TWI477776B - 胜肽之胺基酸序列的測定方法與系統 - Google Patents

胜肽之胺基酸序列的測定方法與系統 Download PDF

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Description

胜肽之胺基酸序列的測定方法與系統
本發明係關於一種蛋白質的胜肽鍊之胺基酸序列測定系統與方法。
蛋白質是一種巨大且複雜的有機化合物，是由胺基酸分子彼此以其酸基及胺基脫水形成醯胺鍵結形成，其胺基酸結合的次序被稱為蛋白質的一級結構。而胜肽是胺基酸結合所形成的物質，由兩個胺基酸分子組成的蛋白質稱為二胜肽，三個胺基酸分子組成的蛋白質稱為三胜肽，依此類推逐漸形成長胜肽鍊的多胜肽蛋白質。
因胺基酸的序列可決定蛋白質的性質與功能，故測定胺基酸序列成為一項非常重要的工作[1]。在1955年，英國生物化學家Sanger成功地將胰島素的胺基酸序列完整地定序，證明蛋白質具有明確的結構[2]。1958年起，陸續有許多蛋白質的真實結構，分別被科學家Perutz與Kendrew，利用X射線晶體繞射分析法解析出來[3-4]
胺基酸是組成蛋白質的基本單位，其生產方式大多為人工合成，或蛋白質水解，而蛋白質水解所得的胺基酸均為α-胺基酸，所以在生化研究上 所稱的胺基酸，通常指α-胺基酸。表一列出常見的20種α-胺基酸。至於β及γ等胺基酸，則大都用於有機合成、石油化工、醫療等方面。
由於α-胺基酸具有不對稱的碳原子，所以胺基酸分子除了甘胺酸外均具有兩種相反旋光性的鏡像異構物，即D型和L型。一般而言，構成生物體的蛋白質或者胜肽，都是由L型的胺基酸所組成，但是也有例外，像是tyrocidine或者gramicidine等短桿菌肽都含有D型的胺基酸。
多胜肽蛋白質經過水解後之產物，具有單一胺基酸鏡像異構物及長短不一的短胜肽。可使用傳統的高效液相層析方法分離其中單一產物[5-7]，但無法完全分離得到所有產物。
為了獲知胺基酸序列，1984年Biemann[8-9]等人利用質譜數據來確認蛋白質胺基酸序列與DNA序列的關係，他們將蛋白質以胰蛋白酶(trypsin)水解酶降解成胜肽碎片，同時以高效液相層析儀(HPLC)將胜肽碎片混合物分離，並以快速原子碰撞游離法質譜儀(fast atom bombardment-mass spectrometry,FAB-MS)分析胜肽碎片質量，再以質譜數據與DNA序列所有可能比較對照，就可以確認蛋白質序列與DNA序列的關係。同時間，由Edman發展的一種多胜肽順序切割法所產生的愛德門序列儀(Edman sequencer)，已被廣泛應用在蛋白質的胺基酸序列定序[10-11]。Edman定序方法的缺點是，分析時間冗長，靈敏度不佳，難以分辨胺基酸鏡像體或異構物等。
參考文獻：[1] Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Robers, Peter Walter. Molecular biology of the cell, 4thed. Garland Science, New York.2002; [2] Laylin K.James,.Nobel Laureates in Chemistry 1901-199.: American Chemical Society; Chemical Heritage Foundation.Washington, DC,1993; [3] H.Muirhead, M.Perutz.” Structure of hemoglobin. Athree-dinsional fourier synthesis of reduced human hemoglobin at 5.5 A resolution,” Nature, 199(4894): 33-638.1963; [4] J.Kendrew, G.Bodo,H.Dintzis, R.Parrish, H.Wyckoff,D.Phillips. “Three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis”. Nature,181(4610): 662-666, 1958; [5] T. Ueno, M. Tanaka, T. Mastui,K. Mtasumoto.”Determination of antihypertensive small peptides, Val-Tyr and Ile-Val-Tyr, by fluorometric high-performance liquid chromatography combined with a double heart-cut column switching technique.” Analytical science,21, 997-1000, 2005; [6] M. Gilar,P. Olivova, A. E. Daly,J.C. Gebler. “Two-dimensional separation of peptides using RP-RP-HPLC system with different pH in first and second separation dimensions.”Journal of Separation Science 28, 1694-1703, 2005; [7] H. J. Issaq, K. C. Chan, J Blonder, X.Ye, T. D. Veenstra. “Separation,detection and quantitation of peptides by liquid chromatography and capillary electrochromatography.” Journal of Chromatography A,1216,1858-1837, 2009; [8] Chung, Deborah D. L..The Road to Scientific Success: Inspiring Life Stories of Prominent Researchers (Road to Scientific Success). World Scientific Publishing Company. 2006; [9] Gibson B.W. and Biemann K. “Strategy for the mass spectrometric verification and correction of the primary structures of proteins deduced from their DNA sequences.” Proceedings of the National Academy of Sciences. 81, 1956-1960, 1984; [10]M.Kai,＊, M. Morizono, M. N. Wainaina, T. Kabashima, “Chemiluminescence detection of amino acids using an Edman-typereagent, 4-(1_-cyanoisoindolyl) phenylisothiocyanate.” Analytica Chimica Acta 535, 153-159, 2005; [11] Niall HD. “Automated Edman degradation: the protein sequenator.” Meth. Enzymol. 1973,27: 942-1010.
本發明的目的之一在於提供一種快速有效的胜肽之胺基酸序列測定系統與方法，並可辨認胺基酸鏡像體或異構物。
本發明一實施例提供一種胜肽之胺基酸序列測定系統，可用於決定一蛋白質的胺基酸序列，該蛋白質被加熱水解成一水解液，其包含未水解的該蛋白質、構成該蛋白質的複數個胺基酸，以及由該些胺基酸所構成各種組合的短胜肽，該胺基酸序列測定系統包含一第一管柱、一第二管柱，以及一第三管柱。該第一管柱連接一紫外光偵測器，以分離與分析該些胺基酸與該些短胜肽。該第二管柱連接一螢光偵測器，以定性分析該些胺基酸。該第三管柱連接一質譜儀，以分析該些短胜肽，並獲得一質譜分子量訊號。其中，利用該定性分析所確認的該些胺基酸，由低分子量至高分子量的順序，排列組合成各種短胜肽，再比對該質譜分子量訊號，確認該短胜肽之胺基酸序列，繼續組合確認的短胜肽構成較大之各種胜肽，再比對質譜之分子量訊號，確認較大之胜肽的胺基酸序列，依此程序決定該蛋白質的整個胜肽鍊之胺基酸序列。
本發明另一實施例提供一種胺基酸序列的測定方法，包含下列順序步驟：(1)將一蛋白質加熱水解成一水解液，其包含未水解的該蛋白質，構成該蛋白質的複數個胺基酸，以及由該些胺基酸所構成各種組合的短胜肽；(2)分離該些胺基酸與該些短胜肽；(3)定性分析該些胺基酸；(4)以一質譜儀分析該些短胜肽，獲得一質譜分子量訊號結果；(5)以該些胺基的排列組合構成複數個雙胜肽，比對該質譜分子量訊號，確認該蛋白質存在的雙胜肽結構；(6)以該些確認存在的雙胜肽結構及確認的胺基酸做排列組合，構成複數個三胜肽，比對該質譜分子量訊號，確認是否有存在的三胜肽結構；(7)以確認存在的短胜肽(亦即雙胜肽、三胜肽等等)及確認的胺基酸做排列組合，構成分子量更大的至少多一胺基酸的胜肽，比對該質譜分子量訊號，確認是否有該胜肽存在，此步驟重複 進行，直到該質譜分子量訊號比對不存在，藉此可確認該蛋白質的可能胜肽鏈結構，再藉由比對質譜分子量訊號，確認該蛋白質的胺基酸序列。
10‧‧‧第一管柱
12‧‧‧第二管柱
14‧‧‧第三管柱
20‧‧‧第一偵測器
22‧‧‧第二偵測器
24‧‧‧第三偵測器
30‧‧‧轉換閥
32‧‧‧轉換閥
34‧‧‧轉換閥
40‧‧‧第一泵浦
42‧‧‧第二泵浦
44‧‧‧第三泵浦
46‧‧‧第四泵浦
48‧‧‧注射針筒
50‧‧‧第一移動相
52‧‧‧第二移動相
54‧‧‧第三移動相
56‧‧‧螢光衍生化試劑
58‧‧‧溶劑
60‧‧‧樣品注射閥
70‧‧‧螢光劑衍生化反應線圈
72‧‧‧樣品承載圈
圖1A至圖1F顯示根據本發明一實施例的胜肽鍊胺基酸序列測定系統與方法。
圖2顯示根據本發明一實施例的胜肽鍊胺基酸序列測定系統的第一管柱的層析圖譜。
圖3顯示根據本發明一實施例的胜肽鍊胺基酸序列測定系統的第二管柱的層析圖譜。
圖4顯示根據本發明一實施例的胜肽鍊胺基酸序列測定系統的第二管柱，分離24種胺基酸鏡像異構物的層析圖譜。
圖1A至圖1F顯示根據本發明實施例的一短胜肽之胺基酸序列測定系統與測定程序，此系統的主要元件有第一管柱10、第二管柱12、第三管柱14，第一偵測器20(紫外光偵測器20)、第二偵測器22(螢光偵測器22)，以及第三偵測器24(質譜儀24)。此外，其他元件包含：第一泵浦40、第二泵浦42、第三泵浦44、第四泵浦46、注射針筒48，這些元件分別用於運送或注射第一移動相50，第二移動相52、第三移動相54、螢光衍生化試劑56，以及溶劑58，至各個分析管柱、螢光劑衍生化反應線圈70、樣品承載圈72或偵測器。此外，偵測器20/22/24可連接電腦，以協助分析。
於本實施例，第一管柱10為親和掌性層析管柱(Astec ChiroBioticTM T,250mm×4.6mm I.D.，粒徑5μm)和ChiroBioticTM T保護管柱(30mm×4.6mm I.D.，粒徑5μm)，購自Supelco(Bellefonte,U.S.A)；第二管柱12為配位子交換層析管柱(Phenomenex Chirex 3126(D)-penicillamine,250mm×4.6mm I.D.，粒徑5μm)和Chirex 3126(D)-penicillamine保護管柱(30mm×4.6mm I.D.，粒徑5μm)，購自Phenomenex(Torrance,U.S.A)；第三管柱14為逆相層析管柱(Zorbax Eclipse XDB-C8,150mm×4.6mm I.D.，粒徑5μm)和Zorbax Eclipse XDB-C8保護管柱(12.5mm×4.6mm I.D.，粒徑5μm)，購自Agilent(Waldbronn,Germany)。
於本實施例，質譜儀24為裝配有電噴灑離子化介面(ESI)之離子阱質譜儀(Brucker Daltonics,Esquire 2000,Billerica,U.S.A)。
於本實施例，第一移動相50與第二移動相52為濃度2mM的CuSO4/MeOH溶液，體積比(v/v)為90/10；第三移動相54與溶劑58為100%甲醇(MeOH)。而螢光衍生化試劑56的製法如下。首先，取3.8138g的四硼酸鈉(Na2B4O7．10H2O)，倒入約900毫升(mL)的純水中，利用5mM氫氧化鈉(NaOH)調控其pH值至9.5，最後加入純水至體積1升即可配置好0.01M的硼酸緩衝溶液。接著，取鄰苯二甲醛(o-Phthaldialdehyde,OPA)2.146g置入上述緩衝溶液，再加入1mL的乙硫醇(C2H6S)，放置於恆溫震盪器(30℃,150rpm)一天，完成後的溶液即為螢光衍生化試劑56。螢光衍生化試劑56用於與胺基酸結合，以便螢光偵測器22分析。
根據本案實施例，待測蛋白質或短胜肽必須先進行熱水解反應，程序如下。利用微量吸量管將待測蛋白質或短胜肽取1mL，濃度為1000ppm的標準品儲備溶液置入特製的20井孔陣列式恆溫平台反應器之任一反應井孔中， 並設定所需的溫度加熱進行反應，反應時間一天至四天不等。反應結束後，以微量吸量管取出水解反應液，並且以純水稀釋其體積10倍後，再以針筒過濾頭過濾後，即可進行分析。
值得注意的是，上述熱水解程序的溫度，必須使待分析蛋白質或短胜肽「部分水解」，而不是「完全水解」。例如，待分析物是一個三胜肽，則經過水解後，產生未水解的三胜肽、兩種二胜肽、以及三種胺基酸。
以下說明本實施例短胜肽之胺基酸序列測定系統的測定程序。如圖1A所示，首先將分析樣品的熱水解反應液，由樣品注射閥60填裝注射至第一管柱10管柱，進行胺基酸與短胜肽之分離。接著，如圖1B所示，待胺基酸即將從第一管柱10流出時，切換轉換閥30使第一管柱10與第二管柱12成串聯狀態，使短胜肽熱水解產物中的胺基酸進入第二管柱12，進行胺基酸鏡像體的分離，並搭配螢光衍生化試劑(OPA)進行後管柱螢光衍生化反應，以螢光偵測器22進行胺基酸鏡像體偵測分析。接著，如圖1C所示，待胺基酸完全進入第二管柱12後，再轉動轉換閥30使其回到如圖1A的位置。接著，如圖1D所示，當短胜肽即將從第一管柱10被沖提出來時，便轉動轉換閥32，使短胜肽進入5mL樣品承載圈72內。接著，如圖1E所示，等到短胜肽完全填入樣品承載圈72後，同時轉動轉換閥32及轉換閥34，利用第三移動相54(100%甲醇)，使樣品承載圈72內的短胜肽分析物進入第三管柱14，以便進行分離短胜肽與銅離子，並使硫酸銅離子流洗至廢液瓶，以及釋放出自由短胜肽。此時，移動相變更為第三移動相，而第三管柱所分離的銅離子與硫酸根離子被流洗至廢液收集瓶。同時，第三管柱14並未連接至質譜儀24，可利用針筒式幫浦48不斷將甲醇58注入質譜儀24，避免質 譜儀24出現沒有溶劑的空窗期。接著，如圖1F所示，大約30秒後，轉動轉換閥34，使第三管柱14與質譜儀24串連，進行短胜肽的質譜分析。
胺基酸鏡像體以螢光偵測器22偵測，其激發波長為340nm，放射波長為450nm；而紫外光偵測器20偵測胺基酸與短胜肽的波長為254nm。質譜儀24分析使用電噴灑離子化(ESI)介面的離子阱質譜儀偵測，其霧化氣體(nebulizing gas)及乾燥氣體(drying gas)均為氮氣，霧化氣體壓力及乾燥氣體流速分別設定為20.0psi及5L min-1，乾燥氣體溫度為300℃；採用正離子模式進行質譜訊號偵測，毛細管入口端及出口端電壓、第一撇取器(skimmer 1)電壓、離子阱驅動電壓分別設定為4500、38.2、31.5及36.3V，其質荷比(m/z)範圍設定為50-1000。由於管柱的動態相流速(1mL min-1)，對於ESI介面來說太大，可以利用一流量分流器，控制進入質譜儀介面的流洗液流量。
本發明將蛋白質透過熱水解反應，分解成更小的短胜肽與胺基酸，並利用三維高效液相層析逐步分離，同時達成胺基酸鏡像體分離，與胜肽序列的定序。第一管柱10是用於分離短胜肽與胺基酸，第二管柱12是用於分離胺基酸的鏡像異構物，第三管柱14用於分離短胜肽與銅離子以及硫酸根離子，並轉換移動相(溶劑)，以質譜儀24分析短胜肽與半胱胺酸。
第一管柱10的選擇最為困難，這是因為短胜肽與胺基酸的結構、極性、分子大小，以及物性都很類似。在本實施例胺基酸序列測定系統，以四種分析管柱分離短胜肽標準品，這四種分析管柱為Eclipse XDB-C8、Juipter C4、chromolith® RP-18e、Astec ChiroBioticTM T管柱。在本實施例，待測定胺基酸序列的穀胱甘肽三胜肽，實驗結果發現，僅有Astec ChiroBioticTM T管柱能夠分離穀胱甘肽水解物的短胜肽與胺基酸。另外，必須在移動相中添加低濃度的銅離 子，以增加選擇性。圖2顯示本實施例第一管柱10於不同切換時間的層析圖譜，其中五個波峰分別為：波峰1，L-穀胺酸；波峰2，甘胺酸；波峰3，雙胜肽(Glu-Cys)；波峰4，雙胜肽(Cys-Gly)；波峰5，榖胱甘肽。另外，轉換閥30的第二次切換時間分別為A，0.0分鐘；B，10.5分鐘；C，10.6分鐘；D，10.7分鐘；E，10.8分鐘。
第二管柱12為Chirex 3126(D)-penicillamine管柱，分離原理是利用移動相中的銅離子與胺基酸鏡像體形成不同穩定度的複合物，並與管柱內填充的單一掌性胺基酸鏡像體進行胺基酸鏡像體配位子交換，藉此進行胺基酸鏡像體的分離。由實驗發現，隨著添加於移動相中甲醇比例的增加，分析時間會逐漸減少，但是胺基酸鏡像體分離效率也是逐漸變差，最後選擇添加10%的甲醇於移動相中。圖3顯示本實施例第二管柱12的層析圖譜，其中三個波峰分別為：波峰1，甘胺酸；波峰2，L-穀胺酸；波峰3，D-穀胺酸。
在本發明實施例的胺基酸序列測定系統中，如果管柱切換時間不恰當，樣品會流失，如此會降低分析靈敏度，或者導致定量分析的誤差，因此管柱的切換時間，必須被精確掌握。在本實施例，熱水解產物經由第一管柱10分離後，根據圖譜分析物的波峰位置與其滯留時間，設定數個不同的管柱切換時間，進行管柱切換。之後利用螢光偵測器22偵測得各胺基酸鏡像體或短胜肽的波峰面積後，以統計學中的單變因變異數分析法(One-way Analysis of Variance,ANOVA)，對不同切換時間所獲得的各胺基酸鏡像體或短胜肽波鋒面積變化做比較，然後以最小顯著差異測試(least significant test)判斷，選擇最佳切換時間。在本實施例，待測定物為穀胱甘肽三胜肽，經過一系列實驗並分析，決定轉換閥30的第一次切換時間為7.0分鐘，第二次切換時間為10.7分鐘。
接著，為檢視第二管柱12可分離的胺基酸鏡像體數量。以第二管柱12對20種常見胺基酸的D-及L-鏡像體進行等組成流動相沖提(isocratic elution)分離，其結果如表二所示。大部分胺基酸鏡像體分離的解析度都大於或接近1.0，顯示此管柱對於胺基酸鏡像體有良好的分離能力，而半胱胺酸(Cysteine)由於其支鏈硫醇(-SH)官能基易與銅離子反應形成沉澱，使得此管柱無法測得半胱胺酸。接著根據各個胺基酸鏡像體的分離滯留時間將其可完全分離開的胺基酸鏡像體進行整理分成3組。然後，由三組中選擇可完全分離開之胺基酸鏡像體，再以梯度沖提(gradient elution)的方式進行分離，縮短分離的時間，由所得之梯度沖提層析圖譜，繼續添加無波峰重疊之胺基酸鏡像體，繼續以同樣梯度沖提條件進行分離，層析圖譜如圖4所示，其顯示可同時分離24種胺基酸鏡像體，分別為：(1)L-Lys,(2)D-Lys,(3)D-Arg,(4)Gly,(5)L-Ala,(6)D-Ser,(7)D-Thr,(8)D-Gln,(9)L-Pro,(10)L-Val,(11)L-His,(12)D-Pro,(13)D-Val,(14)L-Met,(15)L-Asp,(16)L-Ile,(17)D-Asp,(18)L-Glu,(19)D-Glu,(20)D-Leu,(21)L-Phe,(22)D-Phe,(23)L-Trp,(24)D-Trp。
a滯留時間為重複測試四次之平均結果
b分析條件如下：管柱溫度：40℃，注射樣品體積：20μL，紫外光偵測器： 254nm，移動相流速：1mL min-1，移動相組成：MeOH/2mM CuSO4=10/90(v/v)。
接著，為了解螢光偵測器的偵測極限值，配置高濃度胺基酸鏡像體標準品溶液，再個別稀釋至六個濃度(0、0.25、0.5、1.0、2.5與5.0μg mL-1)。每一個濃度都重複測試5次，取其最小值製作檢量線，來決定偵測極限值。將20種胺基酸的D-及L-鏡像體分別製作檢量線，得到的偵測極限值大致落在0.1-0.2μg mL-1，優於一般文獻上使用紫外光偵測器的靈敏度約10倍，證明在第二管柱後，以螢光衍生化的方式搭配螢光偵測器，可提升對胺基酸鏡像體的偵測靈敏度。
為了瞭解短胜肽對三維高效液相層析線上結合電噴灑離子化質譜儀的靈敏度，本發明實施例製作由穀胺酸、半胱胺酸及甘胺酸鍵結成的還原型穀胱甘肽(Glutathione reduced form)三胜肽與其兩種水解二胜肽(Cys-Gly、γ-Glu-Cys)的外標準品檢量線，以最低5個濃度(0、1.0、2.5、5.0、7.5μg mL-1)所形成的檢量線計算出偵測極限值與定量極限值，每一個濃度標準品都重複偵測3次。測試結果，穀胱甘肽的偵測極限值與定量極限值分別為0.9與3.1μg mL-1；Cys-Gly分別為1.1與3.6μg mL-1；γ-Glu-Cys分別為0.9與3.1μg mL-1。
本發明實施例的胺基酸序列測定系統，以自行設計的20井孔陣列式恆溫平台反應器做為水解反應的平台，將待測樣品取一定量後選擇特定溫度進行熱水解反應，反應天數為1-4天不等。表三顯示穀胱甘肽在90℃下熱水解反應1至4天的定量結果。在本實施例，以水解一天的水解產物測定胺基酸序列。
在另一個實施例，待測定胺基酸序列的蛋白質為阿斯巴甜(Aspartame)，其為一種由天門冬胺酸及苯丙胺酸結合形成的雙胜肽，於90℃下熱水解1至4天的定量結果如表四所示。同樣，在本實施例，以水解一天的水解產物測定胺基酸序列。
先前以第二管柱12對水解產物中的胺基酸進行定性分析後，接著以電噴灑離子化質譜儀20測定水解產物中短胜肽產物的分子量。然後根據測得的胺基酸種類的排列組合，形成各種可能的短胜肽，這些可能的短胜肽的分子量再與質譜測得之短胜肽分子量資訊作分析比對，即可拼湊找出原來短胜肽的胺基酸序列，而分析過程可透過電腦程式進行。以下分別說明穀胱甘肽與阿斯巴甜的胺基酸測定序列程序。
穀胱甘肽(Glutathione reduced form)為一三胜肽化合物，由L-穀胺酸、L-半胱胺酸以及甘胺酸脫水縮合而成。首先，由第二管柱12的胺基酸定性分析中，了解穀胱甘肽擁有甘胺酸(Glycine)與穀胺酸(Glutamic acid)兩種胺基酸。由於第二管柱12無法偵測半胱胺酸(Cysteine)，因此必須從質譜訊號確認半胱胺酸存在與否。質譜訊號在正離子模式下有發現半胱胺酸的質荷比(m/z)122.1訊號，因此可確認胺基酸種類為三種：甘胺酸、穀胺酸與半胱胺酸。
接著，向上排列可能的雙胜肽種類組合。若以X、Y、Z分別代表穀胺酸(Glu)、半胱胺酸(Cys)、甘胺酸(Gly)，則可能形成的雙胜肽有XX、YY、ZZ、XY、YZ、XZ，表五列出雙胜肽水解產物的質譜訊號。經由質譜訊號比對，水解產物中的雙胜肽為XY(Glu-Cys,m/z=251.3)與YZ(Cys-Gly,m/z=179.2)。
接著，以XY與YZ組合可能的三胜肽，僅有一種可能，即XYZ(Glu-Cys-Gly,m/z=308.3)。接著，以XY與YZ組合可能的四胜肽，但發現此兩 種雙胜肽無法構成四胜肽。接著，五胜肽的排列種類為XYZXY、XYXYZ、XYZYZ與YZXYZ，是由雙胜肽與三胜肽隨機排列組合而成，但經由質譜訊號比對，皆無發現存在的訊號。最後可能的六胜肽為XYZXYZ，也無發現實際存在的質譜訊號，因此確定了此待測蛋白質為一種三胜肽。接著，列出所有可能的三胜肽序列，整理如表六所示。找出相對應的質譜碎片訊號去比對實際質譜圖譜，經由比對結果最有可能的兩種三胜肽結構如下：
但是經由比對表五的雙胜肽，發現只有1號序列的三胜肽符合，因此確立了此短胜肽的序列為Glu-Cys-Gly，而第一個胺基酸L-Glu是以γ碳上的羧酸基進行脫水縮合形成胜肽鍵。
在本發明另一個實施例，以同樣程序對阿斯巴甜進行定序。阿斯巴甜(Aspartame)為一雙胜肽化合物，於本實施例，水解後會分解形成L-天冬胺酸、L-苯丙胺酸、甲醇與未水解的雙胜肽。
首先，同樣地先由三維層析之配位子交換層析的胺基酸定性分析中，了解阿斯巴甜短胜肽擁有天門冬胺酸(aspartic acid)與苯丙胺酸(phenylalanine)兩種胺基酸，而經過質譜訊號的證實，在正離子模式下並未發現到半胱胺酸的質荷比(m/z)122.1的訊號，因此可確認胺基酸種類有二種：天門冬胺酸與苯丙胺酸。接著向上排列可能的雙胜肽種類組合；以X、Y分別代表天門冬胺酸(asp)與苯丙胺酸(phe)，所形成的雙胜肽種類分別是XX、YY與XY，同樣地經由質譜訊號比對，確認存在的雙胜肽種類為XY(Asp-Phe,m/z=280.3)，但發現到訊號強度異常的小，可能有其他主要訊號，原因為胜肽結構上常有其他修飾的取代基存在，此時只有依靠反覆試驗法(try-and-error method)嘗試一些常見的取代基，再去比對質譜訊號是否存在，是一項比較繁瑣的工作。測試結果符合質譜質荷比為雙胜肽上的羧酸基進行甲酯化反應，且找到苯丙胺酸上的羧酸基進行甲酯化反應後的碎片質譜訊號(m/z=180.3)，整理如表七，證明了阿斯巴甜的胺基酸序列為Asp-Phe-OCH3。
本發明成功開發一種三維液相層析線上結合電噴灑離子化質譜儀，來測定短胜肽鍊的胺基酸序列。所述原理可應用於測定任何蛋白質(多胜肽)的胜肽鍊胺基酸序列。
此三維系統分析胺基酸的螢光偵測器偵測極限值約在0.1-0.2μg mL-1，相對誤差值(RSD)約1.6-6.5%；而在分析短胜肽的質譜儀偵測極限值約在0.9-1.1μg mL-1，相對誤差值(RSD)約17.3-23.7%，顯示出良好的靈敏度與精確度。
本發明實施例的胺基酸序列測定程序，是一種「由小而大」的拼圖程序，即先確定胺基酸種類，再根據質譜分子量訊息確定存在的雙胜肽種類，繼續經由雙胜肽的種類，依序往上確定可能的三胜肽、四胜肽、五胜肽等等種類，直到未發現相對應的質譜訊號為止。由於胺基酸的鏡像體及同分異構物均 可由三維液相層析得知，故此定序方法的準確度可達百分之百。本發明的系統與方法不同於習知技術的「由大至小」分析程序，可不需要利用資料庫比對，程序可透過電腦協助分析，是一種快速有效的分析系統與方法。
以上所述僅為本發明之較佳實施例而已，並非用以限定本發明之申請專利範圍；凡其他未脫離發明所揭示之精神下所完成之等效改變或修飾，均應包含在下述之申請專利範圍內。
10‧‧‧第一管柱
12‧‧‧第二管柱
14‧‧‧第三管柱
20‧‧‧第一偵測器
22‧‧‧第二偵測器
24‧‧‧第三偵測器
30‧‧‧轉換閥
32‧‧‧轉換閥
34‧‧‧轉換閥
40‧‧‧第一泵浦
42‧‧‧第二泵浦
44‧‧‧第三泵浦
46‧‧‧第四泵浦
48‧‧‧注射針筒
50‧‧‧第一移動相
52‧‧‧第二移動相
54‧‧‧第三移動相
56‧‧‧螢光衍生化試劑
58‧‧‧溶劑
60‧‧‧樣品注射閥
70‧‧‧螢光劑衍生化反應線圈
72‧‧‧樣品承載圈

Claims (5)

  1. 一種胜肽的胺基酸序列測定系統，用於決定一蛋白質的胜肽鏈胺基酸序列，該蛋白質被加熱水解成一水解液，其包含未水解的該蛋白質、構成該蛋白質的複數個胺基酸與其鏡像異構物，以及由該些胺基酸所構成各種不同大小分子量組合的胜肽，該胜肽的胺基酸序列測定系統包含：一第一液相層析管柱，連接一紫外光偵測器，用於分離與分析該些胺基酸與該些胜肽，該第一液相層析管柱為親和掌性層析管柱，其移動相為硫酸銅/甲醇溶液；一第二液相層析管柱，連接一螢光偵測器，用於定性分析該些胺基酸，該第二液相層析管柱為配位子交換層析管柱，其移動相為硫酸銅/甲醇溶液；一第三液相層析管柱，連接一質譜儀，用於分析該些胜肽，以獲得一質譜訊號結果，該第三管柱為逆相層析管柱，其移動相為100%甲醇；該質譜儀為裝配有電噴灑離子化介面(ESI)之離子阱質譜儀，該第一液相層析管柱、該第二液相層析管柱，以及該第三液相層析管柱是透過一第一管柱轉換閥以及一第二管柱轉換閥以並聯的方式連接，使得該第一液相層析管柱、該第二液相層析管柱與該第三液相層析管柱於連接之初始狀態可分別獨立操作；該第一管柱轉換閥接收來自被該第一液相層析管柱所分離的該水解液，可被切換以串聯該第一液相層析管柱與該第二液相層析管柱，使得該第一液相層析管柱所分離的該些胺基酸與其鏡像異構物流入該第二液相層析管柱進行分析；當該些胺基酸與其鏡像異構物流入該第二液相層析管柱後，該第一液相層析管柱轉換閥被切換回原先狀態；該第二管柱轉換閥具有一樣品取樣承載圈，當該水解液中由該些胺基酸所構成各種不同大小分子量組合的胜肽流出該第一液相 層析管柱，該第二液相層析管柱轉換閥被切換，使得該水解液中由該些胺基酸所構成各種不同大小分子量組合的胜肽流入該樣品取樣承載圈；一第三管柱轉換閥連接該第三液相層析管柱，該第二管柱轉換閥與該第三管柱轉換閥同時被切換，使得樣品取樣承載圈中的由該些胺基酸所構成各種不同大小分子量組合的胜肽流入第三液相層析管柱，以分離由該些胺基酸所構成各種組合的胜肽以及該第一液相層析管柱與該第二液相層析管柱中移動相的銅離子，該些銅離子流入一廢棄收集器；一注射針筒，當該些銅離子流入該廢棄收集器時，持續注入一溶劑給該質譜儀一段時間，當該些銅離子被完全排出該第三液相層析管柱，該第三管柱轉換閥被切換，使得該第三液相層析管柱與該質譜儀串聯，且該些胺基酸所構成各種不同大小分子量組合的胜肽流入該質譜儀以進行分析；一電腦，分別連接該紫外光偵測器、該螢光偵測器、該質譜儀，並執行下列步驟：根據該第二液相層析管柱定性分析所確認的該些胺基酸的分子量，配合質譜儀獲得的各種不同大小分子量組合的胜肽分子量及其胺基酸序列之C端胺基酸訊息，依低分子量至高分子量的順序，排列組合成各種不同大小分子量組合的胜肽，再與該質譜獲得的各種不同大小分子量組合的胜肽分子量訊號及其胺基酸序列之C端胺基酸訊息結果比對，由小胜肽胺基酸序列至大胜肽胺基酸序列，拼湊決定該蛋白質的胜肽鏈胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項的胺基酸序列測定系統，其中硫酸銅與甲醇的體積比(v/v)為90/10。
  3. 一種蛋白質的胜肽鏈胺基酸序列的測定方法，包含下列順序步驟： (1)將一蛋白質或短胜肽加熱水解成一水解液，其包含未水解的該蛋白質或短胜肽，該蛋白質或短胜肽水解產生的複數個更短的胜肽，以及構成該蛋白質或短胜肽的複數個胺基酸；(2)以液相層析管柱分離該些胺基酸與該些胜肽；(3)以偵測器分析該些胺基酸，確認該些胺基酸為何；(4)以一質譜儀分析該些胜肽及半胱胺酸，獲得一質譜訊號結果；(5)以該些確認的胺基酸的排列組合構成複數個雙胜肽，比對該質譜訊號結果，確認該蛋白質或短胜肽存在的雙胜肽結構；(6)以該些確認存在的雙胜肽結構做排列組合，構成複數個三胜肽，比對該質譜訊號結果，確認是否有存在的三胜肽結構；(7)以確認存在的短胜肽(亦即雙胜肽、三胜肽等等)進行排列組合，構成分子量更大的至少多一胺基酸殘基的胜肽，比對該質譜訊號結果，確認是否有該胜肽存在，此步驟重複進行，直到該質譜訊號比對不存在，藉此可確認該蛋白質或短胜肽的可能結構，再藉由比對質譜訊號，確認該蛋白質或短胜肽的胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第3項的蛋白質的胜肽鏈胺基酸序列測定方法，其中該質譜儀為裝配有電噴灑離子化介面(ESI)之離子阱質譜儀。
  5. 如申請專利範圍第3項的蛋白質的胜肽鏈胺基酸序列測定方法，其中該定性分析包含確認該些胺基酸的鏡像異構物與同分異構物。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100284918A1 (en) * 2007-10-03 2010-11-11 Christian Rohlff Protein

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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C. Cheng and S. C. Wu, "Simultaneous analysis of aspartame and its hydrolysis products of Coca-Cola Zero by on-line postcolumn derivation fluorescence detection and ultraviolet detection coupled two-dimensional high-performance liquid chromatography.", J Chromatogr A., 2011, Vol. 1218, No. 20, p.2976~2983. D. F. Hunt et al., "Protein sequencing by tandem mass spectrometry", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1986, Vol. 83, p.6233~6237. C. L. Gatlin et al., "Automated Identification of Amino Acid Sequence Variations in Proteins by HPLC/Microspray Tandem Mass Spectrometry", Anal. Chem., 2000, Vol. 72, No. 4, p.757~763. D. N. Perkins et al., "Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data", Electrophoresis, 1999, Vol. 20, p.3551~3567. *

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