的色谱图。
图10A是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH C18柱来分离甲基丙二酸的色谱图。
图10B是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH C18柱来分离琥珀酸的色谱图。
图10C是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH C18柱来分离乌头酸的色谱图。
图10D是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH C18柱来分离衣康酸的色谱图。
图11A是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH苯基己基柱来分离甲基丙二酸的色谱图。
图11B是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH苯基己基柱来分离琥珀酸的色谱图。
图11C是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH苯基己基柱来分离乌头酸的色谱图。
图11D是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH苯基己基柱来分离衣康酸的色谱图。
图12A是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH氟苯基柱来分离甲基丙二酸的色谱图。
图12B是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH氟苯基柱来分离琥珀酸的色谱图。
图12C是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH氟苯基柱来分离乌头酸的色谱图。
图12D是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH氟苯基柱来分离衣康酸的色谱图。
图13A是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH C18柱来分离6-磷酸葡萄糖的色谱图。
图13B是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH苯基己基柱来分离6-磷酸葡萄糖的色谱图。
图13C是根据本技术的例示性实施方案的使用CSH氟苯基柱来分离6-磷酸葡萄糖的色谱图。
具体实施方式
本技术提供了使用混合模式或反相色谱柱来色谱分离和检测极性分子(例如，磷酸化糖、氨基酸、有机酸和/或核苷酸)的方法，该混合模式或反相色谱柱包括固定相材料，该固定相材料具有包含疏水表面基团和至少一种可电离改性剂的表面。
定义
如本文所用，术语“约”意指该数值是近似的，并且较小的变化不会显著影响所公开的实施方案的实践。在使用数值限制的情况下，除非上下文另外指明，否则“约”意指该数值可改变±10％并且仍然在所公开的实施方案的范围内。
如本文所用，术语“高纯度”或“高纯度色谱材料”包括由高纯度前体制备的材料。在某些方面，高纯度材料具有降低的金属污染和/或未减弱的色谱性质，包括但不限于表面硅烷醇的酸度和表面的异质性。
如本文所用，术语“色谱表面”包括提供用于样品的色谱分离的表面。在某些方面，色谱表面是多孔的。在一些方面，色谱表面可以是颗粒、表面多孔材料或整料的表面。在某些方面，色谱表面由在色谱分离过程中组合使用的一种或多种颗粒、表面多孔材料或整料的表面构成。在某些其他方面，色谱表面是无孔的。
如本文所用，术语“可电离改性剂”包括带有给电子或吸电子基团的官能团。在某些方面，可电离改性剂含有一个或多个羧酸基团、氨基基团、亚氨基基团、酰氨基基团、吡啶基基团、咪唑基基团、脲基基团、亚硫酰-脲基基团或氨基硅烷基基团，或其组合。在其他方面，可电离改性剂包含具有带自由电子孤对的氮或磷原子的基团。在某些方面，可电离改性剂共价连接到材料表面并具有可电离基团。在一些情况下，可电离改性剂通过表面杂化基团的化学修饰连接到色谱材料。
如本文所用，术语“疏水表面基团”包括色谱表面上表现出疏水性的表面基团。在某些方面，疏水基团可以是碳键合相，诸如C4-C18键合相。在其他方面，疏水表面基团可含有嵌入式极性基团，使得疏水表面的外部部分保持疏水性。在一些情况下，可电离改性剂通过表面杂化基团的化学修饰连接到色谱材料。在其他情况下，疏水基团可以是C4-C30嵌入式极性、手性苯基烷基或五氟苯基键合和涂层。
如本文所用，术语“杂化”(包括“杂化无机/有机材料”)包括无机类结构，其中有机官能团与内部或“骨架”无机结构以及混合材料表面均形成一体。杂化材料的无机部分可以是例如氧化铝、二氧化硅、钛、铈或锆或其氧化物，或陶瓷材料。
“杂化”包括无机类结构，其中有机官能团与内部或“骨架”无机结构以及杂化材料表面均形成一体。如上所述，示例性杂化材料在美国专利号4,017,528、6,528,167、6,686,035和7,175,913中示出，这些专利中的每一个的内容均以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“表面改性剂”(通常)包括为色谱固定相赋予一定色谱功能的有机官能团。多孔无机/有机杂化材料具有可另外被表面改性剂取代或衍生化的有机基团和硅烷醇基团。
用语“表面改性的”在本文中用于描述具有可另外被表面改性剂取代或衍生化的有机基团和硅烷醇基团两者的本技术复合材料。“表面改性剂”(通常)包括为色谱固定相赋予一定色谱功能的有机官能团。诸如本文所公开的表面改性剂例如通过衍生化或涂覆以及随后的交联而连接到基础材料上，从而为基础材料赋予表面改性剂的化学特性。在一个实施方案中，杂化材料的有机基团与表面改性剂反应形成有机共价键。改性剂可通过有机和聚合物化学中众所周知的许多机制形成与材料的有机基团的有机共价键，这些机制包括但不限于亲核、亲电子、环加成、自由基、碳烯、氮烯和碳正离子反应。有机共价键被定义为涉及在有机化学的常见元素之间形成共价键，所述常见元素包括但不限于氢、硼、碳、氮、氧、硅、磷、硫和卤素。另外，碳-硅和碳-氧-硅键被定义为有机共价键，而硅-氧-硅键不被定义为有机共价键。各种合成转化在文献中是众所周知的，参见例如March，J.AdvancedOrganic Chemistry，第3版，Wiley，New York，1985年。
方法
图1是用于测定样品中的磷酸化糖、氨基酸和/或有机酸的反相或混合模式色谱方法100的流程图。在一些实施方案中，氨基酸为谷氨酸盐、谷氨酰胺、异亮氨酸或亮氨酸。在一些实施方案中，有机酸为三羧酸(TCA)循环的代谢物或中间体，例如异柠檬酸、柠檬酸、乌头酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乳酸、丙酮酸。
反相/混合模式色谱方法100包括获得包含磷酸化糖、氨基酸和/或有机酸105的样品。在一些实施方案中，样品包括磷酸化糖、氨基酸和有机酸。样品可包括磷酸化糖、氨基酸或有机酸中的一种或它们的任何组合。在一些实施方案中，样品包括多种不同类型的糖、氨基酸和/或有机酸。在其他实施方案中，样品还可包括核苷酸。
将样品引入110反相/混合模式色谱系统。图2是示例性反相或混合模式色谱系统200的示意图。反相或混合模式色谱系统200包括存储一种或多种流动相洗脱液的流动相贮存器205。泵210将流动相洗脱液从流动相贮存器205泵送到反相或混合模式色谱柱215。在将样品220引入反相或混合模式色谱柱215之前，引入流动相洗脱液流。样品220和流动相在进入反相或混合模式色谱柱215之前合并，并形成合并的流动流。
流动相洗脱液包括含有添加剂的水和含有添加剂的乙腈。添加剂可为甲酸。在一些实施方案中，添加剂为0.1％甲酸。添加剂可为与质谱相容的缓冲液。流动相洗脱液可由两个单独的流动相组成，即流动相A和流动相B。流动相A可基本上由0.1％甲酸的水溶液组成，并且流动相B可基本上由0.1％甲酸的乙腈溶液组成。
流动相洗脱液可具有线性或阶梯梯度洗脱。线性或阶梯梯度洗脱可为：a.在初始时间时的100％流动相A、0％流动相B；b.在3分钟时的70％流动相A、30％流动相B；c.在3.5分钟时的5％流动相A、95％流动相B；d.在6.5分钟时的5％流动相A、95％流动相B；以及e.在7分钟时的100％流动相A、0％流动相B。
流动相洗脱液可具有介于约0.2mL/min至约1.0mL/min之间的流速。流动相洗脱液的流速可为约0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min、0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min或1.0mL/min。这些值可用于限定范围。在一些实施方案中，流动相洗脱液的流速为约0.40mL/min。
流动相洗脱液具有小于6的pH。在一些实施方案中，流动相洗脱液的pH小于5。在另外的实施方案中，流动相洗脱液的pH小于3。流动相洗脱液的pH可为2.7。流动相洗脱液的pH可为2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。这些值可用于限定范围。
反相或混合模式色谱柱215在柱215内包含固定相。固定相材料具有包含疏水表面基团和可电离改性剂的表面。在一些实施方案中，疏水表面基团包含苯基官能团。苯基官能团可包括未取代和取代的苯基基团。固定相可包括氟苯基官能团或苯基己基官能团。固定相材料可包括无机/有机杂化颗粒或乙烯桥接杂化颗粒。平均粒度可测量为约0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm、5.0μm、5.1μm、5.2μm、5.3μm、5.4μm、5.5μm、5.6μm、5.7μm、5.8μm、5.9μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10.0μm、10.5μm、11.0μm、11.5μm、12.0μm、12.5μm、13.0μm、13.5μm、14.0μm、14.5μm或15μm。这些值可限定范围。在一个实施方案中，粒度为约1.7μm。
官能团为色谱固定相材料赋予一定色谱功能。疏水表面基团例如通过衍生化或涂覆以及随后的交联而连接到基础材料(颗粒)上，从而为基础材料(例如，上述无机/有机杂化颗粒或乙烯桥接杂化颗粒)赋予疏水表面基团或官能团的化学特性。
可使用多种方法将可电离改性剂和疏水表面基团施加到基础颗粒。例如，从未键合的基础颗粒(例如，乙烯桥接杂化颗粒(BEH))开始，可向BEH颗粒表面施加较小的受控电荷。可随后将所得的带电表面杂化(CSH)颗粒键合并且有时用官能团例如氟苯基官能团、苯基己基官能团或C18官能团封端。
无机/有机杂化颗粒具有可另外被表面改性剂取代或衍生化的有机基团和硅烷醇基团两者。“表面改性剂”(通常)包括为色谱固定相赋予一定色谱功能的有机官能团。表面改性剂可为例如C18基团、未取代的和取代的苯基基团、氟苯基或苯基己基官能团。这些官能团的示例如下所示。
Figure GDA0003052120120000131
具有C18官能团的固定相的示例。
Figure GDA0003052120120000132
具有氟苯基官能团的固定相的示例。
Figure GDA0003052120120000133
具有苯基己基官能团的固定相的示例。
表1示出了与C18、氟苯基或苯基己基官能团键合的带电表面杂化(CSH)的特性。
表1：CSH键合相的特性
Figure GDA0003052120120000134
CSH键合相的阴离子交换特性使它们可用于分离极性酸性化合物(例如，磷酸化糖、氨基酸、有机酸和/或核苷酸)，这些极性酸性化合物通常很难保留在反相柱上。在实施例中展示了多种不同类型的分析物的这种情况。
重新参见图2，反相色谱柱215可具有允许有效分离酸性极性化合物(例如，磷酸化糖、氨基酸、有机酸和/或核苷酸)的任何内径。色谱柱215的内径可为例如0.05mm、0.075mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2.0mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm或3mm。这些值可用于限定范围。在一些实施方案中，反相色谱柱215的内径为2.1mm。
类似地，反相色谱柱215可具有允许分离酸性极性化合物(例如，磷酸化糖、氨基酸、有机酸和/或核苷酸)的任何长度。长度可为例如约5mm、10mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm、100mm、105mm、110mm、115mm、120mm、125mm、150mm、200mm、250mm或300mm。这些值可用于限定范围。在一些实施方案中，反相色谱柱215的长度为100mm。
反相色谱系统200可具有定位在柱215的下游的检测器222。检测器222可用于检测酸性极性化合物，例如，从反相或混合模式色谱柱215洗脱的磷酸化糖、氨基酸、有机酸和/或核苷酸。检测器222可为质谱仪。在一些实施方案中，检测器222为串联质谱仪(MS/MS)。检测器可为串联四极杆质谱仪。
数据获取模块225可与检测器222通信。数据获取模块225可用于例如采集/收集并分析从检测器222接收的数据。数据获取模块225可为安装有软件以收集并分析数据的计算机。
重新参见图1，样品和流动相洗脱液(合并的流动流)流过115反相/混合模式色谱柱(例如，图2的柱215)。酸性极性化合物，例如，磷酸化糖、氨基酸、有机酸和/或核苷酸，基本上被溶解并保留在柱上。在一些实施方案中，磷酸化糖、氨基酸、有机酸和/或核苷酸在约7分钟内分离。
保留时间、从样品中其他分析物的分离度以及色谱分离中分析物的选择性可受到多个因素的影响。这些因素可包括强效洗脱液或流动相、样品和流动相的pH以及梯度的分布和持续时间。例如，带正电的吸附剂(例如，CSH吸附剂)将吸引带负电的分子(例如，有机酸、磷酸化糖、氨基酸和核苷酸)。因此，这些带负电的分析物将被吸引并保留在带正电的吸附剂上。可随后操控或改变流动相梯度，从而选择性地释放带负电的分析物，以从柱洗脱。例如，流动相洗脱液的pH随时间推移而减小将导致带负电的分析物从固定相材料释放并将从柱洗脱。
使用一个或多个检测器例如图2的检测器222来检测120磷酸化糖、氨基酸、有机酸和/或核苷酸。检测器可用于检测从反相/混合模式色谱柱洗脱的磷酸化糖、氨基酸、有机酸和/或核苷酸。检测器可为质谱仪。
实施例
实施例1：三羧酸(TCA)循环的示例性代谢物和中间体
在水中制备标准物并用水稀释，以制成100μmol的三羧酸(TCA)循环的代谢物和中间体的溶液，代谢物和中间体例如异柠檬酸、柠檬酸、乌头酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乳酸和丙酮酸有机酸。三羧酸(TCA)循环的这些代谢物和中间体的结构如下所示。
Figure GDA0003052120120000151
将纯溶液形式的样品注入LC/MS系统中，并掺杂到用乙二胺四乙酸二钾(K2EDTA)处理的人血浆中。然后使用
Figure GDA0003052120120000162
I-Class LC系统(可从WatersTechnologies Corporation,Milford,MA USA商购获得)与以ESI负模式和MRM采集模式操作的
Figure GDA0003052120120000163
TQ S串联四极杆质谱仪(可从Waters Technologies Corporation,Milford,MAUSA商购获得)来分离这些分析物。该方法的细节在表2和表3中进行描述。
表2：液相色谱条件
Figure GDA0003052120120000161
表3：梯度表
时间(min) 流速(mL/min) ％A ％B 曲线
初始 0.40 100.0 0.00 初始
3.00 0.40 70 30.0 6
3.50 0.40 5.0 95.0 6
6.50 0.40 5.0 95.0 6
7.00 0.40 100.0 0.0 6
图3A至图3I呈现了各种TCA循环代谢物和中间体的MRM色谱图以及使用CSH C18柱在100μm STD下的混合模式分离的有效性。图3A示出了异柠檬酸的MRM色谱图。图3B示出了柠檬酸的MRM色谱图。图3C示出了乌头酸的MRM色谱图。图3D示出了α酮戊二酸的MRM色谱图。图3E示出了琥珀酸的MRM色谱图。图3F示出了苹果酸的MRM色谱图。图3G示出了富马酸的MRM色谱图。图3H示出了乳酸的MRM色谱图。图3I示出了丙酮酸的MRM色谱图。
图4A至图4I呈现了各种TCA循环代谢物和中间体的MRM色谱图以及使用CSH苯基己基柱在100μm STD下的混合模式分离的有效性。图4A示出了异柠檬酸的MRM色谱图。图4B示出了柠檬酸的MRM色谱图。图4C示出了乌头酸的MRM色谱图。图4D示出了α酮戊二酸的MRM色谱图。图4E示出了琥珀酸的MRM色谱图。图4F示出了苹果酸的MRM色谱图。图4G示出了富马酸的MRM色谱图。图4H示出了乳酸的MRM色谱图。图4I示出了丙酮酸的MRM色谱图。
图5A至图5I呈现了各种TCA循环代谢物和中间体的MRM色谱图以及使用CSH氟苯基柱在100μm STD下的混合模式分离的有效性。图5A示出了异柠檬酸的MRM色谱图。图5B示出了柠檬酸的MRM色谱图。图5C示出了乌头酸的MRM色谱图。图5D示出了α酮戊二酸的MRM色谱图。图5E示出了琥珀酸的MRM色谱图。图5F示出了苹果酸的MRM色谱图。图5G示出了富马酸的MRM色谱图。图5H示出了乳酸的MRM色谱图。图5I示出了丙酮酸的MRM色谱图。
TCA循环中的代谢物是高度极性的，大部分包含两个或三个羧酸基团(参见上面的结构)。这些分子中的大部分酸性基团的pKa值在约2.8至3.8的范围内。它们不能很好地保留在常规反相柱上。经测定，使用包含0.1％甲酸的水溶液和乙腈溶液的流动相时，这些化合物保留在三种CSH材料上。如通过比较图3A至图3I、图4A至图4I和图5A至图5I所示，使用CSH苯基己基柱获得最有希望的结果。虽然CSH氟苯基柱显示出对这些分析物的更大保留，但在这些条件下，若干柱显示出较差的峰形。
图6A至图6C示出了使用BEH C18柱(图6A)、CSH C18柱(图6B)和CSH苯基己基柱(图6C)分离TCA循环代谢物的色谱图。这些柱均为1.7μm 2.1mm×100mm柱。在这些图中的每个图中，1为异柠檬酸，2为苹果酸，3为α-酮戊二酸，4为乳酸，5为柠檬酸，6为富马酸，7为乌头酸，并且8为琥珀酸。
当流动相的pH小于5时，CSH柱具有显著的阴离子保留，并且保留随着pH减小而增加。阴离子的相对保留按以下顺序增加：CSH C18<CSH苯基己基<CSH氟苯基。保留阴离子的能力使得CSH柱可用于分离极性酸，诸如TCA循环代谢物。
实施例2：氨基酸
在水中制备标准物并用水稀释，以制成100μmol的谷氨酰胺和谷氨酸盐以及10μg/mL的亮氨酸和异亮氨酸的溶液。然后使用
Figure GDA0003052120120000192
I-Class LC系统(可从WatersTechnologies Corporation,Milford,MA USA商购获得)与以ESI负模式和MRM采集模式操作的
Figure GDA0003052120120000193
TQ S串联四极杆质谱仪(可从Waters Technologies Corporation,Milford,MAUSA商购获得)来分离这些分析物。该方法的细节在表4和表5中进行描述。
表4：液相色谱条件
Figure GDA0003052120120000191
表5：梯度表
时间(min) 流速(mL/min) ％A ％B 曲线
初始 0.40 100.0 0.00 初始
3.00 0.40 70 30.0 6
3.50 0.40 5.0 95.0 6
6.50 0.40 5.0 95.0 6
7.00 0.40 100.0 0.0 6
图7A至图7D示出了在反相柱中使用CSH C18 STD吸附剂对氨基酸的分析。图7A示出了谷氨酸的MRM色谱图。图7B示出了谷氨酰胺的MRM色谱图。图7C示出了异亮氨酸的MRM色谱图。图7D示出了亮氨酸的MRM色谱图。
图8A至图8D示出了在反相柱中使用CSH苯基己基STD吸附剂对氨基酸的分析。图8A示出了谷氨酸的MRM色谱图。图8B示出了谷氨酰胺的MRM色谱图。图8C示出了异亮氨酸的MRM色谱图。图8D示出了亮氨酸的MRM色谱图。
图9A至图9D示出了在反相柱中使用CSH氟苯基STD吸附剂对氨基酸的分析。图9A示出了谷氨酸的MRM色谱图。图9B示出了谷氨酰胺的MRM色谱图。图9C示出了异亮氨酸的MRM色谱图。图9D示出了亮氨酸的MRM色谱图。
从图7至图9的比较可以看出，与CSH C18柱相比，CSH苯基己基柱显示出谷氨酸盐和谷氨酰胺的分离和保留增加。此外，与CSH CSH C18柱和CSH苯基己基柱两者相比，CSH氟苯基柱显示出谷氨酸盐和谷氨酰胺的分离和保留增加。
相比之下，对于异亮氨酸和亮氨酸可观察到相反的结果，其中与CSH C18柱相比，CSH苯基己基柱显示出谷氨酸盐和谷氨酰胺的分离和保留减少。此外，与CSH CSH C18柱和CSH苯基己基柱两者相比，CSH氟苯基柱显示出谷氨酸盐和谷氨酰胺的分离和保留减少。
实施例3：生物标志物
在水中制备标准物并用水稀释，以制成100μmol的甲基丙二酸、乌头酸和琥珀酸的溶液。制备10μg/mL的衣康酸溶液。然后使用
Figure GDA0003052120120000201
Figure GDA0003052120120000202
I-Class LC系统(可从Waters Technologies Corporation,Milford,MA USA商购获得)与以ESI负模式和MRM采集模式操作的
Figure GDA0003052120120000203
TQ S串联四极杆质谱仪(可从Waters Technologies Corporation,Milford,MA USA商购获得)来分离这些分析物。该方法的细节在表6和表7中进行描述。
表6：液相色谱条件
Figure GDA0003052120120000211
表7：梯度表
时间(min) 流速(mL/min) ％A ％B 曲线
初始 0.40 100.0 0.00 初始
3.00 0.40 70 30.0 6
3.50 0.40 5.0 95.0 6
6.50 0.40 5.0 95.0 6
7.00 0.40 100.0 0.0 6
图10A至图10D示出了在反相柱中使用CSH C18吸附剂对生物标志物的分析。图10A示出了甲基丙二酸的MRM色谱图。图10B示出了琥珀酸的MRM色谱图。图10C示出了乌头酸的MRM色谱图。图10D示出了衣康酸的MRM色谱图。
图11A至图11D示出了在反相柱中使用CSH苯基己基吸附剂对生物标志物的分析。图11A示出了甲基丙二酸的MRM色谱图。图11B示出了琥珀酸的MRM色谱图。图11C示出了乌头酸的MRM色谱图。图11D示出了衣康酸的MRM色谱图。
图12A至图12D示出了在反相柱中使用CSH氟苯基吸附剂对生物标志物的分析。图12A示出了甲基丙二酸的MRM色谱图。图12B示出了琥珀酸的MRM色谱图。图12C示出了乌头酸的MRM色谱图。图12D示出了衣康酸的MRM色谱图。
实施例4：磷酸化糖
在水中制备6-磷酸葡萄糖标准物并用水稀释以制成100μmol的溶液。然后使用
Figure GDA0003052120120000231
I-Class LC系统(可从Waters Technologies Corporation,Milford,MA USA商购获得)与以ESI负模式和MRM采集模式操作的
Figure GDA0003052120120000232
TQ S串联四极杆质谱仪(可从Waters Technologies Corporation,Milford,MA USA商购获得)来分离该分析物，其结构如下所示。该方法的细节在表8和表9中进行描述。
表8：液相色谱条件
Figure GDA0003052120120000233
表9：梯度表
时间(min) 流速(mL/min) ％A ％B 曲线
初始 0.40 100.0 0.00 初始
3.00 0.40 70 30.0 6
3.50 0.40 5.0 95.0 6
6.50 0.40 5.0 95.0 6
7.00 0.40 100.0 0.0 6
Figure GDA0003052120120000234
图13A示出了在反相柱中使用CSH C18吸附剂对6-磷酸葡萄糖的分析。图13B示出了在反相柱中使用CSH苯基己基吸附剂对6-磷酸葡萄糖的分析。图13C示出了在反相柱中使用CSH氟苯基吸附剂对6-磷酸葡萄糖的分析。从这三种固定相材料的比较可以看出，CSH氟苯基吸附剂与CSH苯基己基固定相材料相比显示出分离和保留增加，CSH苯基己基固定相材料与CSH C18固定相材料相比显示出分离和保留增加。
从所有这些实施例中，显示出CSH柱的阴离子交换特性使其可用于分离极性酸性分析物，这些极性酸性分析物通常较差地保留在反相柱上。
本领域技术人员将认识到或者仅使用常规实验便能确定本文所述具体程序的许多等同形式。此类等同形式被认为是在本技术的范围内并由以下权利要求书所涵盖。本申请通篇引用的所有参考文献、发布专利和公布的专利申请的内容据此以引用方式并入。

Claims (28)

1.一种用于测定样品中的磷酸化糖的混合模式色谱方法，所述混合模式色谱方法包括：
获得包含至少一种磷酸化糖的样品；
将所述样品引入色谱系统中，所述色谱系统包括柱，所述柱具有包含在所述柱内的固定相材料，所述固定相材料具有包含疏水表面基团和至少一种可电离改性剂的表面，其中所述疏水表面基团包括选自C4-C30嵌入式极性、手性苯基烷基、氟苯基或苯基己基的官能团；
使所述样品与流动相洗脱液一起流过所述柱，以在七分钟内溶解并保留至少一种磷酸化糖，所述流动相洗脱液包含具有添加剂的水和具有所述添加剂的乙腈，所述流动相洗脱液具有小于6的pH；以及
使用检测器来检测所述至少一种磷酸化糖。
2.根据权利要求1所述的混合模式色谱方法，其中所述流动相洗脱液的pH小于3。
3.根据权利要求2所述的混合模式色谱方法，其中所述流动相洗脱液的pH介于2.5和3之间。
4.根据权利要求3所述的混合模式色谱方法，其中所述流动相洗脱液的pH为2.7。
5.根据权利要求1所述的混合模式色谱方法，其中所述添加剂为0.1% (v/v)甲酸。
6.根据权利要求1所述的混合模式色谱方法，其中所述添加剂为质谱相容的缓冲液。
7.根据权利要求1所述的混合模式色谱方法，其中所述流动相洗脱液包含由0.1% (v/v)甲酸的水溶液组成的流动相A和由0.1% (v/v)甲酸的乙腈溶液组成的流动相B。
8.根据权利要求7所述的混合模式色谱方法，其中所述流动相洗脱液具有线性或阶梯梯度洗脱，所述线性或阶梯梯度洗脱包括：
a. 在初始时间时的100%流动相A、0%流动相B；
b. 在3分钟时的70%流动相A、30%流动相B；
c. 在3.5分钟时的5%流动相A、95%流动相B；
d. 在6.5分钟时的5%流动相A、95%流动相B；
e. 在7分钟时的100%流动相A、0%流动相B。
9.根据权利要求1所述的混合模式色谱方法，其中所述样品与所述流动相洗脱液一起以0.2mL/min至1.0mL/min的速率流过所述柱。
10.根据权利要求9所述的混合模式色谱方法，其中所述样品与所述流动相洗脱液一起以0.4mL/min的速率流过所述柱。
11.根据权利要求1所述的混合模式色谱方法，其中所述检测器为质谱仪。
12.一种用于测定样品中的氨基酸的混合模式色谱方法，所述混合模式色谱方法包括：
获得包含至少一种氨基酸的样品；
将所述样品引入色谱系统中，所述色谱系统包括柱，所述柱具有包含在所述柱内的固定相材料，所述固定相材料具有包含疏水表面基团和至少一种可电离改性剂的表面；
使所述样品与流动相洗脱液一起流过所述柱，以在七分钟内溶解并保留至少一种磷酸化糖，所述流动相洗脱液包含具有添加剂的水和具有所述添加剂的乙腈，所述流动相洗脱液具有小于6的pH；以及
使用检测器来检测所述至少一种氨基酸。
13.根据权利要求12所述的混合模式色谱方法，其中所述流动相洗脱液的pH小于3。
14.根据权利要求13所述的混合模式色谱方法，其中所述流动相洗脱液的pH介于2.5和3之间。
15.根据权利要求14所述的混合模式色谱方法，其中所述流动相洗脱液的pH为2.7。
16.根据权利要求12所述的混合模式色谱方法，其中所述添加剂为0.1% (v/v)甲酸。
17.根据权利要求12所述的混合模式色谱方法，其中所述添加剂为质谱相容的缓冲液。
18.根据权利要求12所述的混合模式色谱方法，其中所述流动相洗脱液包含由0.1%(v/v)甲酸的水溶液组成的流动相A和由0.1% (v/v)甲酸的乙腈溶液组成的流动相B。
19.根据权利要求18所述的混合模式色谱方法，其中所述流动相洗脱液具有线性或阶梯梯度洗脱，所述线性或阶梯梯度洗脱包括：
a. 在初始时间时的100%流动相A、0%流动相B；
b. 在3分钟时的70%流动相A、30%流动相B；
c. 在3.5分钟时的5%流动相A、95%流动相B；
d. 在6.5分钟时的5%流动相A、95%流动相B；
e. 在7分钟时的100%流动相A、0%流动相B。
20.根据权利要求12所述的混合模式色谱方法，其中所述样品与所述流动相洗脱液一起以0.2mL/min至1.0mL/min的速率流过所述柱。
21.根据权利要求20所述的混合模式色谱方法，其中所述样品与所述流动相洗脱液一起以0.4mL/min的速率流过所述柱。
22.根据权利要求12所述的混合模式色谱方法，其中所述疏水表面基团包括氟苯基官能团。
23.根据权利要求12所述的混合模式色谱方法，其中所述疏水表面基团包括苯基己基官能团。
24.根据权利要求12所述的混合模式色谱方法，其中所述疏水表面基团包括C18官能团。
25.根据权利要求12所述的混合模式色谱方法，其中所述检测器为质谱仪。
26.根据权利要求12所述的混合模式色谱方法，其中所述至少一种氨基酸为谷氨酸盐、谷氨酰胺、异亮氨酸或亮氨酸。
27.一种用于测定样品中的有机酸的混合模式色谱方法，所述混合模式色谱方法包括：
获得包含至少一种有机酸的样品；
将所述样品引入色谱系统中，所述色谱系统包括柱，所述柱具有包含在所述柱内的固定相材料，所述固定相材料具有包含疏水表面基团和可电离改性剂的表面，所述疏水表面基团具有氟苯基官能团；
使所述样品与流动相洗脱液一起流过所述柱，以在七分钟内溶解并保留至少一种磷酸化糖，所述流动相洗脱液包含由0.1% (v/v)甲酸的水溶液组成的流动相A和由0.1% (v/v)甲酸的乙腈溶液组成的流动相B，所述流动相洗脱液具有小于6的pH；以及
使用检测器来检测所述至少一种有机酸。
28.根据权利要求27所述的混合模式色谱方法，其中所述至少一种有机酸为异柠檬酸、乌头酸、α-酮戊二酸、乳酸或丙酮酸。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114280179B (zh) * 2021-12-22 2024-03-15 北京美福润医药科技股份有限公司 艾塞那肽的前处理及其得到的His氨基酸洗脱液中异构体的检测方法
CN115575526A (zh) * 2022-09-26 2023-01-06 大连工业大学 一种同时检测食物中22种有机酸的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101680904A (zh) * 2007-02-23 2010-03-24 默克专利股份公司 使用具有两性离子固定相的hilic与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测
CN102313785A (zh) * 2011-08-04 2012-01-11 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 一种柠檬酸发酵清液的分析方法
CN103543236A (zh) * 2013-10-12 2014-01-29 福建省农业科学院农业工程技术研究所 离子排斥色谱法测定发酵酒中有机酸含量的方法
CN105510474A (zh) * 2015-12-28 2016-04-20 福建省农业科学院农业工程技术研究所 一种同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法
CN105699580A (zh) * 2016-04-28 2016-06-22 河南大学 基于柱前衍生的lc-ms测定有机酸含量的方法
CN106198816A (zh) * 2015-05-07 2016-12-07 华中科技大学 一种混合氨基酸含量测定方法
CN106442758A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 陈大为 非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2357184A1 (de) 1973-11-16 1975-05-22 Merck Patent Gmbh Verfahren zur herstellung von organisch modifizierten siliciumdioxiden
US6686035B2 (en) 1999-02-05 2004-02-03 Waters Investments Limited Porous inorganic/organic hybrid particles for chromatographic separations and process for their preparation
US6528167B2 (en) 2001-01-31 2003-03-04 Waters Investments Limited Porous hybrid particles with organic groups removed from the surface
CA2419492C (en) * 2001-03-22 2005-07-05 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Methods and apparatus for gel-free qualitative and quantitative proteome analysis, and uses therefore
WO2006133568A1 (en) * 2005-06-16 2006-12-21 Caprion Pharmaceuticals Inc. Virtual mass spectrometry
US20080220532A1 (en) * 2007-03-08 2008-09-11 Polylc Inc. Separation of Charged Solutes by Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography
US10159911B2 (en) 2009-08-04 2018-12-25 Waters Technologies Corporation High purity chromatographic materials comprising an ionizable modifier
WO2013028330A2 (en) * 2011-08-19 2013-02-28 Emd Millipore Corporation Methods of reducing level of one of more impurities in a sample during protein purification
US9310344B2 (en) * 2013-06-14 2016-04-12 Dionex Corporation HILIC/anion-exchange/cation-exchange multimodal media
WO2016026286A1 (zh) 2014-08-19 2016-02-25 行政院农业委员会农业药物毒物试验所 用于农产品农药残留检测程序的快速萃取套件及从农产样品取得检液原液的方法
DK3303583T3 (da) * 2015-05-29 2020-07-13 Curevac Real Estate Gmbh Fremgangsmåde til fremstilling og oprensning af rna, omfattende mindst et trin til tangential-flow-filtrering
EP3359640A4 (en) * 2015-10-09 2019-03-20 Dice Molecules SV, LLC LOGD ESTIMATING METHODS OF MARKED COMBINATORIAL LIBRARY COMPOUNDS
KR20180093078A (ko) * 2015-12-30 2018-08-20 제넨테크, 인크. 단백질 제제를 위한 트립토판 유도체의 용도
AU2017312951B2 (en) * 2016-08-15 2024-02-08 Genzyme Corporation Methods for detecting AAV
WO2018163086A1 (en) 2017-03-08 2018-09-13 Waters Technologies Corporation Polar pesticide determination using chromatography
CN111405934B (zh) * 2017-09-26 2022-04-26 沃特世科技公司 用于离析、分离、纯化或检测酸性极性分子的方法
US11506581B2 (en) * 2018-03-20 2022-11-22 Agilent Technologies, Inc. Mass spectrometry compatible salt formation for ionic liquid sample preparation

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101680904A (zh) * 2007-02-23 2010-03-24 默克专利股份公司 使用具有两性离子固定相的hilic与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测
CN102313785A (zh) * 2011-08-04 2012-01-11 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 一种柠檬酸发酵清液的分析方法
CN103543236A (zh) * 2013-10-12 2014-01-29 福建省农业科学院农业工程技术研究所 离子排斥色谱法测定发酵酒中有机酸含量的方法
CN106198816A (zh) * 2015-05-07 2016-12-07 华中科技大学 一种混合氨基酸含量测定方法
CN105510474A (zh) * 2015-12-28 2016-04-20 福建省农业科学院农业工程技术研究所 一种同时测定果实或果酒中的有机酸和可溶性糖的方法
CN105699580A (zh) * 2016-04-28 2016-06-22 河南大学 基于柱前衍生的lc-ms测定有机酸含量的方法
CN106442758A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 陈大为 非衍生化检测人体血浆中多种氨基酸的液相质谱方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Evaluation of new mixed-mode UHPLC stationary phases and the importance of stationary phase choice when using low ionic-strength mobile phase additives";Nováková Lucie等;《Talanta》;20120501;第93卷(第2012年期);99-105 *
"Ion Chromatographic Separation of Inorganic Anions and Carboxylic Acids on a Mixed-Mode Stationary Phase";Raaidah 等;《Analytical Chemistry》;19921001;第64卷(第19期);2283-2287 *
"Metabolite profiling of Calvin cycle intermediates by HPLC-MS using mixed-mode stationary phases";Jeffrey A. Cruz等;《the plant journal》;20080714;第55卷(第6期);1047-1060 *
"Mixed-mode chromatography for fractionation of peptides,phosphopeptides, and sialylated glycopeptides";Martin Gilar等;《Journal of Chromatography A》;20080131;第1191卷(第1-2期);162-170 *

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