CN114280179B - 艾塞那肽的前处理及其得到的His氨基酸洗脱液中异构体的检测方法 - Google Patents
艾塞那肽的前处理及其得到的His氨基酸洗脱液中异构体的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分析化学技术领域，提供了艾塞那肽的前处理及其得到的His氨基酸洗脱液中异构体的检测方法。本发明将待测艾塞那肽进行水解和氨基酸分离，收集His氨基酸洗脱液；利用高效液相色谱对所述His氨基酸洗脱液进行手性分析；所述高效液相色谱的条件包括：色谱柱：CROWNPAKCR(+)150*4.0mm 5μm；流动相：pH值为1.0的高氯酸水溶液。本发明先将艾塞那肽进行水解，得到氨基酸混合物，再利用高效液相色谱分离将氨基酸混合物中的His氨基酸进行分离，得到His氨基酸洗脱液，前处理方法操作简单；再通过控制色谱柱类型和流动相组成，实现了His氨基酸中不同异构体的分离和测定，且数据重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及艾塞那肽的前处理及其得到的His氨基酸洗脱液中异构体的检测方法。
背景技术
艾塞那肽(Exenatide)是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，用于改善II型糖尿病患者的血糖控制，适用于单用二甲双胍、磺酰脲类以及二甲双胍合用磺酰脲类，血糖仍控制不佳的患者。艾塞那肽能够有效保护胰岛β细胞功能，持久有效地控制血糖，合理减轻患者体重，改善心血管危险因素、提高胰岛素敏感性。艾塞那肽在治疗II型糖尿病(T2DM)中有较大的优势。
艾塞那肽的合成过程暴露在偏碱性环境下，部分拼接的氨基酸会在该条件下由L构型转化为D构型，故需对艾塞那肽的异构体进行定量检验。艾塞那肽的异构体包括L-His1艾塞那肽和D-His1艾塞那肽。美国药典收载了艾塞那肽的异构体D-His1艾塞那肽检测的方法，包括以下步骤：先水解，再进行衍生化；再采用GC-MS进行分离定量检测。但是，前处理的衍生化，操作繁琐不易掌握。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供艾塞那肽的前处理及其得到的His氨基酸洗脱液中异构体的检测方法。本发明提供的前处理方法操作简单。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种艾塞那肽的前处理方法，包括以下步骤：
将待测艾塞那肽进行水解，得到水解体系；
将所述水解体系进行氨基酸分离，得到His氨基酸洗脱液；
所述氨基酸分离为高效液相色谱分离；
所述高效液相色谱分离的参数包括：
色谱柱：Comixshell CARP 2.7μ150*4.6mm；
流动相体系包括流动相A和流动相B；
所述流动相A：10mL乙腈+0.1mL 85wt％磷酸+490mL水；
所述流动相B：50mL乙腈+0.4mL 85wt％磷酸+150mL水；
梯度洗脱为：
0min：流动相A的体积分数为100％；
0～20min：流动相A的体积分数由100％匀速变为0％；
20～20.1min：流动相A的体积分数由0％匀速变为100％；
20.1～35％：流动相A的体积分数维持100％。
优选地，所述流动相体系的流速为0.8～1.2mL/min。
优选地，所述色谱柱的温度为20～35℃。
优选地，所述高效液相色谱分离的参数还包括：检测波长为200nm。
优选地，所述水解的试剂包括盐酸或氘代盐酸。
优选地，所述水解的体系中，水解的试剂的浓度为6mol/L，待测艾塞那肽的浓度为3mg/mL。
优选地，所述水解的温度为105～120℃，时间为4～12h。
本发明还提供了上述技术方案所述的前处理方法得到的His氨基酸洗脱液中异构体的检测方法，包括以下步骤：
对所述His氨基酸洗脱液进行高效液相色谱手性分析；
所述高效液相色谱手性分析的参数包括：
色谱柱：CROWNPAK CR(+)150*4.0mm 5μm；
流动相：pH值为1.0的高氯酸水溶液。
优选地，所述高效液相色谱手性分析的参数还包括：所述流动相的流速为0.2～0.3mL/min；所述色谱柱的温度为2～10℃；检测波长为195～205nm；进样量为10μL。
优选地，对所述His氨基酸洗脱液进行高效液相色谱手性分析前，还包括：去除所述His氨基酸洗脱液中的溶剂后复溶。
本发明提供了一种艾塞那肽的前处理方法，包括以下步骤：将待测艾塞那肽进行水解，得到水解体系；将所述水解体系进行氨基酸分离，得到His氨基酸洗脱液；所述氨基酸分离为高效液相色谱分离；所述高效液相色谱分离的参数包括：色谱柱：Comixshell CARP2.7μ150*4.6mm；流动相体系包括流动相A和流动相B；所述流动相A：10mL乙腈+0.1mL85wt％磷酸+490mL水；所述流动相B：50mL乙腈+0.4mL 85wt％磷酸+150mL水；梯度洗脱为：0min：流动相A的体积分数为100％；0～20min：流动相A的体积分数由100％匀速变为0％；20～20.1min：流动相A的体积分数由0％匀速变为100％；20.1～35％：流动相A的体积分数维持100％。本发明将艾塞那肽进行水解，得到氨基酸混合物；再利用高效液相色谱分离将His氨基酸从氨基酸混合物中分离出来，以进行后续异构体氨基酸的检测。
本发明还提供了上述技术方案所述的前处理方法得到的His氨基酸洗脱液中异构体的检测方法，包括以下步骤：对所述His氨基酸洗脱液进行高效液相色谱手性分析；所述高效液相色谱手性分析的参数包括：色谱柱：CROWNPAK CR(+)150*4.0mm 5μm；流动相：pH值为1.0的高氯酸水溶液。本发明提供的检测方法为高效液相色谱检测，通过控制色谱柱类型和流动相组成，实现了His氨基酸中不同异构体的分离和测定，且数据重现性好。而且，高效液相色谱法所用设备成本低，对操作人员的要求不高。
附图说明
图1为D-His的标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种艾塞那肽的前处理方法，包括以下步骤：
将待测艾塞那肽进行水解，得到水解体系；
将所述水解体系进行氨基酸分离，得到His氨基酸洗脱液；
所述氨基酸分离为高效液相色谱分离；
所述高效液相色谱分离的参数包括：
色谱柱：Comixshell CARP 2.7μ150*4.6mm；
流动相体系包括流动相A和流动相B；
所述流动相A：10mL乙腈+0.1mL 85wt％磷酸+490mL水；
所述流动相B：50mL乙腈+0.4mL 85wt％磷酸+150mL水；
梯度洗脱为：
0min：流动相A的体积分数为100％；
0～20min：流动相A的体积分数由100％匀速变为0％；
20～20.1min：流动相A的体积分数由0％匀速变为100％；
20.1～35％：流动相A的体积分数维持100％。
在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。
本发明将待测艾塞那肽进行水解，得到水解体系。
在本发明中，所述水解的试剂优选包括盐酸或氘代盐酸，进一步优选为氘代盐酸。
在本发明中，所述水解的体系中，水解的试剂的浓度优选为6mol/L，待测艾塞那肽的浓度优选为3mg/mL。
在本发明中，所述水解的温度优选为105～120℃，时间优选为4～12h。
在本发明中，所述水解优选在密闭、氮气氛围下进行。
所述水解后，本发明优选还包括将得到的水解料液冷却至室温后，依次进行浓缩、再溶解和过滤，得到水解体系。
在本发明中，所述浓缩的方式优选为氮吹。在本发明中，所述再溶解的试剂优选包括水，所述水优选包括去离子水。在本发明中，所述过滤的滤膜优选为微孔滤膜。
得到水解体系后，本发明将所述水解体系进行氨基酸分离。
在本发明中，所述氨基酸分离为高效液相色谱分离；
所述高效液相色谱分离的参数包括：
色谱柱：Comixshell CARP 2.7μ150*4.6mm；
流动相体系包括流动相A和流动相B；
所述流动相A：10mL乙腈+0.1mL 85wt％磷酸+490mL水；
所述流动相B：50mL乙腈+0.4mL 85wt％磷酸+150mL水；
梯度洗脱为：
0min：流动相A的体积分数为100％；
0～20min：流动相A的体积分数由100％匀速变为0％；
20～20.1min：流动相A的体积分数由0％匀速变为100％；
20.1～35％：流动相A的体积分数维持100％。
在本发明中，所述流动相体系的流速优选为0.8～1.2mL/min，进一步优选为1.0mL/min。
在本发明中，所述色谱柱的温度优选为20～35℃。
在本发明中，所述高效液相色谱分离的参数还包括：检测波长优选为200nm。
本发明提供的高效液相色谱分离的方法，能够将水解体系中的His氨基酸完全分开，收集得到的His氨基酸可以用于后续的检测。
本发明还提供了上述技术方案所述的前处理方法得到的His氨基酸洗脱液中异构体的检测方法，包括以下步骤：
对所述His氨基酸洗脱液进行高效液相色谱手性分析；
所述高效液相色谱手性分析的参数包括：
色谱柱：CROWNPAK CR(+)150*4.0mm 5μm；
流动相：pH值为1.0的高氯酸水溶液。
在本发明中，所述对His氨基酸洗脱液进行高效液相色谱手性分析前，优选还包括：去除所述His氨基酸洗脱液中的溶剂后复溶。在本发明中，所述去除His氨基酸洗脱液中的溶剂的方式优选为氮吹；所述氮吹的温度优选为室温。在本发明中，所述复溶的试剂优选与高效液相色谱进行手性分析的流动相一致。
在本发明中，所述高效液相色谱手性分析的参数包括：色谱柱：CROWNPAK CR(+)150*4.0mm 5μm；流动相：pH值为1.0的高氯酸水溶液。
在本发明中，所述高效液相色谱手性分析的参数还包括：所述流动相的流速优选为0.2～0.3mL/min；所述色谱柱的温度优选为2～10℃，进一步优选为3～7℃；检测波长优选为195～205nm；进样量优选为10μL。
本发明利用高效液相色谱分析His氨基酸洗脱液中His不同异构体的含量，数据重复性好，且所用设备成本低，对操作人员要求低。
下面结合实施例对本发明提供的艾塞那肽的前处理及其得到的His氨基酸洗脱液中异构体的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例使用的仪器与试剂如下：
仪器：高效液相色谱仪：LC-10Atvp(岛津)、S6000(华谱)
色谱柱：Comixshell CARP 2.7μ150*4.6mm、CROWNPAK CR(+)150*4.0mm 5μm
试剂：氘代盐酸、重水、磷酸、乙腈、高氯酸
试药：L-His、D-His、艾塞那肽
实施例1
专属性实验
溶剂：pH为1.0的高氯酸水溶液；
混合溶液配制：取L-His、D-His适量，加溶剂稀释成每1mL含L-His、D-His各1μg的溶液。
高效液相色谱手性分析的条件如下：
色谱柱：CROWNPAK CR(+)150*4.0mm 5μm；
液相色谱条件：以水(用高氯酸调节pH至1.0)为流动相，柱温为3℃，流速为0.2mL/min，检测波长为200nm；
在上述高效液相色谱手性分析的条件下分别对溶剂、混合溶液进行检测，结果如表1所示。
表1溶剂和混合溶液的高效液相色谱分析结果
从表1可以看出，L-His与D-His分离良好，空白溶剂不干扰D-His、L-His的检测。
实施例2
进样精密度实验
溶剂：pH为1.0的高氯酸水溶液
D-His对照溶液配制：取D-His适量，加溶剂稀释成每1mL含D-His 1μg的溶液。
按照实施例1的高效液相色谱手性分析的条件，重复进样检测D-His溶液6次，结果如表2所示。
表2进样精密度实验结果
从表2可以看出，D-His对照溶液重复进样6次，D-His保留时间的RSD不大于1％，峰面积RSD值不大于2％；说明本发明提供的方法的进样精密度良好。
实施例3
标准曲线
线性溶液-1：取D-His适量，加溶剂稀释成每1mL含D-His 0.2μg的溶液。
线性溶液-2：取D-His适量，加溶剂稀释成每1mL含D-His 0.5μg的溶液。
线性溶液-3：取D-His适量，加溶剂稀释成每1mL含D-His 1μg的溶液。
线性溶液-4：取D-His适量，加溶剂稀释成每1mL含D-His 2μg的溶液。
线性溶液-5：取D-His适量，加溶剂稀释成每1mL含D-His 5μg的溶液。
按照实施例1的高效液相色谱手性分析的条件，将上述线性溶液进样分析，所得峰面积如表3所示。
表3线性溶液的峰面积信息
基于表3中的线性溶液的浓度和峰面积建立D-His的标准曲线，结果如图1所示。从图1可以看出：D-His在0.202μg/mL～5.057μg/mL浓度范围内，与峰面积的线性关系良好，线性方程y＝1.39425x-0.02844，r＝0.99998。
实施例4
回收率实验
溶剂：pH为1.0的高氯酸水溶液。
D-His对照溶液配制：取D-His适量，加溶剂稀释成每1mL含D-His 1μg的溶液。
供试溶液配制：取L-His适量，加溶剂稀释成每1mL含L-His 100μg的溶液。
80％加标供试：取L-His、D-His适量，加溶剂稀释成每1mL含L-His 100μg、D-His0.8μg的溶液。该溶液重复配制3份
100％加标供试：取L-His、D-His适量，加溶剂稀释成每1mL含L-His100μg、D-His 1μg的溶液。该溶液重复配制3份
120％加标供试：取L-His、D-His适量，加溶剂稀释成每1mL含L-His100μg、D-His1.2μg的溶液。该溶液重复配制3份
按照实施例1的高效液相色谱手性分析的条件，将溶剂、D-His对照溶液、供试溶液、80％加标供试、100％加标供试、120％加标供试进样分析，结果如表4所示。
表4回收率实验结果
从表4可以看出：9份加标样品中D-His的回收率在92％～105％之间，RSD值小于2.0％。方法的回收率良好。
实施例5
样品检验
6M氘代盐酸：将氘代盐酸与重水混合，配成6M氘代盐酸。
His定位溶液：取L-His适量，加水溶解稀释制成每1mL含100μg的溶液。
样品的前处理：取艾塞那肽适量，6M氘代盐酸溶解稀释制成浓度为3mg/mL的溶液，取溶液适量转移至安瓿瓶中，充入氮气，熔封，在120℃放置8h使其水解，取出放冷后，取出0.5mL水解后的溶液至试管中，氮气吹干，吹干后，向试管中加入0.5mL水，震荡试管，使水解物充分的溶解在水中，微孔滤膜过滤后，将滤液进行氨基酸分离，所述氨基酸分离为高效液相色谱分离；所述高效液相色谱分离的参数包括：
色谱柱：Comixshell CARP 2.7μ150*4.6mm；
流动相体系包括流动相A和流动相B；
流动相A：10mL乙腈+0.1mL 85wt％磷酸+490mL水；
流动相B：50mL乙腈+0.4mL 85wt％磷酸+150mL水；
流动相体系的流速：1.0mL/min；
色谱柱的温度：25℃；
检测波长：200nm；
梯度洗脱程序如表5所示：
表5梯度洗脱程序
进样量：100μL。
在上述高效液相色谱分离的条件下进样His定位溶液与样品前处理得到的滤液，通过His定位溶液确定His出峰位置，并在滤液进样时收集His出峰时从检测器流出的洗脱液至试管中，氮气吹干。
供试溶液：向吹干洗脱液的试管中，加入0.1mL的溶剂(pH为1.0的高氯酸水溶液)溶解即得。
按照实施例1的高效液相色谱手性分析的条件，对溶剂、供试溶液进行分析。对图谱中的D-His与L-His进行积分，按面积归一化法计算D-His的含量。共检验了三批艾塞那肽样品，结果如表6所示：
表6样品检测结果
| 样品批号 | D-His含量 |
| Y200501 | 0.69％ |
| Y200502 | 0.68％ |
| Y200503 | 0.70％ |
综上所述，本发明提供的方法，专属性、线性、回收率良好，能够准确检验艾塞那肽中D-His的含量，从而推导出艾塞那肽中D-His1艾塞那肽的含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种艾塞那肽中异构体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测艾塞那肽进行水解，得到水解体系；
将所述水解体系进行氨基酸分离，得到His氨基酸洗脱液；
所述氨基酸分离为高效液相色谱分离；
所述高效液相色谱分离的参数包括：
色谱柱：Comixshell CARP 2.7μ150*4.6mm；
流动相体系包括流动相A和流动相B；
所述流动相A：10mL乙腈+0.1mL 85wt%磷酸+490mL水；
所述流动相B：50mL乙腈+0.4mL 85wt%磷酸+150mL水；
梯度洗脱为：
0min：流动相A的体积分数为100%；
0~20min：流动相A的体积分数由100%匀速变为0%；
20~20.1min：流动相A的体积分数由0%匀速变为100%；
20.1~35%：流动相A的体积分数维持100%；
对所述His氨基酸洗脱液进行高效液相色谱手性分析；
所述高效液相色谱手性分析的参数包括：
色谱柱：CROWNPAK CR(+)150*4.0mm 5μm；
流动相：pH值为1.0的高氯酸水溶液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，利用高效液相色谱分离进行氨基酸分离时，所述流动相体系的流速为0.8~1.2mL/min。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，利用高效液相色谱分离进行氨基酸分离时，所述色谱柱的温度为20~35℃。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，利用高效液相色谱分离进行氨基酸分离时，所述高效液相色谱分离的参数还包括：检测波长为200nm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水解的试剂包括盐酸或氘代盐酸。
6.根据权利要求1或5所述的检测方法，其特征在于，所述水解的体系中，水解的试剂的浓度为6mol/L，待测艾塞那肽的浓度为3mg/mL。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水解的温度为105~120℃，时间为4~12h。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱手性分析的参数还包括：所述流动相的流速为0.2~0.3mL/min；所述色谱柱的温度为2~10℃；检测波长为195~205nm；进样量为10μL。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，对所述His氨基酸洗脱液进行高效液相色谱手性分析前，还包括：去除所述His氨基酸洗脱液中的溶剂后复溶。
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